Name: Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez les méthodes électrophysiologiques pour caractériser les photopigments bistables chez Drosophila. Cette technique permet le dépistage génétique des mutants visuels et l'analyse des mécanismes de phototransduction in vivo.

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Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF) et de la Fondation scientifique binationale États-Unis-Israël (BSF). Nous remercions M. Anatoly Shapochnikov pour la construction du réchauffeur de filament de cire.

1. Mesure de la relation intensité-réponse, de l’après-potentiel dépolarisant prolongé (PDA) et du potentiel récepteur précoce (ERP) à l’aide de l’électrorétinogramme
<ol><li>Conditions d’élevage appropriées pour la préparation de D. melanogaster<ol>
<li>Élever les mouches D. melanogaster dans des bouteilles contenant du maïs jaune standard contenant de la nourriture dans un incubateur maintenu à une température de 24 ° C et dans un cycle sombre / clair de 12 h</li>
		<li>Gardez les bouteilles de mouches dans l’obscurité au moins 24 heures avant l’expérience.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuration générale<ol>
<li>Préparer les pipettes d’enregistrement en tirant des capillaires en verre borosilicate remplis de fibres de 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) (Figure 6L, O). La résistance des pipettes doit être de 5 à 10 MΩ; tout extracteur approprié peut être utilisé.</li>
		<li>Enduisez deux fils d’argent avec AgCl2, en insérant un fil d’argent de 0,25 mm dans une solution KCl de 3 M connectée à une alimentation 5 V sur mesure.</li>
		<li>Insérez chaque fil d’argent revêtu dans les porte-électrodes (Figure 6N).</li>
		<li>Remplir le capillaire en verre avec la solution de Ringer filtrée (voir tableau 1) à l’aide d’une seringue à pointe allongée (figure 6M).</li>
		<li>Insérez l’électrode métallique dans le capillaire en verre. Assurez-vous que la solution dans le capillaire est en contact avec le fil d’argent.</li>
		<li>Insérez les porte-électrodes (Figure 7P, N) dans les deux micromanipulateurs d’électrodes (Figure 7G).</li>
	</ol></li>
	<li>Procédure de préparation de la mouche pour les enregistrements électriques REMARQUE: Pour garder la mouche dans des conditions adaptées à l’obscurité, utilisez uniquement un éclairage de lumière rouge tamisée pendant les étapes suivantes.<ol>
<li>Anesthésiez les mouches dans la bouteille avec du gaz CO2 à l’aide du système de couchette à mouches (Figure 6A, B) et versez-les dans le récipient dormant.</li>
		<li>Choisissez une mouche et tenez-la soigneusement par son aile à l’aide d’une pince à épiler tranchante. Couvrez le reste des mouches avec une boîte de Pétri.</li>
		<li>Placez la mouche sur le porte-mouches dans la bonne orientation, couchée sur le côté, le dos vers la main (Figure 6P).</li>
		<li>Allumez l’alimentation du fer à souder. Réglez le courant sur ~2,25 A. Ce courant doit chauffer le filament de platine-iridium de 0,25 mm à ~55-56 °C (voir Fichier supplémentaire).</li>
		<li>Placez une goutte de cire à basse température de fusion (~55-56 °C) sur le fer à souder (Figure 6F).</li>
		<li>À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la mouche de ses ailes et fixez ses ailes au porte-mouches (Figure 6I) à l’aide du fer à souder.</li>
		<li>À l’aide du fer à souder, raccordez le dos de la mouche à la surface du support avec de la cire (Figure 6P).</li>
		<li>Abaissez l’extrémité du fer à souder sur le point d’assemblage des pieds et faites fondre la cire pour recouvrir tous les pieds ensemble (Figure 6P).</li>
		<li>Placez une petite goutte de cire entre la tête et le dos dans la région du cou (Figure 6P). REMARQUE: Prenez des précautions particulières pour éviter de surchauffer la tête de la mouche. Assurez-vous que la mouche est correctement fixée et qu’elle est incapable de bouger pendant l’expérience; des mouvements mineurs peuvent créer des artefacts dans les enregistrements. Assurez-vous que les ouvertures de la trachée (entrées respiratoires) dans le thorax et l’abdomen ne sont pas recouvertes de cire.</li>
		<li>Placez le porte-mouches (Figure 7Q) dans une cage de Faraday sombre sur un bloc magnétique (Figure 7I) et assurez-vous que la mouche se trouve à environ 5 mm de l’extrémité du guide de lumière (Figure 7L).</li>
		<li>Placez l’électrode d’enregistrement (Figure 7P) au-dessus de l’œil de la mouche et l’électrode de masse (Figure 7N) sur le haut du dos de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.</li>
		<li>Insérez l’électrode de terre à l’arrière de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.</li>
