Name: Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez une méthode simple pour mesurer l'oxydation des substrats énergétiques in vitro par piégeage du 14CO2. Cette technique adaptable aux différents types cellulaires facilite l'étude des troubles métaboliques.

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Le travail a été soutenu en partie par la subvention R01 AR060456 (FL) des NIH. Nous remercions le Dr Michael Robinson et Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) pour leur généreuse aide avec le compteur de scintillation.

L’utilisation de matières radioactives (RAM) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sûreté désigné dans chaque établissement. Les RAM utilisés dans ce protocole ont été approuvés par Environmental Health &amp; Radiation Safety (EHRS) de l’Université de Pennsylvanie. L’utilisation d’animaux nécessite l’approbation préalable du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement d’origine. L’étude suivante a été approuvée par l’IACUC à l’hôpital pour enfants de Philadelphie.
1. Préparation de solutions mères pour 14substrats marqués C
<ol><li>Préparer une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) de 4 mM en mélangeant 11 g de BSA et 33,1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et en la agitant doucement à température ambiante pendant environ 3 h jusqu’à ce que la BSA soit complètement dissoute. Réchauffer la solution mère BSA dans un bain-marie à 70 °C avant utilisation.</li>
	<li>Sécher à l’air libre 50 μCi 14C-oléate (50 μCi/μmol dans l’éthanol) dans le flacon avec le couvercle fermé pendant 8 h dans une hotte de travail RAM désignée. Ajouter 312,5 μL deH2O puis 3,5 mg (11,5 μmol) d’oléate de sodium. Mélanger.</li>
	<li>Réchauffer la solution obtenue à 70 °C au bain-marie. Ajouter 0,9375 mL de la solution mère de BSA préavertie pour obtenir une solution mère d’oléate chaud de 10 mM (contenant un rapport de 1:11,5 de 14anéate C par rapport à l’oléate non marqué). Aliquotez la solution mère et conservez-la à -20 °C pour une utilisation à long terme.</li>
	<li>Utilisez 14C-glucose et 14C-glutamine directement après la décongélation.</li>
</ol>2. Préparation d’un milieu contenant 14substrats marqués C
REMARQUE: Pour assurer des concentrations fiables de substrats énergétiques dans les milieux, les milieux sur mesure doivent être utilisés avec des substrats frais ajoutés peu de temps avant utilisation. Ici, un milieu essentiel minimum (MEMα) sur mesure sans glucose, pyruvate, glutamine, rouge de phénol ou bicarbonate de sodium est utilisé. Cependant, un milieu optimal doit être déterminé pour chaque type de cellule.
<ol><li>Reconstituer 8,67 g de la poudre moyenne dans 1 L d’eau purifiée. Ajouter 2,2 g de bicarbonate de sodium pour obtenir un pH de 7,4 et filtrer la solution à l’aide d’une filtration sous vide de 0,22 μm.</li>
	<li>Ajouter des ingrédients frais pour obtenir le milieu complet (cMEMα) avec des concentrations finales de 5,5 mM de glucose, 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate et 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Complétez en outre cMEMα avec 100 mM de L-carnitine et 10 μM d’HEPES pour faciliter l’oxydation des acides gras.</li>
	<li>Immédiatement avant utilisation, ajouter 14substrats marqués C au cMEMα fraîchement préparé pour obtenir un milieu chaud. Pour rendre le milieu oléate chaud, ajouter la solution mère d’oléate chaud de 10 mM à cMEMα pour une concentration finale de 100 μM d’oléate (dilution 1:100, radioactivité finale 0,4 μCi/mL). REMARQUE : Le stock d’oléate chaud de 10 mM contenant un rapport de 1:11,5 d’oléate chaud/froid (voir l’étape 1.3) est utilisé pour atteindre un niveau physiologique de 100 μM d’oléate total dans le milieu tout en minimisant la quantité de matière radioactive.</li>
	<li>Préparer 10 mM d’oléate non marqué en ajoutant 24,36 mg d’oléate de sodium à 2 mL deH2O au bain-marie à 70 °C pendant environ 20 min jusqu’à dissolution complète avant de mélanger rapidement avec 6 mL de la solution mère de BSA de 4 mM préavertilée à 70 °C. Transférer dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Aliquote et conserver à -20 °C pour une utilisation à long terme.</li>
	<li>Pour rendre le glucose chaud, ajouter 14C-glucose à une concentration finale de 1,333 μM (dilution 1:4 125, radioactivité finale 0,4 μCi/mL). Pour rendre la glutamine en milieu chaud, ajouter 14C-glutamine à la concentration finale de 2 μM (dilution 1:1 000, radioactivité finale 0,4 μCi/mL).</li>
	<li>Compléter le milieu chaud de glucose et de glutamine avec une solution mère de 10 mM d’oléate non marqué de l’étape 2.4 pour atteindre la concentration finale de 100 μM d’oléate, la même que celle du milieu chaud oléate.</li>
</ol>3. Préparation des cellules
REMARQUE: Les préostéoblastes calvariaires et les macrophages de la moelle osseuse sont utilisés comme exemples ici. Les utilisateurs doivent préparer le type de cellule de leur choix selon les protocoles appropriés. Optimiser la concentration de collagénase II à utiliser pour la digestion dans des expériences pilotes, car l’activité enzymatique peut varier d’un lot à l’autre.
