Name: Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Découvrez un protocole de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l'ADN cellulaire. Cette méthode optimise le traitement par lots de 25 échantillons avec refroidissement intégré.

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Les travaux rapportés dans cette publication ont été, en partie, soutenus par le National Institute of Environmental Health Sciences des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution : 1R41ES030274. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement le point de vue officiel des National Institutes of Health.

<ol><li>Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage%3A+mechanisms%2C+mutation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease.</a> The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).</li>
<li>Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogens+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Carcinogens and DNA damage.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).</li>
<li>Evans, M. D., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+contributing+to+the+outcome+of+oxidative+damage+to+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids.</a> Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).</li>
<li>Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage+and+disease%3A+induction%2C+repair+and+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance.</a> Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).</li>
<li>Miyamae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+lesions+induced+by+chemical+mutagens+using+the+single-cell+gel+electrophoresis+%28comet%29+assay.+2.+Relationship+between+DNA+migration+and+alkaline+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition.</a> Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).</li>
<li>Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel+electrophoresis%3A+detection+of+DNA+damage+at+different+levels+of+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity.</a> Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).</li>
<li>Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+new+protective+roles+for+vitamin+C+in+human+skin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells.</a> Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).</li>
<li>Karbaschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+cells+from+apoptosis+increases+DNA+repair+in+UVB+exposed+cells%3A+implications+for+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response.</a> Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).</li>
<li>Wu, J. H., Jones, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+interstrand+crosslinks+using+the+modified+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay.</a> Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).</li>
<li>Merk, O., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+crosslinks+with+the+comet+assay+in+relationship+to+genotoxicity+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).</li>
<li>Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+DNA+interstrand+crosslinking+in+individual+cells+using+the+Single+Cell+Gel+Electrophoresis+%28Comet%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay.</a> Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).</li>
<li>Saha, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+DNA+repair+capacity+in+whole+blood+of+patients+with+head+and+neck+cancer+and+healthy+donors+by+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay.</a> Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).</li>
<li>Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+DNA+breaks+and+oxidative+damage+in+polymorphonuclear+and+mononuclear+white+blood+cells%3A+a+novel+approach+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay.</a> Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).</li>
<li>Al-Salmani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+for+the+collection%2C+storage%2C+and+comet+assay+analysis+of+DNA+damage+in+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood.</a> Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).</li>
<li>Akor-Dewu, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucocytes+isolated+from+simply+frozen+whole+blood+can+be+used+in+human+biomonitoring+for+DNA+damage+measurement+with+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay.</a> Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).</li>
<li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CometChip%3A+a+high-throughput+96-well+platform+for+measuring+DNA+damage+in+microarrayed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607(2014).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Reseach+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Karbaschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+major+steps+in+the+conventional+protocol+for+the+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072(2019).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Scientific Reports. 4 (1), 7200(2014).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).</li>
<li>Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).</li>
<li>Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+infection+of+cultured+cells+induces+oxidative+stress+and+attenuates+cellular+base+excision+repair+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutatation+Research%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity.</a> Mutatation Research. 845, 403054(2019).</li>
<li>Møller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+Information+for+Reporting+on+the+Comet+Assay+%28MIRCA%29%3A+recommendations+for+describing+comet+assay+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results.</a> Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).</li>
<li>Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oxaliplatin-induced+DNA+crosslinks+in+vitro+and+in+cancer+patients+using+the+alkaline+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay.</a> DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).</li>
<li>Moneef, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+using+the+alkaline+comet+assay+predict+bladder+cancer+cell+radiosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity.</a> British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).</li>
<li>Bowman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+measures+of+DNA+damage+are+predictive+of+bladder+cancer+cell+treatment+sensitivity+in+vitro+and+outcome+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo.</a> International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).</li>
<li>Abdulwahed, A. M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Investigation+of+DNA+Damage+and+Genomic+Organization+in+the+Cellular+Response+to+Platinum+Chemotherapy%22">Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy</a>. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+Assay+measurements%3A+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comet Assay measurements: a perspective.</a> Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Formation+and+Repair+of+Environmetally-induced+damage+to+Mitochondrial+and+Nuclear+Genomess%22">Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess</a>. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).</li>
</ol>

