Name: Précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez une méthode de précipitation protéique par solvants pour purifier efficacement les échantillons protéomiques avant analyse par spectrométrie de masse. Ce protocole rapide assure un rendement élevé et une pureté constante.

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Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. Les auteurs remercient Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) et SPARC BioCentre (Molecular Analysis) de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) pour leur contribution à l’acquisition de données sur la SP.

1. Considérations matérielles et pré-préparation de l’échantillon
<ol><li>Utilisez uniquement des solvants de haute pureté (acétone, chloroforme, méthanol) (>99,5%) et des produits chimiques, exempts d’excès d’humidité.</li>
	<li>Préparer des solutions de chlorure de sodium et de sulfate de zinc (1 M) dans l’eau. REMARQUE: Les solutions salines peuvent être stockées indéfiniment à température ambiante, à condition qu’elles soient exemptes de contaminants ou de croissance microbienne.</li>
	<li>Utilisez le plus petit flacon de microcentrifugeuse en polypropylène (PP) suffisant pour retenir le volume requis d’échantillon et de solvants pour induire la précipitation.</li>
	<li>S’assurer que la concentration de FDS dans l’échantillon à précipiter n’est pas supérieure à 2 % (p/v). Si la FDS est plus élevée, diluer l’échantillon avec de l’eau.</li>
	<li>Assurer une concentration en protéines comprise entre 0,01 et 10 g/L pour une efficacité optimale des précipitations. REMARQUE: La masse optimale pour les précipitations varie entre 1 et 100 μg de protéines.</li>
	<li>Assurez-vous que tous les solvants et solutions sont exempts de particules avant utilisation. Effectuer une filtration (<0,5 μm) ou une étape de centrifugation (10 000 x g pendant 1 min à température ambiante) pour éliminer les particules non dissoutes.</li>
	<li>Si une réduction de la liaison disulfure et une alkylation sont nécessaires, effectuez ces étapes avant la précipitation des protéines. L’excès de réactifs réducteurs et alkylants sera éliminé par le processus de précipitation.</li>
	<li>Précipitez les protéines en sélectionnant et en exécutant l’un des protocoles (étapes 2, 3, 4 ou 5).</li>
</ol>2. Précipitation rapide des protéines (à base de flacon) avec de l’acétone
<ol><li>Pipeter 90 μL de solution de protéines ou de protéomes (sans particules) dans un tube de microcentrifugation pp. Ensuite, ajoutez 10 μL de NaCl aqueux 1 M. REMARQUE: Si la force ionique de l’extrait de protéome dépasse déjà 100 mM, aucun sel supplémentaire n’est nécessaire.</li>
	<li>Pipeter 400 μL d’acétone dans l’échantillon. Boucher le flacon et tapoter doucement le flacon pour combiner les solvants. Un mélange vigoureux n’est pas nécessaire. REMARQUE: Le volume de protéines, de sel et d’acétone peut être augmenté tant que le rapport relatif de chacun est maintenu.</li>
	<li>Laisser le flacon incuber à température ambiante, sans être dérangé, pendant au moins 2 min. REMARQUE : Des incubations plus longues, y compris celles à température réduite (p. ex., la précipitation conventionnelle d’acétone utilise des précipitations nocturnes dans le congélateur), peuvent entraîner la formation de particules protéiques agrégées plus grandes (visibles) (figure 1A), qui n’améliorent généralement pas la récupération totale des protéines.</li>
	<li>Après l’incubation, placer les échantillons dans une centrifugeuse en notant l’orientation du flacon. Tourner pendant au moins 2 min, à 10 000 x g ou plus à température ambiante.</li>
	<li>Décapsulez le flacon et décantez doucement le surnageant en inversant lentement le flacon dans un conteneur à déchets. Touchez le flacon inversé à une serviette en papier pour extraire le solvant résiduel du flacon. ATTENTION : Les solvants résiduaires doivent être conservés et jetés conformément aux protocoles appropriés.</li>
	<li>Pour les échantillons contenant des FDS, distribuer 400 μL d’acétone fraîche en veillant à ne pas déranger la pastille. REMARQUE: L’étape 2.6 est facultative.<ol><li>Centrifuger immédiatement l’échantillon (10 000 x g ou plus pendant 1 min à température ambiante), en plaçant le flacon dans le rotor dans la même orientation que le spin initial. Décantez le solvant de lavage comme décrit à l’étape 2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Laisser sécher complètement l’échantillon avec le bouchon ouvert (~1 min). Récapitulez le flacon et procédez à la solubilisation des granulés (étape 6).</li>
</ol>3. Précipitation de peptides de faible poids moléculaire (LMW) (ZnSO4 + acétone)