<ol><li>Isolement et culture des préostéoblastes calvariaires<ol>
<li>Sacrifiez les chiots du jour postnatal 3-5 (P3-5) par décapitation et transférez-les dans un DPBS glacé contenant de la pénicilline-streptomycine (P / S).</li>
		<li>Exposez le calvaire en enlevant la peau et les tissus mous. Prélever la région médiane en coupant les tissus environnants de l’arrière vers l’avant dans le DPBS (Figure 1A). Grattez doucement les surfaces interne et externe de la calvarie à l’aide d’une pince à épiler pour aider à libérer les cellules lors de la digestion ultérieure.</li>
		<li>Préparer une solution de 2 mg/mL et une solution de 4 mg/mL de collagénase de type II dans du DPBS et filtrer chaque solution avec un filtre frais de 0,22 μm. Digérer d’abord la calvaire nettoyée avec la solution de collagénase de 2 mg/mL pendant 15 min et jeter la solution de digestion. Digérer les échantillons nettoyés dans une solution de collagénase de 4 mg/mL 3 fois pendant 15 min à chaque fois, en regroupant et en sauvegardant la solution de digestion.</li>
		<li>Filtrer la solution de digestion à travers des tamis cellulaires de 70 μm et centrifuger le filtrat à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille de cellule en cMEMα (voir étape 2.2) contenant 10 % de FBS et de P/S.</li>
		<li>Compter et ensemencer les cellules à 4 × 104 cellules/cm2 dans des plaques de 10 cm. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 3 jours.</li>
		<li>Dissocier les cellules à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Compter et ensemencer les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits avec cMEMα contenant 10% de FBS et P/S à 7,5 × 105/cm2. Ensemencez au moins 4 puits par type de cellule et par substrat et au moins trois puits supplémentaires pour chaque type de cellule pour le comptage cellulaire avant le test.</li>
		<li>Cultiver les cellules à 37 °C pendant la nuit avant les essais d’oxydation du substrat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolement et culture des BMM REMARQUE: La culture des MMO nécessite un facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), qui peut être acheté commercialement en tant que protéine recombinante. Le milieu conditionné de la lignée cellulaire CMG14-12 conçu pour exprimer le M-CSF est une alternative économique utilisée ici13.<ol>
<li>Recueillir les fémurs et les tibias de souris de 8 semaines après avoir enlevé le muscle et les tissus conjonctifs. Coupez et jetez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants.</li>
		<li>Débusquez la moelle osseuse d’un fémur et d’un tibia dans une boîte de Petri de 10 cm avec une seringue équipée d’une aiguille de 23 G contenant 15 mL de cMEMα avec 10% de FBS, P / S et 10% de milieu conditionné CMG14-12 (milieu BMM). Cultiver les cellules dans la boîte de Pétri dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2.</li>
		<li>Après 3 jours, jeter le milieu de culture et rincer avec du DPBS. Dissocier les cellules attachées à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 5 min. Centrifuger et remettre en suspension la pastille de cellule dans le milieu BMM.</li>
		<li>Compter et ensemencer les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits à 7,5 × 105/cm2 de la même manière que celle décrite au point 3.1.6. Culture à 37 °C pendant la nuit dans le milieu BMM avant de commencer les essais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Dosage d’oxydation du substrat avec piège à CO2
REMARQUE: Une densité d’ensemencement appropriée doit être déterminée pour chaque type de cellule afin d’atteindre une confluence de 80 à 90% avant le début de l’essai. Notez que la densité cellulaire peut affecter l’état métabolique des cellules.