M. Cooke et M. Karbaschi sont les inventeurs de trois brevets délivrés relatifs aux technologies décrites ici.

Cette étude démontre la polyvalence fournie par l’équipement actuel, qui peut être utilisé pour atteindre un débit élevé avec une variété de variantes représentatives et communes du test cométaire (c.-à-d. alcaline, modifiée par des enzymes, sanguine et ICL, et d’autres variantes conviendront également). En outre, la présente approche présente plusieurs avantages 20,21: a) la durée d’exécution de l’essai est réduite grâce à la manipulation de plusieurs lames en parallèle (le temps de manipulation diminue de60%); b) le risque d’endommagement des gels et, partant, le risque pour l’expérience sont réduits; c) les besoins en réactifs sont réduits (p. ex., le volume du réservoir d’électrophorèse est inférieur à celui du réservoir conventionnel); d) le nombre de diapositives exécutées est augmenté. Un réservoir peut fournir une augmentation de 20% du nombre de glissières par rapport à un seul réservoir conventionnel; Cependant, plusieurs réservoirs d’électrophorèse peuvent fonctionner ou être réduits en esclavage (c.-à-d. plusieurs réservoirs contrôlés par une seule source d’alimentation), en parallèle à partir de la même source d’alimentation, et nécessitent toujours une empreinte de paillasse plus petite qu’un seul réservoir conventionnel avec bac à glace; et e) l’encombrement du réservoir est réduit en raison de l’orientation verticale des glissières et du refroidissement intégré (économise de l’espace de laboratoire); le réservoir HTP comprend une base de refroidissement en céramique haute performance avec un tiroir coulissant qui peut accueillir un pack de refroidissement congelé pour maintenir une température tampon optimale sans avoir à effectuer le processus dans une chambre froide.
De plus, la plaque de refroidissement que nous avons développée accueille 26 lames de comètes, permet une solidification rapide de l’agarose à bas point de fusion sur les lames d’essai de comète et facilite la récupération des lames après solidification du gel d’agarose. Les innovations ci-dessus rendent le processus d’essai des comètes plus simple et plus facile.
Bien que d’autres approches à haut débit aient été mises au point (p. ex., test cométaire sur 12 gels, CometChip ou 96 formats de mini-gel)25, de nombreux scientifiques préfèrent utiliser les lames de microscope conventionnelles (qui comprennent les lames précouchées disponibles dans le commerce ou d’autres lames spécialisées). L’approche actuelle peut s’adapter à tous les types de lames de microscope, ce qui permet d’intensifier les expériences utilisant ces lames grâce à un traitement et une manipulation plus rapides des lames. Comme indiqué ci-dessus, le système de comètes HTP apporte de nombreux avantages, mais il y a une limite notable: l’approche actuelle ne prévoit qu’une augmentation de 20% du nombre d’échantillons exécutés, par rapport à un réservoir horizontal conventionnel (bien que le traitement des lames soit beaucoup plus rapide). Les formats CometChip et 96 mini-gel exécutent un plus grand nombre d’échantillons. À ce jour, nous ne savons pas si l’approche actuelle peut s’adapter aux formats CometChip ou 96 mini-gel, bien que nous prédisions que ce sera le cas. Comme indiqué ci-dessus, le nombre d’échantillons peut être encore augmenté en asservissant les réservoirs à une seule source d’alimentation. Comme pour toutes les approches, il y a toujours une chance de perdre ou d’endommager les gels lors du chargement des échantillons et de leur analyse au microscope, mais cela est davantage dû à une erreur de l’opérateur, et les chances que cela se produise sont minimisées avec l’approche actuelle.
L’utilisation du système de comètes HTP peut grandement aider à analyser les dommages à l’ADN, facilitant l’utilisation du test de comète dans un large éventail d’applications, telles que l’épidémiologie moléculaire, la science de la reproduction masculine, les études de génotoxicologie et la toxicologie environnementale. Cela est particulièrement vrai pour les utilisateurs qui souhaitent bénéficier de tous les avantages d’un débit amélioré et d’une facilité d’utilisation, sans s’éloigner des lames de microscope conventionnelles familières et rentables.