<ol><li>Distribuer 54 μL d’extrait de protéome dans un flacon de PP de 2 mL, puis ajouter 6 μL de 1 M ZnSO4. REMARQUE: La récupération optimale des peptides LMW (≤5 kDa) est obtenue en ajoutant de l’acétone à un final 97% en volume. En supposant un flacon de PP de 2 mL, le volume initial maximal de l’échantillon est de 54 μL.</li>
	<li>Ajouter 1940 μL d’acétone à un dernier 97% en volume. Tourbillonner doucement pour mélanger, et laisser reposer sans être dérangé sur la paillasse pendant au moins 2 min.</li>
	<li>Centrifuger (10 000 x g pendant 1 min à température ambiante) et retirer le surnageant en inversant le flacon, puis en touchant le flacon à une serviette en papier.</li>
	<li>Pour les échantillons contenant des FDS, distribuer 400 μL d’acétone fraîche en veillant à ne pas déranger la pastille. REMARQUE: L’étape 3.4 est facultative.<ol><li>Centrifugez immédiatement l’échantillon conformément à l’étape 3.3, en plaçant le flacon dans le rotor dans la même orientation que le spin initial. Décantez le solvant de lavage comme décrit à l’étape 3.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Re-solubiliser la pastille sèche résultante dans un solvant aqueux avec un bref vortex ou sonication (~5 min).</li>
</ol>4. Précipitation des protéines par chloroforme/méthanol/eau (CMW)
<ol><li>Distribuer 100 μL de la solution de protéine ou de protéome dans un flacon de PP. Ajouter 400 μL de méthanol, suivi de 100 μL de chloroforme. Boucher le flacon et vortex brièvement pour mélanger. REMARQUE : Pour les précipitations CMW, on préfère les flacons de 1,5 mL à fond étroit (figure 2A). ATTENTION : Le solvant chloroforme doit être manipulé dans une hotte de ventilation appropriée. Tous les solvants qui entrent en contact avec le chloroforme doivent être traités comme des déchets halogénés lorsqu’ils sont éliminés.</li>
	<li>Distribuer rapidement 300 μL d’eau directement au centre du flacon. Coiffer le flacon. Laissez l’échantillon reposer sur la paillasse sans être dérangé pendant 1 min. REMARQUE: La solution apparaîtra immédiatement blanc trouble. Évitez de mélanger le flacon après l’ajout d’eau.</li>
	<li>Placer le flacon de PP dans une centrifugeuse et tourner pendant au moins 5 min (10 000 x g ou plus à température ambiante). REMARQUE: Une fois centrifugés, deux couches de solvant visibles se formeront (couche supérieure = méthanol / eau; fond = chloroforme). Une pastille de protéine solide se forme à l’interface du solvant (Figure 2A).</li>
	<li>À l’aide d’une grande pointe de micropipette (1 mL) et en maintenant le flacon à ~45°, retirez ~700 μL du solvant de la couche supérieure à une vitesse uniforme.</li>
	<li>Utilisez une micropipette plus petite (200 μL) pour continuer à retirer la couche supérieure de solvant du flacon incliné d’environ 45 °. Pipet en un mouvement continu jusqu’à ce que la couche supérieure de solvant forme une perle dans le flacon.</li>
	<li>Ajouter 400 μL de méthanol frais au flacon d’échantillon, sans perturber la pastille, en distribuant le solvant sur le côté du flacon.</li>
	<li>Coiffer le flacon. Combinez les couches de solvant en berçant doucement le flacon pour faire tourbillonner les solvants ensemble. REMARQUE: Il est essentiel d’éviter de perturber le granulé. Ne pas vortexer le flacon.</li>
	<li>En notant l’orientation du flacon dans le rotor, centrifuger pendant au moins 10 min (10 000 x g à température ambiante). La pastille de protéine adhère au fond du flacon (figure 2B).</li>
	<li>Basculez le flacon à 45°, avec la pastille vers le bas. Placez l’embout de la pipette le long du bord supérieur du flacon et retirez le surnageant avec une pointe de micropipette de 1 mL à un rythme lent mais continu. Conserver ~20 μL de solvant dans le flacon.</li>
	<li>Lavez la pastille de protéine pour les échantillons contenant des FDS en distribuant lentement 400 μL de méthanol frais. Ne pas vortexer le flacon.<ol><li>Procéder directement à la centrifugation (10 000 x g pendant 2 min à température), en plaçant le flacon dans le rotor avec la même orientation que le spin initial.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirez le solvant, conformément à l’étape 4.9. Laisser sécher l’échantillon à l’air libre dans une fumière jusqu’à ce que le solvant résiduel s’évapore.</li>
	<li>Consultez les procédures de résolution recommandées à l’étape 6.</li>
</ol>5. Précipitation des protéines à l’aide d’une cartouche de filtration jetable
REMARQUE: Chaque protocole de précipitation à base de solvant décrit aux étapes 2 à 5 peut être effectué dans une cartouche de filtration et d’extraction en deux étapes (voir tableau des matériaux).