		<li>Insérez l’électrode d’enregistrement dans la périphérie externe de l’œil de la mouche, de préférence, à l’aide des micromanipulateurs. REMARQUE: Après avoir inséré l’électrode dans l’œil, une petite fossette sera observée; tirez l’électrode vers le haut sans la retirer de l’œil jusqu’à ce que la fossette disparaisse. Les électrodes peuvent également être immergées dans de petites gouttelettes de gelée d’électrode appliquées au niveau du torse et de l’œil.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocole intensité-réponse<ol>
<li>Placez un filtre orange (filtre à bord 590) devant la lampe au xénon haute pression. Utilisez un grand filtre (six ordres de grandeur) de densité neutre (ND) atténuante.</li>
		<li>Attendez 60 s dans l’obscurité et donnez une impulsion lumineuse de 5 s.</li>
		<li>Remplacez le filtre ND par un filtre ND moins atténuant par incréments d’un ordre de grandeur.</li>
		<li>Attendez 60 s dans l’obscurité et donnez une deuxième impulsion lumineuse de 5 s.</li>
		<li>Répétez les étapes 1.4.1.-1.4.4, en augmentant progressivement l’intensité lumineuse à l’aide de filtres ND moins atténuants (la dernière impulsion doit être générée sans filtre ND du tout). Assurez-vous d’utiliser la série de filtres ND dans la bonne direction, en partant d’une grande atténuation et en atteignant une faible atténuation.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocole PDA (ce protocole ne peut être effectué que sur des mouches aux yeux blancs)<ol>
<li>Donnez une impulsion lumineuse de 5 s d’intensité maximale à l’aide d’un filtre orange (filtre à bords 590, pour convertir le photopigment maximal à l’état R).</li>
		<li>Remplacez le filtre orange par un filtre bleu à large bande (BP450/40 nm) et donnez trois impulsions lumineuses de 5 s à l’intensité maximale. REMARQUE: Il est également possible de donner une longue impulsion de lumière bleue d’intensité maximale continue jusqu’à ce qu’une réponse de tension à l’état d’équilibre soit atteinte.</li>
		<li>Attendez 60 s dans l’obscurité, remplacez le filtre bleu par le filtre orange précédent et donnez deux impulsions lumineuses de 5 s avec des intervalles de 60 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocole de potentiel ERP/M pour mesurer le spectre de photo-équilibre de M (ce protocole ne peut être effectué que sur des mouches aux yeux blancs10,25)<ol>
<li>Donnez une impulsion lumineuse bleue continue (passe-bande (BP) 450/40 nm) jusqu’à ce qu’elle atteigne une réponse de tension à l’état stable, ce qui convertit la quantité maximale de photopigment de l’état R à l’état M des cellules R1-6.</li>
		<li>Donner un bref flash lumineux intense (<3 ms) d’une longueur d’onde comprise entre 350 et 700 nm (le spectre d’absorption connu du photopigment des cellules R1-6) à l’aide de filtres passe-bande étroits (~20 nm) et mesurer l’amplitude maximale de la phase M1 de la réponse potentielle M (qui reflète l’absorption de la métarhodopsine à cette longueur d’onde spécifique au photo-équilibre10,25). REMARQUE: Pour l’activation synchrone d’un grand nombre de molécules de photopigment, un bref éclair de lumière intense est nécessaire pour que la teneur en photons soit emballée dans une courte durée. Le potentiel M est composé de deux composantes : M1 (phase cornéenne négative), qui reflète le déplacement de charge de la métarhodopsine dans le photorécepteur, et M2 (phase cornéenne positive11,33), qui reflète la réponse M1 amplifiée des photorécepteurs dans la lame 9,10,11 . Chacun de ces composants peut être identifié et mesuré. Cependant, il est préférable de mesurer le potentiel M1 puisqu’il s’agit d’une manifestation linéaire directe des niveaux M. Si M2 est utilisé, assurez-vous que son amplitude est dans la gamme linéaire en utilisant une légère privation de caroténoïdes24,25.</li>
		<li>Donnez à nouveau une impulsion lumineuse bleue continue (BP450/40 nm), suivie d’un bref flash lumineux intense (<1 ms) d’une longueur d’onde différente.</li>
		<li>Répétez ce protocole jusqu’à ce que tout le spectre d’absorption de M à l’équilibre photo soit couvert.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Protocole ERC pour mesurer le spectre d’action des états R et M des cellules R1-6 à l’aide d’enregistrements de tension-pince à cellules entières
REMARQUE: Pour un protocole détaillé pour l’utilisation des enregistrements de tension de cellule entière, voir Katz et al.34. Le potentiel M utilise l’ERG pour mesurer l’activation de l’état M uniquement parce que la contribution de l’état R est supprimée par la capacité membranaire. En revanche, l’ERC mesure l’activation des états R (ERC positif) et M (ERC négatif) parce que les enregistrements de tension-pince éliminent l’effet de la capacité membranaire (voir introduction).