Les cellules sont continuellement exposées à des agents provenant des environnements internes et externes, qui peuvent endommager l’ADN 1,2. Ces dommages peuvent causer une fonction cellulaire aberrante3 et, par conséquent, les dommages à l’ADN peuvent jouer un rôle essentiel dans le développement de nombreuses maladies humaines majeures, par exemple le cancer, les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires et le vieillissement4. Le test des comètes (également appelé électrophorèse sur gel unicellulaire) est une méthode de plus en plus populaire pour détecter et quantifier les dommages à l’ADN cellulaire.
Dans sa forme la plus simple, le test des comètes alcalines (ACA) détecte les ruptures de brins (SB; simples et doubles), ainsi que les sites apyriniques / apyrimidiniques et les sites alcalins-labiles (ALS) qui deviennent tous deux des cassures simple brin dans des conditions alcalines5. Le test de comète à pH neutre peut évaluer les ruptures franches simple et double brin6. En outre, l’ACA, en combinaison avec un certain nombre d’enzymes de réparation de l’ADN, peut détecter une gamme considérable de types de dommages à l’ADN, par exemple, les purines oxydées (identifiées par l’utilisation de l’ADN glycosylase 1 de la 8-oxoguanine humaine; hOGG17); pyrimidines oxydées (à l’aide de l’endonucléase III; EndoIII) et les dimères cyclobutane pyrimidine (utilisant l’endonucléase T4 V; T4endoV)8. Le test des comètes peut également être utilisé pour évaluer les lésions de l’ADN induites par des agents de réticulation, tels que le cisplatine 9,10,11. Comme l’indique le nom officiel de l’essai, c’est-à-dire électrophorèse sur gel unicellulaire, l’essai repose sur le fait que les cellules analysées sont une suspension unicellulaire; Le plus souvent, ce sont des cellules en culture, mais peuvent être isolées du sang total 12,13, ou le sang total lui-même peut être utilisé 14,15. Alternativement, une suspension unicellulaire peut être générée à partir de tissus solides.
À quelques exceptions près, notamment les rapports CometChip du laboratoire Engleward 16, le protocole global de dosage des comètes n’a pas changé radicalement par rapport à celui décrit à l’origine par les inventeurs du test (Östling et Johansson17 et Singh etal.18). Le test des comètes comporte de nombreuses étapes (Figure 1). Bon nombre de ces étapes impliquent le transfert des gels d’agarose minces contenant des cellules, une lame à la fois, et, par conséquent, présentent un risque d’endommagement ou de perte du gel, compromettant le succès de l’expérience. Par conséquent, le test des comètes peut prendre beaucoup de temps, en particulier si un nombre important de lames sont exécutées. En règle générale, un maximum de 40 lames sont exécutées dans un grand réservoir d’électrophorèse (33 cm x 59 cm x 9 cm), qui se trouve dans un plateau encore plus grand contenant de la glace humide pour le refroidissement. Il a été récemment rapporté que la durée du test peut être raccourcie à 1 jour en diminuant la durée de l’étape de lyse et en ne séchant pas les lames avant la coloration19.
Les auteurs actuels ont déjà signalé une nouvelle approche du test de comète alcaline à haut débit (HTP ACA), dans lequel plusieurs lames de microscope d’essai de comètes (lots de 25) peuvent être manipulées simultanément tout au long du processus d’essai des comètes20,21,22. Cette approche brevetée minimise le risque d’endommagement ou de perte des gels contenant des échantillons en éliminant la nécessité de manipuler les lames de microscope individuellement et peut être appliquée à toutes les variantes du test de comète, qui utilisent des lames de microscope. Les racks contenant des lames protègent les gels pendant les manipulations et, par conséquent, le traitement des échantillons est plus rapide et plus efficace. Les glissières peuvent également subir une électrophorèse dans les racks, maintenus dans l’orientation verticale plutôt qu’horizontale. Ceci, ainsi que le refroidissement intégral, réduit considérablement l’empreinte du réservoir d’électrophorèse et élimine le besoin de glace humide. Dans l’ensemble, cela représente une amélioration significative par rapport à la procédure conventionnelle. L’équipement utilisé est illustré à la figure 2. Les protocoles décrits ici, utilisant cette nouvelle approche, démontrent l’application représentative aux cellules cultivées et au sang total14 pour la détection des sites alcalino-labiles (SLA), des liaisons croisées interbrins de l’ADN (ICL) et des substrats de diverses enzymes de réparation de l’ADN.

<table><tbody><tr><td>Lamelles en verre 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>631-0124</td><td></td></tr><tr><td>A2780</td><td>ECACC,&nbsp ; Louis, MO, &nbsp ; États-Unis</td><td>93112519</td><td></td></tr><tr><td>Acide nitrique concentré (grade OptimaTM)</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA</td><td>A467-250</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence équipé d’une caméra</td><td>Zeiss, Jena, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sang total humain frais</td><td>Zen Bio Inc</td><td>SER-WB10ML</td><td>Échantillon commercial de sang total humain</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, San Diego, Californie</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de données</td></tr><tr><td>HTP Comet Assay system</td><td>Cleaver Scientific</td><td>COMPAC-&nbsp ; 50</td><td></td></tr><tr><td>Kératinocytes humains (HaCaTs)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA</td><td>Discontinué</td><td>Peut être acheté auprès d’une autre société ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (H2O2) 30 % dans l’eau</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis</td><td>BP2633-500</td><td></td></tr><tr><td>ICP-MS iCAP RQ Système ICP-MS</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td>IQLAAGGAAQFAQKMBIT</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images et de données</td><td>Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, Angleterre, Royaume-Uni</td><td>125525</td><td>Un logiciel d’analyse d’image gratuit est disponible, par exemple, ImageJ</td></tr><tr><td>Internal Standard Mix</td><td>SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA</td><td>CL-ISM1-500</td><td>Bismuch (isotope surveillé 209 Bi)-concentration de 10 &micro ; g/mL dans 5 % HNO3</td></tr> <tr><td>Point de fusion bas Agarose</td><td>Invitrogen Waltham, MA, USA</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique disodique)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (chlorure de sodium)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td>701-058108</td><td>Nanodrop pour la mesure de la concentration d’ADN</td></tr><tr><td>Système d’eau ultrapure Nanopure Infinity (Barnstead Nanopure)</td><td>Thermo Scientific,&nbsp ; Waltham, MA, USA</td><td>D11901 Eau</td><td>ultrapure (16 M&Omega ; cm-1)</td></tr><tr><td>NaOH (hydroxyde de sodium)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Point de fusion normal Agarose</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>16520100</td><td>Pour le pré-revêtement des lames</td></tr><tr><td>OCI-P5X</td><td>Université de Miami, Miami, FL, États-Unis N</td><td>/A</td><td>L’installation de base de culture de tumeurs vivantes a fourni les cellules</td></tr><tr><td>Platinum (Pt) reference standard</td><td>SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA</td><td>PLPT3-2Y</td><td>(1000 &micro ; g/mL dans 10 % HCl) contenant</td></tr> de <tr><td>l’iodure de propidium Bismuch (1,0 mg/mL dans l’eau)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>12-541BP486410ML</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen Valencia, CA, USA</td><td>51304</td><td>Kit d’extraction d’ADN</td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre monopoli</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ECACC, Louis, MO, USA</td><td>91091004</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à diapositives</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>03-448-2</td><td>Résistant à la lumière, pour protéger les cellules de la formation de dommages fortuits (selon l’opinion largement répandue) et prévenir la décoloration du colorant fluorescent</td></tr><tr><td>Plaque de refroidissement de diapositive</td><td>Cleaver Scientific, Rugby, Angleterre, </td><td>ROYAUME-UNI CSL-CHILLPLATE</td><td></td></tr><tr><td>Plat de traitement</td><td>Cleaver Scientific, Rugby, Angleterre Royaume-Uni</td><td>STAINDISH4X</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA (0,5 %)</td><td>Invitrogen Gibco, Waltham, MA, États-Unis</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Porte-glissière vertical</td><td>Cleaver Scientific, Rugby, Angleterre, UK</td><td>COMPAC-25</td><td></td></tr></tbody></table>