<ol><li>Une fois le bouchon fixé à la cartouche de filtration supérieure (Figure 3A), distribuez le volume souhaité du protéome, du sel et du solvant extraits, comme indiqué dans l’une des trois options ci-dessous.<ol><li>(Option 1) Pour la précipitation des protéines avec l’acétone, combiner 90 μL de solution de protéine ou de protéome, 10 μL de NaCl aqueux de 1 M et 400 μL d’acétone. Incuber pendant un minimum de 2 min sur la paillasse. REMARQUE : Un précipité visible se développera pour les échantillons de protéines concentrées (1 g/L) (figure 3B).</li>
		<li>(Option 2) Pour la précipitation peptidique LMW, combiner 15 μL de l’échantillon, 1,5 μL de 1 M ZnSO4 et 485 μL d’acétone. Incuber pendant un minimum de 2 min sur la paillasse. REMARQUE : Une concentration de sel de 90 mM dans l’échantillon aqueux n’aura pas d’incidence sur la récupération par rapport aux 100 mM recommandés à l’étape 3.</li>
		<li>(Option 3) Pour la précipitation CMW, ajouter 50 μL d’extrait de protéome, 200 μL de méthanol et 50 μL de chloroforme. Boucher le flacon et vortex brièvement pour combiner.<ol><li>Distribuer rapidement 150 μL d’eau directement au centre du flacon. Incuber pendant 1 min sur la paillasse.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Centrifuger pendant 2 min à 2 500 x g à température ambiante avec le bouchon toujours attaché à la cartouche de filtration.</li>
	<li>Inversez la cartouche, puis dévissez et retirez la fiche de la base de la cartouche.</li>
	<li>Placez la cartouche de filtration dans un flacon propre et retournez à la centrifugeuse. Tourner pendant 3 min à 500 x g à température ambiante. Jetez le solvant d’écoulement du flacon inférieur. REMARQUE: S’il reste un solvant dans la cartouche de filtration supérieure, retournez à la centrifugeuse et effectuez un tour supplémentaire.</li>
	<li>Lavez la pastille de protéine en ajoutant 400 μL d’acétone à la cartouche de filtration (pour la précipitation CMW, étape 5.1.3, ajouter 400 μL de méthanol).</li>
	<li>Centrifuger pendant 3 min à 500 x g à température ambiante ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solvant dans la cartouche supérieure.</li>
	<li>Re-solubiliser la pastille de précipitation comme décrit à l’étape 6.</li>
</ol>6. Resolubilisation des granulés de protéines
<ol><li>Mouiller la membrane à la base de la cartouche de filtration en distribuant 2 à 5 μL d’isopropanol directement sur la membrane immédiatement avant les protocoles de résolution décrits ci-dessous.</li>
	<li>Suivez l’une des méthodes de résolution suivantes.<ol><li>(Option 1) Ajouter un minimum de 20 μL de tampon aqueux contenant ≥2 % de FDS à la cartouche de filtration. Capuchon et vortex vigoureusement (~1 min). Alternativement, sonicate (>10 min) pour disperser la pastille de protéine.<ol><li>Chauffer l’échantillon à 95 °C pendant 5 min). Répétez l’étape de mélange après le chauffage. REMARQUE: Le tampon de chargement du gel Laemmli peut re-solubiliser la pastille de protéine. Cependant, les échantillons contenant des FDS sont incompatibles avec la digestion de la trypsine et la LC et la SEP en phase inversée.</li>
		</ol></li>
		<li>(Option 2) Préparer une solution d’acide formique à 80% (v/v) dans l’eau. Précérez la solution acide (-20 °C), ainsi que la cartouche de filtration contenant des protéines précipitées.<ol><li>Distribuer 50 μL d’acide formique froid dans la cartouche; bouchon et vortex pendant 30 s. Remettre au congélateur (-20 °C) pendant 10 min.</li>
			<li>Vortex la cartouche à nouveau pendant 30 s. Ensuite, répétez le cycle de refroidissement et de mélange une fois de plus (10 min, -20 °C, 30 s de vortex).</li>
			<li>Ajouter de l’eau à un dernier 500 μL, en diluant l’acide formique à 8%. REMARQUE: Le protocole d’acide formique froid est incompatible avec la digestion ultérieure de la trypsine, mais est compatible avec LC-MS.</li>
		</ol></li>