<ol><li>Convertissez le photopigment à l’état souhaité (R ou M). Pour la conversion R en M, tout d’abord, adaptez les mouches par un bref flash bleu adaptatif (BP450/40 nm) (<1 ms). Pour la conversion M en R, donnez un court flash orange adaptatif (filtre de bord OG590).</li>
	<li>Donnez un bref flash lumineux (<1 ms) d’une longueur d’onde comprise entre 350 et 700 nm et mesurez l’amplitude maximale négative ou positive de la réponse ERC, qui reflète l’absorption M/R à cette longueur d’onde spécifique. REMARQUE: Pour l’activation synchrone d’un grand nombre de molécules de photopigment, un bref éclair de lumière intense est nécessaire pour emballer la teneur en photons en une courte durée. La conversion maximale du photopigment de R à M par flash bleu peut atteindre environ 80 % du total des molécules de photopigment en raison du chevauchement du spectre d’absorption de R et M (Figure 3A). Par conséquent, à des longueurs d’onde inférieures à ~550 nm, l’ERC a deux composantes: une phase négative qui reflète la réponse de la métarhodopsine et une phase positive qui reflète la réponse de la rhodopsine restante. L’ERC dépend linéairement de l’intensité lumineuse (Figure 5D). En conséquence, pour dériver la sensibilité spectrale des états R et M, chaque phase de l’ERC doit être normalisée aux différentes longueurs d’onde pour une énergie égale29.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.1.-2.2. en utilisant des flashs de différentes longueurs d’onde.</li>
	<li>Tracez l’ERC positif et négatif normalisé en fonction de la longueur d’onde. REMARQUE: Le fort flash de lumière induit un courant massif à travers les canaux sensibles à la lumière conduisant à un stress métabolique sur le photorécepteur, ce qui, à son tour, provoque une ouverture de canal indépendante de la lumière. Le CER se superpose à ce courant constitutif.</li>
</ol>

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<li>Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recovery+from+a+transient+inhibition+of+the+oxidative+metabolism+of+the+photoreceptors+of+the+drone+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera).</a> Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca+2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le principal avantage de l’utilisation de la préparation de photorécepteurs de drosophile est son accessibilité, la facilité et la précision de la stimulation lumineuse et, surtout, la capacité d’appliquer la puissance de la génétique moléculaire7. Des études génétiques approfondies ont établi la drosophile comme un système modèle extrêmement utile pour la dissection génétique de processus biologiques complexes7. La structure relativement simple du génome ...

La rhodopsine (R) activée par la lumière, qui est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG), est composée d’une protéine transmembranaire 7 (opsine) et d’un chromophore. Chez Drosophila melanogaster (mouche des fruits), l’absorption des photons induit l’isomérisation du chromophore rétinien 11-cis-3-OH en tout-trans-3-OH-rétinien1, favorisant le changement conformationnel de la rhodopsine en métarhodopsine (M, Figure 1A). Contrairement à la rhodopsine vertébrée, la fraction prédominante du chromophore invertébré ne se dissocie pas de l’opsine, ce qui entraîne l’état pigmentaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité M. À son tour, l’absorption supplémentaire de photons par le chromophore rétinien entièrement trans-3-OH induit l’isomérisation du chromophore 2,3, générant l’état pigmentaire R avec le chromophore rétinien 11-cis-3-OH. L’état R est un photopigment sombre, stable et physiologiquement non actif. En plus de la voie de régénération des photons extrêmement rapide du chromophore4, un peu comme les photopigments des vertébrés, il existe une voie lente enzymatique alternative pour la régénération des chromophores chez les invertébrés, dans laquelle certaines des étapes sont effectuées dans les cellules rétiniennes entourant les cellules photoréceptrices 5,6.
La drosophile présente de grands avantages en tant qu’organisme modèle pour l’étude des photorécepteurs d’invertébrés. En particulier, l’accessibilité de la préparation et la capacité d’appliquer la génétique moléculaire ont fait de la drosophile un puissant système modèle7. Par conséquent, plusieurs méthodes expérimentales in vivo et ex vivo pour étudier la phototransduction en général et les niveaux de photopigment, en particulier, ont été établies. La méthode in vivo la plus simple exploite la réponse de tension extracellulaire relativement grande enregistrée à la lumière de l’œil de la drosophile. En conséquence, la stimulation lumineuse évoque une réponse de tension électrique dans l’ensemble de l’œil qui peut être mesurée à l’aide de l’enregistrement extracellulaire par électrorétinogramme (ERG), qui est ~ 3 ordres de grandeur plus grand que la réponse ERG à la lumière des yeux vertébrés 8,9. La réponse ERG de la drosophile est robuste et facile à obtenir, ce qui en fait une méthode pratique pour identifier les anomalies de la réponse à la lumière dues aux mutations. La réponse ERG à la lumière provient principalement des photorécepteurs, des cellules pigmentaires (glie) et des neurones secondaires de la lame (voir la figure 1B). Les principaux composants de l’ERG sont (i) la réponse en tension extracellulaire des photorécepteurs, (ii) les transitoires « on » et « off » au début et à la fin du stimulus lumineux qui proviennent des neurones de la lame (Figure 2A, inset, ON, OFF), (iii) la réponse lente des cellules gliales (Figure 2A, encart, flèches), et (iv) la réponse brève et transitoire, résultant d’un déplacement de charge lors de l’activation du photopigment qui précède le transitoire ON10 (Figure 2C [encart], D, E). Cette réponse brève est composée de deux phases (M1 et M2, Figure 2C [encadré]) et ne peut être induite que par une stimulation lumineuse extrêmement forte, qui active simultanément des millions de molécules de photopigment. Il n’est observé ni sous stimulation bleue (Figure 2D, trace bleue) ni chez les mutants ayant des niveaux de photopigment fortement réduits (Figure 2E, trace rouge), mais son amplitude est légèrement augmentée chez un mutant qui abolit l’activité PLC (Figure 2E, trace orange). La phase M1 est un ERP typique de la mouche résultant de l’activation de M dans les photorécepteurs. La phase M1, qui a une polarité positive (intracellulaire), libère un neurotransmetteur de manière normale dans une synapse inversant les signes et active les neurones de la lame, qui répondent à la dépolarisation des photorécepteurs en générant la phase M2 amplifiée synaptiquement. Ainsi, les phases M1 et M2 reflètent l’activation M10,11.