une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’adn cellulaire

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Les cellules sont continuellement exposées à des agents provenant des environnements internes et externes, qui peuvent endommager l’ADN. Ces dommages peuvent causer une fonction cellulaire aberrante et, par conséquent, les dommages à l’ADN peuvent jouer un rôle essentiel dans le développement, éventuellement, de toutes les principales maladies humaines, par exemple le cancer, les maladies neurodégénératives et cardiovasculaires et le vieillissement. L’électrophorèse sur gel unicellulaire (c.-à-d. le test des comètes) est l’une des méthodes les plus courantes et les plus sensibles pour étudier la formation et la réparation d’un large éventail de types de dommages à l’ADN (p. ex. cassures simple et double brin, sites alcalins-labiles, liaisons croisées ADN-ADN et, en combinaison avec certaines enzymes de réparation, purines oxydées et pyrimidines), in vitro et in vivo . Systèmes. Cependant, le faible débit de l’échantillon du test conventionnel et le travail laborieux de l’échantillon limitent l’application la plus large possible. Avec la « notation » des comètes de plus en plus automatisée, la limitation est maintenant la capacité de traiter un nombre important de diapositives de comètes. Ici, une variante à haut débit (HTP) du test de comète (test de comète HTP) a été développée, ce qui augmente considérablement le nombre d’échantillons analysés, diminue le temps d’exécution du test, le nombre de manipulations individuelles de lames, les besoins en réactifs et le risque de dommages physiques aux gels. De plus, l’empreinte du réservoir d’électrophorèse est considérablement réduite en raison de l’orientation verticale des glissières et du refroidissement intégré. Une nouvelle approche pour refroidir les lames d’essai des comètes est également rapportée ici, qui facilite de manière pratique et efficace la solidification des gels de comètes. Ici, l’application de ces dispositifs à des méthodes représentatives de dosage des comètes a été décrite. Ces innovations simples soutiennent grandement l’utilisation du test cométaire et son application à des domaines d’étude tels que la biologie de l’exposition, l’écotoxicologie, la biosurveillance, le dépistage / test de toxicité, ainsi que la compréhension de la pathogenèse.