		<li>(Option 3) Ajouter 50 μL d’urée fraîchement préparée de 8 M dans de l’eau à la cartouche de filtration. Sonicate pendant 30 min.<ol><li>Laisser la cartouche incuber sur la paillasse pendant 1 h (jusqu’à la nuit).</li>
			<li>Diluer l’urée de 8 M au moins 5 fois avec de l’eau ou un tampon approprié. REMARQUE: Une fois dilué, le protocole de solubilisation de l’urée est compatible avec la digestion ultérieure de la trypsine, ainsi qu’avec la LC-MS.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Digestion des protéines
<ol><li>Pour l’analyse ascendante de la SEP, soumettez les protéines relufulisées à une digestion enzymatique en utilisant l’une des deux méthodes mentionnées ci-dessous.<ol><li>(Option 1) Pour laolubilisation de l’acide formique, réduire le volume initial d’acide formique à 80 % à l’étape 6.2.2.1 à 25 μL. À l’étape 6.2.2.3, utiliser 375 μL d’eau pour diluer l’acide formique à 5 % (v/v).</li>
		<li>Distribuer la pepsine dans la cartouche à un rapport protéine/enzyme approximatif de 50:1. Avec un bouchon fixé à la cartouche de filtration, incuber l’échantillon pendant la nuit à température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>(Option 2) Pour la resolubilisation dans l’urée, assurer un pH compris entre 8 et 8,3 avec l’inclusion de 100 mM de Tris ou de bicarbonate d’ammonium à l’étape 6.2.3.2.<ol><li>Ajouter la trypsine à un rapport approximatif de la masse protéique à l’enzyme de 50: 1. Avec un bouchon attaché à la cartouche, incuber l’échantillon pendant la nuit dans un bain d’eau tiède à 37 °C.</li>
		<li>Terminez la digestion en acidifiant la solution avec 10% de TFA jusqu’à un final 1%.</li>
	</ol></li>
	<li>Récupérez la protéine digérée à la pepsine ou à la trypsine en retirant le bouchon de la base du filtre et en centrifugant la cartouche contenue dans un flacon propre (2 min, 5000 x g, température ambiante).</li>
</ol>8. Nettoyage spe
REMARQUE: Pour le dessalement supplémentaire de l’échantillon après la digestion ou l’échange de solvant, l’échantillon peut être soumis à un nettoyage en phase inversée comme décrit.
<ol><li>Amorcer une cartouche SPE (voir tableau des matériaux) en passant 300 μL de méthanol (2 min, 400 x g) suivi de 300 μL d’acétonitrile à 5 % / 0,1 % de TFA (2 min, 400 x g).</li>
	<li>Connectez la cartouche SPE apprêtée à la base de la cartouche de filtration contenant des protéines relubrisées ou digérées.</li>
	<li>Faites tourner la protéine à travers la cartouche SPE (5 min, 800 x g à température ambiante). Si le solvant reste dans la cartouche supérieure, retournez la cartouche à la centrifugeuse et répétez la rotation. REMARQUE: Passer l’échantillon à travers la cartouche SPE une deuxième fois peut améliorer la récupération.</li>
	<li>Ajouter 300 μL d’acétonitrile à 5 % / 0,1 % de TFA dans l’eau à la cartouche. Pour laver, faire couler à travers la cartouche SPE (2 min, 2000 x g). Jetez le flux.</li>
	<li>Pour les protéines LMW ou les peptides digérés, éluer l’échantillon en faisant couler 300 μL d’acétonitrile à 50 % / 0,1 % de TFA (5 min, 2500 x g).</li>
	<li>Pour les protéines intactes, suivez l’étape 8.5 avec une étape d’élution supplémentaire en utilisant 300 μL d’acétonitrile à 75 % / 0,1 % de TFA. Combinez les deux extraits résultants. REMARQUE: L’étape 8.6 est facultative.</li>
</ol>

Le laboratoire Doucette a conçu et breveté le ProTrap XG utilisé dans cette étude. AAD est également un partenaire fondateur de Proteoform Scientific, qui a commercialisé la cartouche de préparation d’échantillons.

La caractérisation optimale de la SEP est obtenue lorsque la FDS résiduelle est épuisée en dessous de 10 ppm. Alors que d’autres approches, telles que le FASP et la digestion sur billes, offrent un épuisement quantitatif des FDS avec une récupération variable 31,32,33, l’objectif principal des précipitations est de maximiser la pureté et le rendement simultanément. Cela dépend de l’isolation efficace du surnageant (contenant la ...