La dépolarisation du photorécepteur génère le transitoire « on » cornéen positif, résultant de la synapse d’inversion des signes entre l’axone photorécepteur et les neurones monopolaires de la lame 10,11 (Figure 1B). La lente montée et la désintégration de l’ERG résultent de la dépolarisation des cellules pigmentaires (Figure 2A, encart, flèches) principalement due à l’efflux K+ des cellules photoréceptrices12 via les canaux 13,14,15 du potentiel récepteur transitoire (TRP) et TRP-like (TRPL). Ces composants cinétiques lents masquent et déforment en grande partie la forme d’onde de la réponse photoréceptrice par rapport aux enregistrements intracellulaires ou à cellules entières de la réponse photoréceptrice à la lumière 9,10. De plus, à des éclairements très forts, une réponse transitoire supplémentaire, qui précède et fusionne partiellement avec le transitoire « on », peut être observée (Figure 2C [encart], D,E). Ce signal provient directement de l’activation massive du photopigment10.
Plusieurs protocoles de régime lumineux utilisant des filtres de densité neutre (ND) et de couleur, ainsi que de forts éclairements, ont été développés pour étudier l’œil en général et la cascade de phototransduction en particulier. Ces protocoles ont également été utilisés pour étudier les propriétés du photopigment.
Le protocole intensité-réponse mesure l’amplitude de crête de la réponse en tension ERG de l’ensemble de l’œil à l’augmentation des intensités lumineuses (Figure 2A, B). Ce protocole aide à détecter les changements dans la sensibilité des cellules photoréceptrices à la lumière9.
Le protocole postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite les différences dans les spectres d’absorption de la rhodopsine et de la métarhodopsine qui permet, chez la drosophile, une conversion massive du photopigment de R à son état M intermédiaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité2. Dans la réponse de tension ERG, une impulsion relativement courte de lumière saturante est donnée et la réponse de tension résultante est enregistrée. Dans cette condition, un plafond (potentiel d’inversion) est atteint par le signal de dépolarisation car l’activation d’une fraction de pourcentage de l’énorme quantité de molécules de rhodopsine (~1 x 108) est suffisante pour atteindre le plafond. La présence des composants de phototransduction en grande abondance garantit que ce plafond sera atteint même chez les mutants avec une réduction significative de la concentration ou un dysfonctionnement subtil des composants de phototransduction. Cette situation empêche l’isolement de ces mutants. Pak et al. ont introduit le dépistage PDA7 à la recherche d’un test fiable et révélateur pour isoler les mutants visuels. Chez la drosophile, la réponse PDA est provoquée par l’élimination génétique du pigment de criblage rouge, ce qui permet la conversion du photopigment, et l’application de lumière bleue, qui est préférentiellement absorbée par la rhodopsine (Figure 3A) et, par conséquent, entraîne une conversion nette importante de l’état de photopigment R à M. La terminaison de la phototransduction est perturbée au niveau du photopigment par une conversion nette importante de R en M, ce qui, à son tour, entraîne une excitation soutenue longtemps après l’extinction de la lumière (Figure 2C, Figure 4A [en haut]). Pendant la période PDA, les photorécepteurs sont moins sensibles aux lumières d’essai ultérieures et sont partiellement désensibilisés (inactivés). Le PDA détecte même les défauts mineurs dans la biogenèse de la rhodopsine et teste la capacité maximale de la cellule photoréceptrice à maintenir l’excitation pendant une période prolongée. Comme il dépend strictement de la présence de fortes concentrations de rhodopsine, il obtient facilement des scores pour un réapprovisionnement déficient des composants de phototransduction. Remarquablement, l’écran PDA a donné de nombreux mutants visuels nouveaux et très importants (examinés dans Pak et al.7). Ainsi, les mutants PDA isolés par Pak et al.7 sont encore extrêmement utiles pour analyser le système visuel de la drosophile .