Optimisation de la tension d’électrophorèse pour le HTP ACA Kératinocytes humains (HaCaTs; Tableau des matériaux) ont été irradiés avec différentes doses de rayonnement ultraviolet A (UVA) (5 ou 10 J/cm2; Figure 6A), UVB (0,5 ou 1 J/cm2 ; Figure 6B), ou traité avec 50 μMH2O2(Figure 6C) pour induire des dommages. Trois tensions différentes de l’électrophorèse ont été testées pour déterminer la tension optimale pour l’électrophorèse. Les résultats des trois traitements endommageant l’ADN ont révélé que, bien que toutes les tensions aient généré des doses-réponses linéaires, la réponse la plus sensible a été obtenue avec 1,19 V / cm. Les HaCaTs ont montré les dommages à l’ADN les plus élevés à l’inclusion en utilisant 1,19 V / cm pendant l’électrophorèse par rapport à 1 V / cm et 1,09 V / cm (Figure 6A-C). De plus, en utilisant 1,19 V/cm, le plus grand % d’ADN de la queue est observé, après tous les traitements dommageables (Figure 6)31.
Détection de dommages à l’ADN dans le sang total humain à l’aide de HTP ACA modifié par Fpg Le sang humain (tableau des matériaux) a été irradié avec différentes doses de 10 J/cm2 UVA pour induire des dommages. Quatre concentrations différentes de Fpg (1, 2, 4 ou 8 U/mL) ont été utilisées pour déterminer la concentration optimale pour le traitement enzymatique dans HTP ACA. Les résultats ont montré que les niveaux optimaux de dommages à l’ADN ont été révélés avec 4 U/mL de Fpg (Figure 7A). Images représentatives de comètes provenant d’échantillons de sang irradié par UVA (figure 7B).
Détection de l’ADN ICL dans une lignée cellulaire représentative de cancer de l’ovaire à l’aide de l’ACA HTP modifié par ICL Une lignée cellulaire de cancer de l’ovaire (SKOV-3; Tableau des matériaux) a été traité avec des combinaisons de 200 μM de cisplatine et/ou un traitement ultérieur avec 50 μM H2O2 pendant 30 min sur glace. Aucun dommage appréciable n’a été observé dans les cellules non exposées (figure 8A). L’exposition àH2O2seule a généré un MOTM significatif (figure 8B). En revanche, les cellules dans lesquelles les LCI ont été induites ont montré une diminution du MOTM (Figure 8C)28.
Formation et réparation de l’ADN ICL induit par le cisplatine dans une lignée cellulaire représentative de cancer de l’ovaire L’ACA HTP modifié par la LCI a été utilisé pour déterminer l’évolution temporelle de la formation et de la réparation de la LCI de l’ADN induite par le cisplatine dans une lignée cellulaire de cancer de l’ovaire (A2780; Tableau des matériaux). Les cellules ont été traitées avec 100 μM de cisplatine pendant 1 h, puis incubées dans un milieu exempt de cisplatine (milieu RPMI 1640 complété par 10% (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS)) pour une évolution ultérieure. À divers moments, l’ACA HTP modifié par la LMIC a été effectuée pour établir les niveaux de LMIC (figure 9)28. Aucune LCI n’a été détectée avant le traitement par cisplatine. Cependant, après un seul traitement avec 100 μM de cisplatine, les niveaux de LCI ont augmenté de manière significative, culminant à 12 heures, après quoi les niveaux sont revenus à zéro après 30 heures.
Corrélation entre l’ADN ICL et les niveaux de platine ADN Trois cellules cancéreuses de l’ovaire ont été traitées avec 100 μM de cisplatine pour induire différents niveaux d’ADN-ICL, avant l’analyse par l’ACA HTP modifié par ICL et la spectrométrie de masse à couplage inductif (ICP-MS; voir le dossier supplémentaire pour plus de détails). Comme le montre la figure 10, différents niveaux d’ADN-ICL ont été induits dans les trois lignées cellulaires, ainsi que différents niveaux de Pt dans l’ADN. Une corrélation positive (R2 = 0,9235) a été observée entre les niveaux d’ADN ICL et les concentrations de platine, indiquant l’association entre les niveaux de platine d’ADN et la CIL28 correspondante.
Réparation de l’excision de base dans les cellules BE-M17 infectées et non infectées par les mycoplasmes Les cellules BE-M17 infectées et non infectées par des mycoplasmes ont été traitées avec 50 μM H 2 O 2 pendant 30 min et incubées avec un milieu complet (milieu d’Eagle modifié de Dulbecco complété par 10% (v/v) FBS) pendant différentes durées (0 min, 30 min, 1 h,2h, 6 h, 24 h ou 30 h) pendant lesquelles les cellules ont été autorisées à se réparer. À chaque point temporel, les cellules ont été collectées et congelées à -80 °C, dans un milieu contenant 10 % de DMSO, avant d’effectuer l’ACA HTP modifié par hOGG1 (étape 6). Après 30 minutes, les niveaux de SB/SLA avaient diminué à 21 % de TD (pourcentage d’ADN de queue) dans les cellules non infectées, tandis que les cellules infectées présentaient 49 % de TD (Figure 11A). Après ~15 h, les niveaux de SB/SLA étaient revenus à la valeur initiale dans les cellules infectées et non infectées. Pour les purines oxydées, le BE-M17 non infecté a d’abord montré une légère augmentation des dommages, avant de revenir à la ligne de base dans les 30 heures (Figure 11B). En revanche, les cellules infectées ont montré une augmentation soutenue et significative des purines oxydées, qui sont restées élevées et ne sont pas revenues aux niveaux de base même après 30 heures (Figure 11B)23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble de la procédure conventionnelle d’essai des comètes alcalines. (i) Une suspension unicellulaire de cellules cultivées ou un échantillon de sang total est mélangé avec de l’agarose LMP à 0,6 % (p/v). ii) Le mélange cellule/agarose est appliqué sur des lames de microscope prérevêtues et recouvert d’une lamelle de couverture jusqu’à solidification. (iii) Les cellules sont lysées à l’aide d’un tampon de lyse à pH élevé pendant la nuit, formant des corps nucléoïdes, avant (iv) le lavage avec ddH2O. (v) L’ADN cellulaire se déroule dans le tampon d’électrophorèse à pH élevé. La présence de ruptures de brins permet à l’ADN de se détendre et de se dérouler, et sous électrophorèse, l’ADN est extrait du corps nucléoïde, formant une queue. Les lames sont ensuite (vi) égouttées, séchées, (vii) neutralisées et (viii) lavées avec duddH2Oavant (ix) séchées pendant une nuit. Les lames sont ensuite (x) réhydratées avec duddH2O, (xi) colorées, (xii) lavées, et enfin (xiii) notées et analysées, généralement à l’aide d’un logiciel de microscopie fluorescente et d’analyse d’images. Ce chiffre est tiré d’une publication précédente20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig02.jpg"> Figure 2 : Les matériaux composant le système d’électrophorèse cométaire à haut débit. Le réservoir d’électrophorèse HTP, les racks HTP et les plats pour la lyse, le lavage, la neutralisation et la coloration sont montrés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives d’une lame d’essai cométaire et d’un rack HTP (support de lame de microscope). (A) Pour une orientation correcte, la face pré-revêtue de la lame de microscope est reconnue par un point noir dans le coin droit d’une lame de microscope. (B) L’image du rack HTP illustre comment les glissières sont maintenues dans une orientation verticale serrée, avec des languettes sur le support pour fixer son orientation dans le réservoir d’électrophorèse. Chaque transporteur peut accueillir jusqu’à 25 glissières. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig04.jpg"> Figure 4 : Représentation de la plaque de refroidissement avec des lames d’échantillon et des blocs de congélation en place. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig05.jpg"> Figure 5: Capture d’écran de comètes représentatives prises lors du scoring. HaCaTs (A) sans traitement et (B) traité avec 1 J/cm2 UVB avant d’effectuer HTP ACA. La plupart des progiciels peuvent calculer une variété de points de terminaison de comètes, mais les plus courants sont le % d’ADN de la queue (préféré) ou le moment de la queue basé sur ces images (bleu : début de la tête, vert : milieu de la tête et violet : fin de la queue). La barre d’échelle est de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig06.jpg"> Figure 6 : Graphiques représentatifs illustrant l’effet de la tension d’électrophorèse sur le pourcentage d’ADN de queue, déterminé à l’aide de l’ACA HTP. Les cellules ont été exposées à (A) 5 ou 10 J/cm2 UVA, (B) 0,5 ou 1,0 J/cm2 UVB, ou (C) 50 μMH2O2avant le HTP ACA, avec une tension d’électrophorèse de 1, 1,09 ou 1,19 V/cm. Les données représentent la moyenne de 200 déterminations à partir de n = 2 expériences en double31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig07.jpg"> Figure 7 : Graphique représentatif et images cométaires du sang humain analysées par le HTP ACA modifié par le Fpg. Des échantillons de sang humain ont été irradiés avec 10 J/cm2 UVA ou irradiés fictivement (« ctrl ») sur de la glace avant l’étape de lyse. Différentes concentrations de Pfg (1, 2, 4 ou 8 U/mL) ont été utilisées pour le traitement enzymatique avant l’électrophorèse. (A) Les données représentent la moyenne ± MEB de 300 déterminations à partir de n = 3 expériences. (B) Images représentatives de comètes pour chaque concentration de Pfg dans 10 J/cm2 échantillons de sang irradié aux UVA. La barre d’échelle est de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig08.jpg"> Figure 8 : Images représentatives des comètes illustrant la détection de la LCI après traitement au cisplatine. (A) cellules témoins sans aucun traitement, (B) cellules qui ont été traitées avec H2O2 (50 μM) seulement, (C) cellules qui ont été traitées avecH2O2(50 μM) et cisplatine (200 μM), montrant que la queue est plus courte que dans (B), en raison de la présence de ICL28. La barre d’échelle est de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig09.jpg"> Figure 9 : Démonstration de la cinétique de la formation et de la réparation de la LCI induite par le cisplatine. Les cellules A2780 ont été traitées avec 100 μM de cisplatine dans le milieu de culture pendant 1 h. Le milieu contenant du cisplatine a ensuite été retiré et les cellules ont été cultivées à différents moments, avant d’être analysées par HTP ACA modifié par ICL. Les données représentent la moyenne ± MEB de n = 3 expériences28. P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig10v2.jpg"> Figure 10 : Corrélation entre la LMIC d’ADN et la concentration de platine. Les ICL d’ADN ont été déterminés par l’ACA HTP modifié par ICL et les niveaux de platine ont été mesurés par ICP-MS (avec Single Quad-Kinetic Energy Discrimination, SQ-KED), dans trois lignées cellulaires de cancer de l’ovaire. R2 = 0,9235. Voir le dossier supplémentaire pour la méthodologie ICP-MS pour quantifier les niveaux de platine dans l’ADN28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig10v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63559/63559fig11.jpg"> Figure 11 : Un graphique représentatif illustrant les dommages et la réparation de l’ADN, déterminés par le test de comète modifié par hOGG1, dans les cellules BE-M17 infectées par Mycoplasma par rapport aux cellules BE-M17 non infectées. Après traitement avec 50 μMH2O2pendant 30 min, les cellules ont été laissées réparer pendant différentes durées (0,30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h ou 30 h). L’ACA HTP modifié par hOGG1 a été utilisé pour mesurer (A) les purines SB/ALS et (B) oxydées dans les cellules BE-M17 infectées (points de données rouges) et non infectées (points de données noirs). Les données représentent la moyenne de 200 déterminations à partir de n = 2 expériences en double. Ce chiffre est reproduit avec la permission d’une publication précédente23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/63559fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Réactif</td>
			<td colspan="2">Solution mère</td>
			<td>Solution de travail</td>
		</tr><tr><td>Tampon de lyse</td>
			<td colspan="2">100 mM Na 2 EDTA, 2,5 M NaCl et 10 mM Tris Base en ddH2O; ajuster le pH à 10 avec 10 M NaOH</td>
			<td>1% Triton X-100 dans la solution mère de lyse</td>
		</tr><tr><td>Tampon d’électrophorèse</td>
			<td colspan="2">10 M NaOH et 200 mMNa2EDTAenddH2O</td>
			<td>300 mM NaOH et 1 mM Na2EDTA; pH &gt; 13</td>
		</tr><tr><td>Tampon de neutralisation</td>
			<td colspan="2">0,4 M Tris Base en ddH2O ; ajuster le pH à 7,5 avec HCl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Tampon de coloration</td>
			<td colspan="2">1 mg/mL d’iodure de propidium</td>
			<td>2,5 μg/mL d’iodure de propidium dansddH2O</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition des réactifs utilisés dans HTP ACA. Les concentrations de stock et de travail des tampons de lyse, d’électrophorèse, de neutralisation et de coloration sont indiquées.
Dossier supplémentaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63559/Supplementary%20information.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le test de comète est un moyen populaire de détecter les dommages à l’ADN. Cette étude décrit une approche pour exécuter des glissements dans des variantes représentatives du test de la comète. Cette approche a considérablement augmenté le nombre d’échantillons tout en réduisant la durée d’exécution des essais, le nombre de manipulations de lames et le risque d’endommagement des gels.

Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Le test des comètes est largement utilisé pour évaluer la génotoxicité. Notre protocole offre un certain nombre d’avantages méthodologiques par rapport au test standard des comètes. Notre technologie est centrée sur le maintien vertical des lames de comètes standard et leur traitement par lots de 25 dans un rack spécialement conçu.Cela inclut l’électrophorèse, de sorte que le réservoir est plus petit, utilise moins de tampon et dispose d’un refroidissement intégré. Maintenus dans un rack, les gels délicats sur les lames sont plus protégés et passent d’une solution à l’autre en 25 secondes. En utilisant notre protocole de comète sanguine, les chercheurs peuvent utiliser une piqûre de sang pour étudier les dommages à l’ADN chez les humains, d’autres espèces et une grande variété d’expositions environnementales potentiellement génotoxiques.Tous les différents formats pour le test cométaire qui utilisent des lames de microscope comme support solide pour les gels de comète sont adaptés à notre approche. La partie cruciale de cette technique consiste à charger des échantillons après mélange avec de l’agarose LMP. Les échantillons doivent être chargés rapidement sans faire de bulles et recouverts immédiatement d’un couvercle avant de se solidifier.Pour commencer, préparez un point de fusion bas de 0,6% agarose dans du PBS et placez-le au bain-marie à 37 degrés Celsius. Étiquetez l’extrémité givrée des lames pré-enduites avec le nom, la date et les informations de traitement à l’aide d’un marqueur permanent ou d’un crayon. Placez une plaque de refroidissement sur un banc plat et insérez deux blocs réfrigérants congelés dans le tiroir coulissant sous la surface métallique.Ensuite, placez les lames sur la plaque de refroidissement pour pré-refroidir pendant une à deux minutes. Centrifuger et retirer le surnageant des tubes d’échantillon et les remettre immédiatement sur la glace. Remettez en suspension la pastille de la cellule avec 200 microlitres d’agarose à bas point de fusion à 0,6% et mélangez par pipetage.Ensuite, ajoutez 80 microlitres de cellules contenant de l’agarose sur une lame réfrigérée et placez rapidement un couvercle sur le gel. Laisser le gel prendre sur la plaque de refroidissement pendant une à deux minutes. En attendant, préparez 500 millilitres de solution de travail de tampon de lyse et versez-la dans le plat de lyse.Une fois les gels pris, retirez rapidement les feuillets de couverture en maintenant doucement la lame entre le pouce et l’index et en faisant glisser le couvercle hors du gel. Ensuite, placez les diapositives à l’intérieur d’un support de diapositive avec toutes les marques de points noirs sur les diapositives orientées dans la même direction. Placez le support de glissière à l’intérieur de l’antenne de lyse.Fermez le couvercle de la boîte de lyse et mettez-le pour l’incubation. Retirez délicatement le support de glissière de la boîte de lyse sans déranger les gels. Placez délicatement le support de glissière dans un plat de lavage préchargé d’eau glacée à double distillation.Assurez-vous que les diapositives sont complètement immergées et quittez la configuration pendant 30 minutes. Placez un pack de refroidissement congelé sous le réservoir d’électrophorèse pour maintenir une température tampon optimale. Ensuite, ajoutez une solution de travail d’électrophorèse glacée au réservoir et transférez-y le support de glissière.Orientez les lames de manière à ce que les gels contenant des cellules pointent vers la cathode. Incuber les lames dans le réservoir d’électrophorèse pendant 20 minutes pour permettre à l’ADN de se détendre. Ensuite, allumez l’alimentation pour effectuer une électrophorèse pendant 20 minutes à 1,19 volts par centimètre.Une fois l’électrophorèse terminée, coupez l’alimentation et retirez le support de glissière du réservoir d’électrophorèse. Laissez le support de glissière s’égoutter sur du papier de soie pendant 30 secondes. Ensuite, placez le support de glissière dans un plat contenant un tampon de neutralisation et laissez-le pendant 20 minutes.Ensuite, placez-le dans un plat de lavage contenant de l’eau glacée à double distillation et laissez-le pendant 20 minutes. Après le lavage, retirez le support de glissière de l’eau et laissez les lames sécher dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pour réhydrater les lames, transférer le support de glissière dans un plat de lavage contenant de l’eau glacée à double distillation et laisser reposer 30 minutes.Ensuite, placez le support de lame dans un plat de coloration contenant 2,5 microgrammes par millilitre de solution d’iodure de propidium. Fermez le couvercle du plat de coloration et incuberez-le pendant 20 minutes à l’obscurité à température ambiante. Après l’incubation, transférez le support de lame dans un plat séparé et lavez-le avec de l’eau glacée à double distillation pendant 20 minutes.Retirez le support de glissière de la capsule et séchez-le complètement dans l’obscurité, soit dans un incubateur à 37 degrés Celsius, soit à température ambiante. Une fois les lames complètement sèches, stockez-les dans une boîte de diapositives dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’analyse de l’image. Les kératinocytes humains ont été irradiés avec différentes doses d’UVA et d’UVB ou traités avec du peroxyde d’hydrogène de 50 micromolaires pour induire des dommages à l’ADN.La tension optimale était de 1,19 volts centimètre, car elle induit la réponse la plus sensible et le plus grand pourcentage d’ADN de queue. Le sang total humain a été irradié avec différentes doses d’UVA et traité avec différentes concentrations de Fpg. Le test de comètes alcalines à haut débit a révélé que les niveaux optimaux de dommages à l’ADN ont été induits avec quatre unités par millilitre de Fpg.La lignée cellulaire de cancer de l’ovaire SK-OV-3 a été traitée avec une combinaison de cisplatine et de peroxyde d’hydrogène. Les cellules non exposées n’ont montré aucun dommage. L’exposition au peroxyde d’hydrogène seul a généré un moment moyen significatif de la queue d’olive par rapport aux cellules dans lesquelles des liaisons croisées intrabrin d’ADN ont été induites.Après un traitement avec du cisplatine 100 micromolaires, les réticulations intrabrin d’ADN ont augmenté avec un pic à 12 heures, après quoi les niveaux ont diminué à zéro après 30 heures Il est essentiel de mettre le sac de glace dans le réservoir d’électrophorèse et d’incuber les lames pendant 20 minutes pour dérouler l’ADN avant l’électrophorèse. Cette étape aidera l’ADN endommagé à voyager par courant. L’exécution du test avec des lames placées verticalement nous a permis d’automatiser le test de la comète.De plus, notre technique a simplifié le test des comètes pour la recherche.