L’analyse du protéome par spectrométrie de masse est devenue de plus en plus rigoureuse, en raison de la sensibilité, de la résolution, de la vitesse de balayage et de la polyvalence accrues des instruments MS modernes. Les progrès de la SEP contribuent à une plus grande efficacité d’identification des protéines et à une quantification plus précise 1,2,3,4,5. Grâce à l’amélioration de l’instrumentation de la SEP, les chercheurs exigent une stratégie de préparation d’échantillons front-end cohérente capable de récupérer quantitativement des protéines de haute pureté en un minimum de temps à toutes les étapes du flux de travail 6,7,8,9,10,11 . Pour refléter avec précision l’état protéomique d’un système biologique, les protéines doivent être isolées de la matrice de l’échantillon natif de manière efficace et impartiale. À cette fin, l’inclusion d’un tensioactif dénaturant, tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS), assure une extraction et une solubilisation efficaces des protéines12. Cependant, les FDS interfèrent fortement avec l’ionisation par électropulvérisation, provoquant une suppression sévère du signal MS si elle n’est pas correctement éliminée13.
Diverses stratégies d’épuisement des FDS sont disponibles pour une analyse ultérieure du protéome, telles que la rétention de protéines au-dessus d’un filtre de coupure de poids moléculaire contenu dans des cartouches de spin jetables 14,15,16. La méthode de préparation d’échantillons assistée par filtre (FASP) est privilégiée car elle épuise efficacement les FDS en dessous de 10 ppm, facilitant ainsi une SEP optimale. Cependant, la récupération des protéines avec LE FASP est variable, ce qui a incité à l’exploration d’autres techniques. Les approches chromatographiques qui capturent sélectivement les protéines (ou tensioactifs) ont évolué en diverses cartouches pratiques ou formats à base de billes 17,18,19,20,21. Compte tenu de ces stratégies simples et (idéalement) cohérentes de purification des protéines, l’approche classique de la précipitation des protéines avec des solvants organiques est souvent négligée comme une approche prometteuse de l’isolement des protéines. Bien qu’il soit démontré que la précipitation des solvants épuise les FDS en dessous des niveaux critiques avec succès, la récupération des protéines est une préoccupation de longue date de cette approche. Plusieurs groupes ont observé un biais de récupération des protéines, avec des rendements de précipitations inacceptablement bas en fonction de la concentration en protéines, du poids moléculaire et de l’hydrophobicité22,23. En raison de la diversité des protocoles de précipitations rapportés dans la littérature, des conditions de précipitations normalisées ont été élaborées. En 2013, Crowell et al. ont signalé pour la première fois la dépendance de la force ionique à l’efficacité des précipitations des protéines dans 80% d’acétone24. Pour toutes les protéines examinées, l’ajout de chlorure de sodium jusqu’à 30 mM s’est avéré essentiel pour maximiser les rendements (jusqu’à 100 % de récupération). Plus récemment, Nickerson et al. ont montré que la combinaison d’une force ionique encore plus élevée (jusqu’à 100 mM) avec une température élevée (20 ° C) pendant les précipitations d’acétone donnait une récupération presque quantitative en 2-5 min25. Une légère baisse de la récupération des protéines de faible poids moléculaire (LMW) a été observée. Par conséquent, un rapport ultérieur de Baghalabadi et al. a démontré la récupération réussie des protéines et des peptides LMW (≤5 kDa) en combinant des sels spécifiques, en particulier le sulfate de zinc, avec un niveau plus élevé de solvant organique (97% d’acétone)26.
Bien que l’affinement du protocole de précipitation confère une stratégie de purification des protéines plus fiable pour la protéomique basée sur la SEP, le succès des précipitations conventionnelles repose fortement sur la technique de l’utilisateur. L’un des principaux objectifs de ces travaux est de présenter une stratégie de précipitation robuste qui facilite l’isolement de la pastille de protéine du surnageant contaminant. Une cartouche de filtration jetable a été développée pour éliminer le pipetage en isolant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane poreuse en PTFE27. Les composants interférants de la SEP dans le surnageant sont efficacement éliminés lors d’une étape de centrifugation courte et à basse vitesse. La cartouche filtrante jetable offre également une cartouche SPE interchangeable, qui facilite le nettoyage ultérieur des échantillons après laolubilisation et la digestion facultative des protéines, avant la spectrométrie de masse.
Une série de flux de travail recommandés pour la précipitation du protéome sont présentés ici, y compris les protocoles modifiés acétone et chloroforme/méthanol/eau28 , dans un format conventionnel (à base de flacons) et semi-automatisé dans une cartouche de filtration et d’extraction jetable à deux états. Les récupérations de protéines et l’efficacité de l’épuisement des FDS qui en résultent sont mises en évidence, ainsi que la couverture ascendante du protéome LC-MS/MS, afin de démontrer le résultat attendu de chaque protocole. Les avantages et les inconvénients pratiques associés à chaque approche sont discutés.