La PDA est induite chez la drosophile par la saturation de la lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation continue longtemps après le décalage de la lumière (Figure 4A [en haut]). Après avoir saturé la lumière bleue induisant le PDA, les photorécepteurs périphériques (R1-6) restent continuellement actifs dans l’obscurité à leur capacité maximale, atteignant la saturation. Des lumières bleues saturantes supplémentaires pendant le PDA ne produisent aucune réponse supplémentaire dans les cellules R1-6 pendant de nombreuses secondes, mais induisent une réponse dans les cellules R7-8 qui se superpose au PDA. Les réponses superposées s’expliquent par les différents spectres d’absorption des photopigments exprimés dans ces cellules (R7-8)16. Le PDA peut être supprimé par la photoconversion de M en R avec une lumière orange saturée (Figure 4A [en haut]). La capacité du PDA à amener les cellules photoréceptrices à leur capacité active maximale, une situation qui ne peut être atteinte par une lumière blanche intense, explique pourquoi il a été un outil majeur pour dépister les mutants visuels de la drosophile. En effet, il permet de détecter même des défauts mineurs dans les protéines impliquées dans la biogenèse des niveaux normaux de photopigment17,18. Deux groupes de mutants défectueux PDA ont été isolés : ni les mutants inactivation ni les mutants après-potentiel (nina) et les mutants inactivés mais pas les mutants après-potentiels (ina). Le phénotype du premier est l’absence de PDA et l’inactivation associée résultant d’une réduction importante des niveaux de photopigment (Figure 4A [milieu]). Le phénotype de ce dernier montre une inactivation mais pas de dépolarisation sombre après lumière bleue en raison d’un mécanisme encore inconnu chez le mutant avec des niveaux normaux de rhodopsine mais dépourvu de protéines interagissant avec les canaux TRP (Figure 4A [en bas]).
Le PDA résulte de la différence dans la quantité de photopigment par rapport à l’arrestine (ARR2), qui lie et met fin à l’activité M 19,20,21 (Figure 1A). Chez les photorécepteurs de la drosophile, la quantité de photopigment est environ cinq fois plus grande que la quantité d’ARR219. Ainsi, les niveaux d’ARR2 sont insuffisants pour inactiver toutes les molécules M générées par une grande photoconversion nette de R à M, laissant un excès de M constamment actif dans l’obscurité 17,19,20,22,23. Ce mécanisme explique l’élimination de la réponse PDA par mutations ou par privation de caroténoïdes24,25, provoquant une réduction du niveau de photopigment, mais n’affecte pas les niveaux d’arrestine. De plus, cette explication tient également compte des phénotypes de l’allèle21 mutant ARR2 nul (arr23), dans lequel la PDA pourrait être obtenue à des intensités de lumière bleue plus faibles d’environ10 fois 19,20,21 (Figure 4B,C). Le PDA n’est pas une caractéristique unique des photorécepteurs de mouches, et il apparaît chez toutes les espèces testées qui ont un M stable sombre avec un spectre d’absorption différent de celui de l’état R, permettant une photoconversion suffisante du photopigment de l’état R à l’état M. Une espèce soigneusement étudiée chez laquelle la phénoménologie PDA a été découverte est le photorécepteur barnacle (Balanus), dans lequel le spectre d’absorption de l’état R est dans une longueur d’onde plus longue que l’état M2 (Figure 3B). En conséquence, contrairement à la situation dans la mouche, dans la bernacle, la lumière orange-rouge induit un PDA, tandis que la lumière bleue supprime le PDA2.
Le protocole ERP (Early Receptor Potential) exploite le déplacement de charge qui se produit lors de l’activation de R ou M. Le pigment visuel fait partie intégrante de la membrane superficielle du compartiment de signalisation des membranes des vertébrés et des invertébrés3. En conséquence, le processus d’activation dans lequel les molécules de photopigment passent d’un état intermédiaire à l’autre s’accompagne d’un déplacement de charge 4,26. Comme les molécules de photopigment sont alignées électriquement en parallèle avec la capacité membranaire4, un changement conformationnel synchronisé rapide génère un changement de polarisation rapide de la membrane de surface, qui, chez les mouches, se produit dans le compartiment de signalisation composé d’une pile d’environ 30 000 à 50 000 microvillosités appelée rhabdomere. Cette polarisation se décharge ensuite passivement à travers la capacité membranaire du corps cellulaire jusqu’à ce que la membrane cellulaire soit également polarisée. L’ERP est l’enregistrement extracellulaire du déplacement de charge. L’ERP intracellulaire enregistré manifeste l’ERP extracellulaire intégré par la constante de temps de la membrane cellulaire 4,27,28. Le courant activé par le déplacement de la charge pigmentaire visuelle a également pu être mesuré dans les enregistrements de tension-pince de cellule entière29,30 (Figure 5A-D), avec l’avantage majeur (dans les enregistrements de courant récepteur précoce (ERC)) de minimiser l’effet de la capacité membranaire sur la cinétique du signal.
