Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec ^{piégeage de 14}CO₂

L’utilisation de différents substrats énergétiques est à la fois spécifique au type de cellule et indicative de la maladie. La mesure de la consommation des substrats spécifiques peut éclairer à la fois la biologie normale et la pathologie. La technique ne nécessite pas d’équipement spécialisé et est facile à mettre à l’échelle.

Il est également plus facile à utiliser que les méthodes publiées précédemment. Comprendre les changements dans le taux d’oxydation du substrat permettra le développement d’interventions diététiques et pharmacologiques pour les troubles métaboliques. Bien que démontrée avec du tissu osseux, cette technique est facilement personnalisée pour étudier la flexibilité métabolique dans tous les types de cellules, ce qui permet de comprendre à la fois les causes et les conséquences des changements métaboliques.

Après avoir sacrifié les chiots de trois à cinq jours postnatals, transférez-les dans une solution antibiotique double de D PBS glacé contenant de la pénicilline streptomycine. Exposez le calvaire en enlevant la peau et les tissus mous. Collectez la région centrale en coupant les tissus environnants de l’arrière vers l’avant dans D PBS.

Grattez doucement les surfaces interne et externe de la calvarie à l’aide d’une pince à épiler pour aider à libérer les cellules lors de la digestion ultérieure. Préparer 2 et 4 milligrammes par millilitre de solutions de collagénase de type deux dans D PBS et filtrer chaque solution avec un filtre frais de 0,22 micromètre. Tout d’abord, digérez la calvaire nettoyée avec deux milligrammes par millilitre de solution de collagénase pendant 15 minutes, puis jetez la solution de digestion.

Ensuite, digérez les échantillons propres dans quatre milligrammes par millilitre de solution de collagénase trois fois pendant 15 minutes à chaque fois. Ensuite, tirez la solution de digestion et enregistrez-la. Filtrer la solution de digestion à travers des tamis cellulaires de 70 micromètres et centrifuger le filtrat à 300 RCF pendant cinq minutes.

Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu alpha MEM complet contenant 10% de FBS et une solution antibiotique double de streptomycine de pénicilline. Comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de 10 centimètres. Cultivez les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours.

Ensuite, dissociez les cellules à 37 degrés Celsius avec 0,25 trypsine EDTA. Après la digestion, comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits avec un milieu alpha MEM complet contenant 10% de FBS et une solution antibiotique double de streptomycine de pénicilline. Ensemencez au moins quatre puits par type de cellule et par substrat, et au moins trois puits supplémentaires pour chaque type de cellule pour le comptage préalable au dosage.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir retiré le muscle et le tissu conjonctif de souris âgées de huit semaines et recueilli les fémurs et les tibias, coupez et jetez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants. Débusquez la moelle osseuse d’un fémur et d’un tibia dans une boîte de Petri fraîche de 10 centimètres avec une seringue équipée d’une aiguille de calibre 23 contenant 15 millilitres de milieu alpha MEM complet avec une solution antibiotique double de streptomycine à 10% de pénicilline FBS et un milieu conditionné à 10% CGM 14 12.

Cultivez les cellules dans la boîte de Pétri dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après trois jours, jetez le milieu de culture et rincez les cellules avec du D PBS. Dissocier les cellules attachées à 37 degrés Celsius avec 0,25% de trypsine EDTA pendant cinq minutes.

Après centrifugation, remettez en suspension la pastille cellulaire dans le milieu BMM. Compter et ensemencer les cellules dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits selon la procédure décrite précédemment. Culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans le milieu BMM avant de commencer les essais.

Lavez les cellules dans les puits supplémentaires deux fois avec D PBS. Dissocier les cellules avec 0,25% de trypsine EDTA. Suspendre 20 microlitres de cellules digérées dans D PBS.

Avec 20 microlitres de solution de colorant à l’orange acridine et à l’iodure de propidium, déterminez le nombre de cellules vivantes avec un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre. Lavez les cellules dans les puits d’essai deux fois avec D PBS. Ajoutez 500 microlitres de milieu chaud à chaque puits d’essai dans la hotte de culture tissulaire désignée RAM.

Après avoir scellé la plaque avec un parafilm, incuber les cellules dans un incubateur désigné RAM à 37 degrés Celsius pendant 4 heures. Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires, légèrement plus grands que la zone à l’intérieur du capuchon du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et insérez le papier bien dans le capuchon. Ajouter 200 microlitres d’un acide perchlorique 1 molaire à chaque tube et 20 microlitres d’hydroxyde de sodium au papier filtre inséré à l’intérieur du bouchon.

Après l’incubation des cellules, transférez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits vers les tubes préparés et fermez immédiatement les bouchons. Laissez les tubes dans un porte-tubes à température ambiante pendant une heure. Pendant l’incubation, Parallelae a mis en place un flacon de scintillation pour chaque tube et l’a rempli de quatre millilitres de liquide de scintillation.

Transférer chaque morceau de papier filtre dans un flacon de scintillation et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie, le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour détecter toute contamination potentielle par la RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons de scintillation contenant du liquide de scintillation.

Mesurez l’activité radio du carbone 14 dans les flacons de scintillation à l’aide d’un compteur de scintillation et enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail, selon les directives de radioprotection, si nécessaire. La figure compare l’oxydation du substrat par les pré-ostéoblastes de calvarie primaire par rapport aux MGM.

Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans un milieu alpha MEM complet pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les pré-ostéoblastes calvariaires sont nettement plus grands que les MMC. Les résultats de l’oxydation du substrat ont montré que le taux d’oxydation de chaque substrat est significativement plus élevé dans les pré-ostéoblastes calvariaires que dans les MGM, ce qui indique probablement une production d’énergie plus élevée par phosphorylation oxydative dans les pré-ostéoblastes.

Le troisième papier inséré doit être légèrement plus grand qu’un capuchon supérieur de tube ebin de 1,7 millilitre. Cette méthode peut être utilisée en conjonction avec la consommation d’oxygène et pour déterminer le taux global de phosphorylation oxydative et de production lactative dans les cellules. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’utilisation du substrat au cours de stades de différenciation distincts ou de contextes pathologiques.

Avec ces connaissances, nous pouvons développer des interventions pour les troubles métaboliques.