<table><tbody><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC177170010</td><td>&le ; 0,002 % d’aldéhyde</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>Qualité HPLC</td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6141-1KG</td><td>solide</td></tr><tr><td>Bêta mercaptoéthanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>Grade en biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Millipore Sigma</td><td>B8026-5G</td><td>Bromophénol sel bleu de sodium</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-400</td><td>Chloroforme</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Additif éluent pour LC-MS</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse à fusion Lumos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>pour l’analyse d’un mélange protéique standard</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Millipore Sigma</td><td>356352-1L-M</td><td>Pour la biologie moléculaire, > 99 %</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4641</td><td>Qualité HPLC</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td>Qualité HPLC</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-400-102</td><td>jusqu’à 21 000 XG</td></tr><tr><td>Tube microcentrifuge (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>Fond effilé</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifuge & nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td>Fond arrondi</td></tr><tr><td>Conseils de micropipette &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (0.1-10 &mu ; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-197-28</td><td>Pointe universelle de pipette, non stérile</td></tr><tr><td>Conseils de micropipette &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (1-200 &mu ; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-302</td><td>Pointe universelle de pipette, non stérile</td></tr><tr><td>Conseils de micropipette &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; (200-1000 & mu ; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-303</td><td>Pointe universelle de pipette, non stérile</td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-710-903</td><td>Pack Trio de micropipettes</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0525000</td><td>Poudre lyophilisée, &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; >3200 unités/mg</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>Protooform Scientific</td><td>PXG-0002</td><td>50 unités complètes par boîte</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td>Réactif ACS, >99 %</td></tr><tr><td>Dodécyle sulfate de sodium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28312</td><td>Solide en poudre</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse timsTOF Pro</td><td>Bruker</td><td></td><td>pour l’analyse de l’extrait de protéome hépatique</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L06374. AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Grade en biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-7</td><td>À partir du pancréas bovin, traité par TPCK</td></tr><tr><td>Urée</td><td>Bio-Rad</td><td>1610731</td><td>solide</td></tr><tr><td>Eau (déionisée)</td><td>Système de purification d’eau mini Sartorius Arium</td><td>76307-662</td><td>Type 1 ultrapure (18,2 M&Omega ; cm)</td></tr><tr><td>Zinc Sulfate</td><td>Millipore Sigma</td><td>307491-100G</td><td>solide</td></tr></tbody></table>

précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Bien que les multiples progrès réalisés dans les instruments de spectrométrie de masse (SEP) aient amélioré l’analyse qualitative et quantitative du protéome, des approches frontales plus fiables pour isoler, enrichir et traiter les protéines avant la SEP sont essentielles à la caractérisation réussie du protéome. Une récupération faible et incohérente des protéines et des impuretés résiduelles telles que les tensioactifs nuisent à l’analyse de la SEP. La précipitation des protéines est souvent considérée comme peu fiable, longue et techniquement difficile à effectuer par rapport à d’autres stratégies de préparation d’échantillons. Ces préoccupations sont surmontées en utilisant des protocoles optimaux de précipitation des protéines. Pour la précipitation de l’acétone, la combinaison de sels spécifiques, le contrôle de la température, la composition du solvant et le temps de précipitation sont essentiels, tandis que l’efficacité de la précipitation du chloroforme / méthanol / eau dépend d’un pipetage et d’une manipulation du flacon appropriés. Alternativement, ces protocoles de précipitation sont rationalisés et semi-automatisés dans une cartouche de rotation jetable. Les résultats attendus de la précipitation des protéines à base de solvant dans le format conventionnel et de l’utilisation d’une cartouche de filtration et d’extraction jetable en deux étapes sont illustrés dans ce travail. Cela comprend la caractérisation détaillée des mélanges protéomiques par analyse ascendante LC-MS/MS. Les performances supérieures des flux de travail basés sur les FDS sont également démontrées par rapport aux protéines non contaminées.

La figure 4 résume l’épuisement prévu des FDS à la suite d’une précipitation de protéines à base de flacon ou facilitée par une cartouche dans une cartouche filtrante jetable utilisant de l’acétone. L’incubation nocturne conventionnelle (-20 °C) dans l’acétone est comparée au protocole de précipitation rapide de l’acétone à température ambiante (étape 2), ainsi qu’aux précipitations CMW (étape 4). La FDS résiduelle a été quantifiée par le dosage des substances actives au bleu de méthylène (M...

Le présent protocole décrit la précipitation protéique à base de solvant dans des conditions contrôlées pour une récupération et une purification robustes et rapides des échantillons de protéome avant la spectrométrie de masse.

Précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Ces protocoles sont conçus pour maximiser la récupération ainsi que la pureté des protéines grâce à la précipitation à base de solvants. Nous allons vous montrer quelques astuces pour effectuer la précipitation dans des flacons, ainsi qu’une approche semi-automatisée dans un format de cartouche de spin. Nous avons également optimisé le protocole de précipitations pour qu’il soit cohérent et rapide.L’ensemble du protocole ne prend que quelques minutes. Ces protocoles démontrent que la précipitation des protéines par solvant est idéale pour la préparation des échantillons avant la spectrométrie de masse. Les protocoles s’intégreront parfaitement dans les flux de travail professionnels ascendants et descendants.Ziheng Dang et Victoria Miller, scientifique principale chez Proteoform Scientific à Halifax, en Nouvelle-Écosse, feront une démonstration pour nous aujourd’hui Pipeter 90 microlitres de solution protéique sans particules dans un tube microcentrifuge en polypropylène. Ajoutez ensuite 10 microlitres de chlorure de sodium aqueux à une mole et 400 microlitres d’acétone dans la solution échantillon, bouchez et tapotez doucement le flacon pour combiner les solvants. Laissez le flacon l’incuber.Température ambiante non perturbée pendant au moins deux minutes après l’incubation, centrifuger les échantillons en notant l’orientation du flacon et faire tourner pendant au moins deux minutes à 10 000 FCR ou plus à température ambiante. Après la centrifugation, une pastille blanche visible est observée au fond du tube. À ce stade, décapsulez le tube et décantez le surnate dans un conteneur à déchets en retournant le tube.Utilisez une serviette en papier pour aspirer tout solvant résiduel du flacon. Pour les FDS contenant des échantillons. Distribuez soigneusement 400 microlitres d’acétone fraîche sans déranger la pastille.Utiliser immédiatement l’échantillon pendant une minute à 10 000 fois G ou plus à température ambiante en plaçant le flacon dans le rotor dans la même orientation que la rotation initiale. Décompter le solvant de lavage comme décrit précédemment. Sécher l’échantillon avec le bouchon ouvert pendant environ une minute.Dans une hotte, avant une solubilisation des granulés. Distribuer 100 microlitres de la solution protéique dans un flacon en polypropylène. Dans la hotte, ajoutez 400 microlitres de méthanol suivis de 100 microlitres de chloroforme.Boucher brièvement le flacon et le vortex pour mélanger. Distribuez rapidement 300 microlitres d’eau directement au centre du flacon. Boucher le flacon et laisser reposer sur la paillasse sans être dérangé pendant une minute, après avoir placé le flacon en polypropylène dans une centrifugeuse et le faire tourner pendant cinq minutes à 10 000 fois G ou plus à température ambiante.On observe que le flacon a deux couches de solvant et une pastille blanche visible jusqu’au flacon à environ 45 degrés. Retirez environ 700 microlitres du solvant de la couche supérieure à un débit uniforme à l’aide d’une grande pointe de micro-pipette d’un millilitre d’abord et plus tard avec une pointe de pipette de 200 microlitres jusqu’à ce qu’elle forme un cordon dans le flacon. Ajouter 400 microlitres de méthanol frais dans le flacon d’échantillon sans perturber la pastille en distribuant le solvant sur le côté du flacon.Boucher le flacon et combiner les couches de solvant en secouant doucement le flacon pour agiter les solvants ensemble. Observer la pastille de protéine blanche en notant l’orientation du flacon dans la centrifugeuse du rotor pendant au moins 10 minutes à 10 000 fois G ou plus à température ambiante. Inclinez le flacon avec la pastille vers le bas.Placez un embout de pipette le long du bord supérieur du flacon et retirez le surnageant avec un micro-embout de pipette d’un millilitre à un rythme lent mais uniforme. Retenir environ 20 microlitres de solvant. Laisser sécher le solvant résiduel dans la hotte.Pour précipiter la protéine. À l’aide d’une cartouche de filtration jetable, fixez le bouchon à la cartouche de filtration supérieure. Combiner 90 microlitres de solution protéique 10 microlitres d’une mole aquas, du chlorure de sodium et 400 microlitres d’acétone.Incuber pendant au moins deux minutes sur la paillasse, centrifuger l’échantillon de protéines préparées avec le bouchon encore attaché à la cartouche de filtration pendant deux minutes à 2 500 fois G.At température ambiante, retourner la cartouche et dévisser et retirer le bouchon de la base de la cartouche. Placer la cartouche de filtration dans un flacon centrifugeur propre de l’échantillon de protéines pendant trois minutes à 500 fois G à température ambiante. Jetez le solvant d’écoulement du flacon inférieur.Lavez la pastille de protéine en ajoutant 400 microlitres d’acétone à la cartouche de filtration, centrifugez pendant trois minutes à 500 fois G à température ambiante ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solvant dans la cartouche supérieure. Suivre les protocoles de précipitation des protéines précédemment démontrés. Resolubiliser la protéine en mouillant la membrane à la base de la cartouche de filtration en distribuant deux à cinq microlitres de propanol ISO directement sur la membrane immédiatement avant de procéder au protocole de résolubilisation pour la résolubilisation de la pastille de protéine préparer une solution volumique à 80 % en volume d’acide formique dans l’eau.Pré-refroidir cette solution acide à moins 20 degrés Celsius et la cartouche de filtration contenant des protéines précipitées. Distribuez 50 microlitres d’acide formique dilué à froid dans le bouchon de la cartouche refroidie et le vortex pendant 30 secondes. Remettre la cartouche de filtration au congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes.Répétez les étapes précédentes du vortex et de l’incubation. Ajouter 450 microlitres d’eau à un volume final de 500 microlitres. Diluer l’acide formique à 8%Dévissez la cartouche, retirez le bouchon de la base de la cartouche et fixez la cartouche SPE au flacon.Faites tourner la protéine à travers la cartouche SPE dans une centrifugeuse à température ambiante pendant cinq minutes à 800 fois G.Si le solvant reste dans la cartouche supérieure, remettez la cartouche dans la centrifugeuse et répétez l’essorage. Rincer en ajoutant 300 microlitres d’acétonitrile à 5% avec 0,1% de TFA dans l’eau à la cartouche SPE, écouler à travers la cartouche SPE pendant deux minutes à 2000 fois G.Pour les protéines de faible poids moléculaire ou les peptides digérés, éluer l’échantillon en faisant couler 300 microlitres. A 50% d’acétonitrile avec 0,1% de TFA pendant cinq minutes à 2 500 fois G.For protéines intactes.Poursuivez avec une étape d’élusion supplémentaire en utilisant 300 microlitres d’acétonitrile à 75% avec 0,1% d’acide ascétique trifluoro. Combinez les deux extraits obtenus. La figure compare la déplétion de la SDS après une base de flacon ou la précipitation de protéines dans une cartouche filtrante jetable.Utilisation de l’acétone avec les protocoles conventionnels rapide et CMW. Toutes les approches réduisent les FDS pour permettre une analyse optimale par spectrométrie de masse. Cette figure montre la récupération quantitative des protéines en suivant la précipitation rapide de l’acétone et la précipitation CMW grâce à l’analyse de page SDS d’un lysat cellulaire total de levure traitée.Une récupération constante a été obtenue avec tous les protocoles de précipitations. La précipitation dans une cartouche de filtration jetable élimine le besoin de pipeter soigneusement les FDS contenant du surnageant tout en retenant les protéines agrégées au-dessus d’un filtre à membrane. Ainsi, aucune bande visible n’a été détectée dans les fractions surnageantes à travers trois répétitions indépendantes.La précipitation protéique à base de cartouche démontre une récupération supérieure d’un échantillon de plasma bovin digéré par la pepsine par rapport à la précipitation en flacon. Des différences plus significatives dans le rendement sont notées dans la cartouche lorsque l’utilisation de chlorure de sodium tandis que l’utilisation de solvant de zinc a entraîné le rendement le plus élevé. Cette figure quantifie l’intensité maximale peptidique de chaque échantillon de peptide avec un rapport supérieur à un reflétant une abondance peptidique plus élevée pour les échantillons traités dans les cartouches filtrantes jetables.La figure compare le nombre de peptides identifiés par protéine dans les trois préparations d’échantillons répliquées. Les coefficients de corrélation de 0,94 à 0,95 dans ces graphiques démontrent la grande cohérence de l’approche de préparation des échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse ascendante. Donc, une fois que cette pastille est formée, vous voulez vraiment éviter de la déranger.Si vous le conservez comme une pastille intacte, vous obtiendrez un rendement plus élevé. Assurez-vous donc de ne pas oublier de laver cette pastille avec de l’acétone supplémentaire. Cela nous permet de nous débarrasser de la FDS en gardant notre échantillon aussi propre que possible et cela nous donne la meilleure analyse de spectrométrie de masse.Nous avons donc constaté que l’élimination de l’excès de solvant en inversant le est beaucoup plus simple que d’essayer de pipeter l’échantillon. Vous obtiendrez des rendements plus constants de cette façon. La précipitation de l’acétone à température ambiante a permis une récupération plus constante et plus rapide que la précipitation traditionnelle au congélateur.

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Précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal

Précipitation de protéines à base de solvants organiques pour une purification robuste du protéome avant la spectrométrie de masse

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