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La vidéo montre le test de comète pour détecter les dommages à l’ADN après une exposition à des agents nocifs. Dans des conditions alcalines, l’ADN se déroule et se dénature, et lors de l’électrophorèse, l’ADN intact et endommagé migre différemment dans le gel d’agarose, formant une structure en forme de comète. L’ADN non endommagé qui migre lentement forme la tête de comète circulaire, tandis que les fragments d’ADN endommagés qui migrent rapidement forment la queue de comète allongée.

Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

Test des comètes mesure cassures de l'ADN induites par différents facteurs. Si tous les facteurs (sauf stress oxydatif) causant des dommages de l'ADN sont maintenus constants, le montant des dommages à l'ADN est un bon paramètre indirect de stress oxydatif. L'objectif de ce protocole est d'utiliser test des comètes pour la mesure indirecte du stress oxydatif.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

Ce protocole est conçu pour étudier l’étendue des dommages à l’ADN survenant lors de la réplication de l’ADN. Dans des conditions neutres, l’induction de cassures de l’ADN peut être facilement évaluée dans un court laps de temps. De plus, le protocole est adaptable à d’autres types de cellules et à divers réactifs de stress de réplication.

Détection de cassures d’ADN dans des cellules humaines en division par dosage de comète neutre

Ce protocole décrit une méthode efficace pour quantifier la différence dans les dommages à l’ADN induits par les inhibiteurs de type I et de type II dans les cellules mutantes FLT3 grâce à l’application du test de comète.

Test de comète pour quantifier les dommages à l’ADN dans les cellules 32D exprimant le mutant FLT3 après une exposition à des inhibiteurs de FLT3 de type I et de type II

GFP-protéines de fusion sont largement utilisés pour visualiser les organites par microscopie confocale. Cependant, le dépistage de mutations qui affectent la morphologie des organites exige généralement mutagenèse individuelle et prend du temps. Ici, nous démontrons une méthode pour intégrer simultanément organite-GFP marqueurs dans près de 5000 gènes non essentiels dans la levure.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Découvrez un protocole de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l'ADN cellulaire. Cette méthode optimise le traitement par lots de 25 échantillons avec refroidissement intégré.

Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire

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