La section du protocole décrit comment effectuer des mesures ERG à partir de mesures de l’œil de drosophile 9 et des mesures ERC par des enregistrements de cellules entières d’ommatidies isolées de drosophiles 31,32. Nous décrivons également des protocoles spécifiques qui sont utilisés pour étudier la phototransduction en général et les photopigments en particulier.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 mL avec embout</td><td></td><td></td> allongé <td>Figure 6M</td></tr><tr><td>1 pince à épiler rugueuse</td><td></td><td>Dumont #5, Standard</td><td>0,1 mm x 0,06 mm, longueur 110 mm, Inox (Figure 6H)</td></tr><tr><td>2 lentilles</td><td></td><td></td><td></td>de condenseur</tr><tr><td>Convertisseur A/N</td><td>Dispositif moléculaire</td><td>Digidata 1200</td><td>Remplacement possible : tout digidata des dispositifs moléculaires (par exemple 1440A) -Figure 7C</td></tr><tr><td>Amplificateur</td><td>Électronique</td><td></td> presque parfaite <td>Remplacement possible : Instruments Warner - IE251A ou IE-210 (livré avec étage de tête)- Figure 7D</td></tr><tr><td>Table antivibratoire</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td>Figure 7H</td></tr><tr><td>Capillaires</td><td>Harvard Appareil Harvard</td><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>1 mm x 0,58 mm (Figure 6O)</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Source de lumière froide</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td>Figure 6C</td></tr><tr><td>Essuie-glaces délicats</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes (Figure 6K)</td></tr><tr><td>Porte-électrode</td><td></td><td></td><td>Convient pour le diamètre extérieur capillaire 1 mm (Figure 6N, Figure 7N et Figure 7P)</td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>Fabrication</td><td></td> maison <td>Blindage contre le bruit électromagnétique et rideau avant noir (Figure 7K)</td></tr><tr><td>Filtre (couleur)</td><td>Schott</td><td>OG590, Filtre de bord</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>Filtre (couleur)</td><td>Schott</td><td>BP450/40 nm</td><td>Figure</td></tr><tr><td>7S Filtre (couleur)</td><td>Blazers</td><td>550 nm</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>Filtre (couleur) pour source de lumière froide</td><td>Schott</td><td>RG630</td><td>Figure 6C</td></tr><tr><td>Filtre (chaleur)</td><td>Schott</td><td>KG3</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>Filtres (neutre) filtre de densité)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td>Figure 7S</td></tr><tr><td>Système de lampe flash</td><td>Honeywell</td><td></td><td>Figure 7U</td></tr><tr><td>Système de dormeur de mouche avec injecteur</td><td>Inject + matic</td><td></td><td>Figure 6A-B</td></tr><tr><td>Alimentation de la lampe</td><td>PTI</td><td>LPS-220</td><td>Figure 7W</td></tr><tr><td>Détecteur de lumière</td> Phototransistor <td>fait</td><td></td> maison <td>(Figure 7O)</td></tr><tr><td>Guide de lumière</td><td></td><td></td><td>3 mm de diamètre, 1,3 m de long (Figure 7L,M)</td></tr><tr><td>Source</td><td></td><td></td> lumineuse <td>Lampe au xénon haute pression sans ozone de 75 W (fonctionnant sur 50 W), remplacement possible : Recherche Cairn - OptoLED (Figure 7R)</td></tr><tr><td>Cire fondante à basse température</td><td>Fait</td><td></td> maison <td>Composé d’un mélange de cire d’abeille (Tm&asymp ; 62 &deg ; C) et de la paraffine à ~3:1 pour atteindre une température de fusion de ~55&ndash ; 56 &deg ; C (Figure 6J)</td></tr><tr><td>Support magnétique pour mouches</td><td>Fabrication</td><td></td> maison <td>Figure 6I et Figure 7Q</td></tr><tr><td>Système de préamplificateur à microélectrodes avec étage de tête</td><td>Électronique</td><td></td> presque parfaite <td>Testeur d’impédance (Figure 7G)</td></tr><tr><td>Micromanipulateur (mécanique grossier)</td><td>Tritech Research, Narishige</td><td>M-2</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur (mécanique fine)</td><td>Leitz</td><td>Microsystems Leitz Micromanipulateur mécanique</td><td>Figure 7F</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Dispositif moléculaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Boîte de Pétri</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Générateur d’impulsions</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td>Figure 7A</td></tr><tr><td>Redux crème pour électrocardiographie</td><td>Parker Laboratories</td><td>Redux Electrolyte Cr&egrave ; me</td><td></td></tr><tr><td>Tournevis d’obturateur</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>VCM-D1 Uni-stable monocanal</td><td>Figure 7V</td></tr><tr><td>Système d’obturateur</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>LS2 2 mm Uni-stable</td><td>Shutters Figure 7V</td></tr><tr><td>Silver Wire</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25&ndash ; 1 mm de diamètre, doit être chlorurisé</td></tr><tr><td>Fer à souder composé d’un filament</td><td></td><td></td> de platine-iridium de <td>0,25 mm de diamètre (Figure 6F)</td></tr><tr><td>Zoom stéréoscopique Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td>Figure 6D</td></tr><tr><td>Zoom stéréoscopique</td><td>Microscope Wild</td><td>Wild M5</td><td>Avec 6, 12, 25 et 50 réglages de grossissement (Figure 7E)</td></tr><tr><td>Filtres à seringue</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &micro ; m Filtre PVDF</td></tr><tr><td>Extracteur de pipette vertical</td><td>Sutter/ Narishige</td><td>Modèle P-97/PP-830</td><td>Utiliser un extracteur vertical ou horizontal, selon vos préférences (Figure 6L)</td></tr><tr><td>Chauffage à filament de cire</td><td>Fait</td><td></td> maison <td>Voir figure S1 (Figure 6E-G)</td></tr><tr><td>Système de lampe flash au xénon</td><td>Dr. Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td>Figure 7X</td></tr></tbody></table>

méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

La rhodopsine (R) couplée à la photopigment G-protéine de la drosophile est composée d’une protéine (opsine) et d’un chromophore. Le processus d’activation de la rhodopsine est initié par l’isomérisation du chromophore induisant l’absorption des photons, favorisant les changements conformationnels de l’opsine et entraînant un deuxième état photopigment stable et sombre (métarhodopsine, M). L’étude de ce photopigment bi-stable utilisant la mutagénèse aléatoire nécessite des méthodes simples et robustes pour le dépistage des mouches mutantes. Par conséquent, plusieurs méthodes de mesure des réductions des niveaux de photopigment fonctionnel ont été conçues. L’une de ces méthodes exploite les déplacements de charge dans le photopigment après l’absorption des photons et les énormes quantités de molécules de photopigment exprimées dans les photorécepteurs. Ce signal électrique, appelé potentiel récepteur précoce (ou courant récepteur précoce), est mesuré par diverses méthodes électrophysiologiques (par exemple, électrorétinogramme et enregistrements de cellules entières) et est linéairement proportionnel aux niveaux de photopigment fonctionnels. Les avantages de cette méthode sont le rapport signal/bruit élevé, la mesure linéaire directe des niveaux de photopigment et l’indépendance des mécanismes de phototransduction en aval de l’activation de la rhodopsine ou de la métarhodopsine. Une méthode électrophysiologique supplémentaire appelée postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite la bi-stabilité du photopigment de la drosophile et les différences spectrales d’absorption des états pigmentaires R et M des mouches. Le PDA est induit par une lumière bleue intense, convertissant des quantités saturées de rhodopsine en métarhodopsine, ce qui entraîne l’échec de la terminaison de la réponse lumineuse pendant une période prolongée dans l’obscurité, mais il peut être terminé par la conversion de la métarhodopsine en rhodopsine en utilisant une lumière orange intense. Étant donné que le PDA est un signal robuste qui nécessite une conversion massive du photopigment, même de petits défauts dans la biogenèse du photopigment conduisent à un PDA anormal facilement détecté. En effet, des mutants PDA défectueux ont conduit à l’identification de nouvelles protéines de signalisation importantes pour la phototransduction.

La figure 2 illustre la robustesse et la facilité d’utilisation de la technique ERG. Il est robuste car il est enregistré dans la mouche pratiquement intacte par une technique simple d’enregistrements de tension extracellulaire qui nécessitent une configuration électrophysiologique simple. La robustesse se manifeste par l’obtention d’enregistrements de réponses lumineuses avec des amplitudes relativement grandes (de l’ordre du millivolt) même lorsque les mutations réduisent fortement ou défo...

Nous présentons un protocole pour caractériser électrophysiologiquement les photopigments bi-stables : (i) exploiter les déplacements de charge au sein des molécules de photopigment suite à l’absorption des photons et leur énorme quantité dans les photorécepteurs, et (ii) exploiter les différences de spectres d’absorption des états photopigment rhodopsine et métarhodopsine. Ces protocoles sont utiles pour dépister les mutations affectant les systèmes de photopigments stables.

Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Ce protocole est particulièrement adapté au dépistage génétique des mutants drosophiles déficients visuels. En effet, ils permettent la détection de petites anomalies dans la phototransduction de la drosophile, en particulier dans les niveaux de photopigments et les fonctions liées aux pairs. Cette technique est profonde in vivo, facile à exécuter et très robuste, permettant la détection de petits changements dans l’activité des protéines de phototransduction.À mon avis, réparer les mouches tout en maintenant la viabilité est probablement la partie critique de cette méthode. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel Clampex. Allumez l’amplificateur et le générateur d’impulsions Master-8, puis allumez la lampe au xénon et le contrôleur de l’obturateur.Allumez l’extracteur et placez un capillaire en verre dans l’extracteur et tirez-le. Retirez le capillaire en verre de l’extracteur. Remplissez le capillaire en verre avec une solution de sonnerie filtrée à l’aide d’une seringue à embout allongé.Insérez l’électrode métallique dans le capillaire en verre. Assurez-vous que la solution dans le capillaire est en contact avec le fil d’argent. Insérez les porte-électrodes dans les deux micromanipulateurs d’électrodes.Allumez l’alimentation du fer à souder. Réglez le courant sur environ 2,25 ampères. Ce courant devrait chauffer le filament platine-iridium de 0,25 millimètre à environ 55 à 56 degrés Celsius.Placez une goutte de cire à basse température de fusion sur le fer à souder. Anesthésiez les mouches dans le flacon. Versez les mouches anesthésiées dans le récipient dormeur, choisissez une mouche et couvrez le reste des mouches avec une boîte de Pétri.Tenez soigneusement la mouche par les ailes à l’aide d’une pince à épiler tranchante et placez-la sur le porte-mouche. Sur le porte-mouche, placez la mouche couchée sur le côté, le dos tourné vers la main. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez la mouche de ses ailes et fixez ses ailes au porte-mouche à l’aide du fer à souder.Connectez le dos de la mouche à la surface du support avec de la cire à l’aide du fer à souder. Abaissez la pointe du fer à souder jusqu’au point de jonction des jambes, puis faites fondre la cire pour couvrir toutes les jambes ensemble. Placez une petite goutte de cire entre la tête et le cou dans la région du cou.Placez le porte-mouche dans une cage de faraday sombre sur un bloc magnétique et assurez-vous que la mouche se trouve à environ cinq millimètres de l’extrémité du guide de lumière. Placez l’électrode d’enregistrement au-dessus de l’œil de la mouche et l’électrode de masse sur le haut du dos de la mouche à l’aide des micromanipulateurs. Insérez ensuite l’électrode de masse à l’arrière de la mouche à l’aide des micromanipulateurs.Insérez l’électrode d’enregistrement dans la périphérie externe de l’œil de la mouche, de préférence à l’aide des micromanipulateurs. Fermez la cage de faraday et éteignez les lumières de la pièce pour permettre une adaptation à l’obscurité pendant cinq minutes. Entrez les paramètres à partir d’une durée d’impulsion de 500 mètres par seconde, d’un intervalle d’impulsion de 60 secondes et du nombre d’impulsions réglé sur six.Pour mesurer le PDA, réglez le générateur d’impulsions Master-8 en mode TRAIN, puis donnez une impulsion lumineuse de cinq secondes d’intensité maximale à l’aide d’un filtre orange. Vérifiez la réponse en tension. Remplacez le filtre orange par un filtre bleu large bande et donnez trois impulsions lumineuses de 5 secondes à intensité maximale.Vérifiez la réponse en tension. Attendez au moins 60 secondes dans l’obscurité. Remplacez le filtre bleu par le filtre orange précédent.Ensuite, donnez deux impulsions lumineuses de 5 secondes avec des intervalles de 60 secondes. Vérifiez la réponse en tension. Pour mesurer le potentiel M de l’ERP, donnez une impulsion de lumière bleue continue jusqu’à ce qu’une réponse de tension en régime permanent soit atteinte.Donnez un bref flash lumineux intense d’une longueur d’onde comprise entre 350 et 700 nanomètres à l’aide d’un filtre passe-bande de 20 nanomètres. Mesurez ensuite l’amplitude maximale de la phase M1 de la réponse du potentiel M, qui reflète l’absorption de la métarhodopsine à cette longueur d’onde spécifique au photoéquilibre. Les réponses PDA ont été évaluées pour différentes mouches mutantes.Les mouches de type sauvage ont montré une dépolarisation saturée dans l’obscurité qui est apparue comme un ERG cornéen négatif prolongé, à la suite d’une stimulation intense de la lumière bleue. Les lumières bleues suivantes ont produit de petites réponses superposées au PDA, dépourvues des transitoires marche et arrêt. Chez les mouches mutantes présentant une biogenèse photopigmentaire anormale telle que ninaE, la réponse en tension est revenue à la ligne de base après une stimulation intense de la lumière bleue, et la réponse à une lumière bleue supplémentaire n’a pas été supprimée et a montré des transitoires normaux.L’ERP de type sauvage de la mouche est obtenu par le même protocole, mais un flash vert intense est appliqué pendant le PDA. Ce flash vert déclenche l’ERP et supprime le PDA. Le potentiel M a été obtenu par le flash vert après l’éclairage bleu, mais pas par un flash bleu après l’éclairage bleu chez la mouche de type sauvage.Ce protocole a été répété chez les types sauvages, dans les mutations hypomorphes photopigmentaires ninaE, et dans les mutants déficients en phototransduction avec des niveaux normaux de photopigments norpA. Les spectres d’absorption relatifs de la rhodopsine volante et de la métarhodopsine ont été calculés à partir de mesures photométriques du spectre différent et du spectre de photoéquilibre. Il est important pour la survie des mouches de faire attention à la viscosité de la cire en s’abstenant de surchauffe.Cette procédure convient à la génétique et au dépistage des mutants visuels défectueux. Les méthodes qui isolent et identifient au hasard les mutations visuelles peuvent faciliter la découverte de nouvelles protéines et de nouveaux mécanismes impliqués dans la phototransduction de la drosophile. Le protocole PDA a permis d’isoler des mécanismes visuels importants et nouveaux.La participation n’aurait probablement pas été découverte ou même anticipée autrement.

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