<ol><li>Lavez les cellules dans les puits supplémentaires deux fois avec DPBS. Dissocier les cellules avec 0,25 % de trypsine-EDTA et mélanger des cellules de 20 μL remises en suspension dans du DPBS avec 20 μL de solution de colorant commercial prêt à l’emploi d’acridine orange/iodure de propidium (AO/PI). Déterminez le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre pour les calculs finaux.</li>
	<li>Lavez les cellules dans les puits d’essai deux fois avec DPBS. Ajouter 500 μL de milieu chaud à chaque puits d’essai dans la hotte de culture tissulaire désignée ram. Scellez les plaques avec un parafilm et incubez les cellules dans un incubateur désigné RAM à 37 °C pendant 4 h.</li>
	<li>Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires légèrement plus grands que la zone à l’intérieur du capuchon des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et insérez le papier bien dans le capuchon (Figure 1B). Ajouter 200 μL d’acide perchlorique 1 M dans chaque tube et 20 μL d’hydroxyde de sodium sur le papier filtre inséré à l’intérieur du bouchon.</li>
	<li>Après l’incubation des cellules, transférer 400 μL de milieu de culture de chaque puits vers les tubes préparés et fermer immédiatement les bouchons. Laisser les tubes dans un porte-tubes à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Pendant l’incubation, installez un flacon de scintillation pour chaque tube et remplissez-le de 4 mL de liquide de scintillation. Transférer chaque morceau de papier filtre dans un flacon de scintillation et incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie (utilisé pour la préparation de 14C-oléate), le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour une contamination potentielle par la RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons de scintillation contenant du liquide de scintillation.</li>
	<li>Mesurez la radioactivité de 14C dans les flacons de scintillation avec un compteur de scintillation. Enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail selon les directives de radioprotection si nécessaire.</li>
</ol>5. Analyse des données
REMARQUE: En supposant que chaque substrat est complètement oxydé pour libérer du CO2, le taux d’oxydation du substrat peut être calculé à partir de la radioactivité du CO2 piégé.
<ol><li>Calculez le taux d’oxydation du substrat à l’aide de Eq (1) et des valeurs X, Y et Z indiquées dans le tableau 1 pour différents substrats. Taux d’oxydation du substrat (μmol/cellule/h) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg">   (1)<ol>
<li>Calculer les désintégrations totales par min (DPM) pour chaque puits de réaction. Pour X, utilisez la valeur DPM (lecture du compteur de scintillation) à partir de 0,4 mL du milieu réactionnel utilisé pour le piégeage du CO2 sur 0,5 mL du milieu réactionnel total. Par conséquent, le DPM total de chaque puits de réaction est de X × 1,25.</li>
		<li>Divisez le DPM total par un facteur de 2 220 000 pour convertir en μCi.</li>
		<li>Convertir la radioactivité en μCi en nombre de 14molécules marquées C. Divisez la valeur μCi par l’activité spécifique (Y) de chaque substrat marqué. Utilisez les valeurs Y suivantes (tableau 1) : 14C-glucose : 300 mCi/mmol ; 14 C-glutamine : 200 mCi/mmol ; 14 C-oléate : 50 mCi/mmol.</li>
		<li>Calculer le nombre total de molécules oxydées à partir des 14molécules oxydées marquées C en multipliant ces dernières par le facteur de dilution chaud à total (Z). Utilisez les valeurs Z suivantes (tableau 1) : Glucose : 4 125; glutamine : 1 000; oléate: 12,5.</li>
		<li>Divisez le produit résultant par nombre de cellules (cellule#) et 4 (pour un temps de réaction de 4 h) pour déterminer le taux d’oxydation du substrat par cellule. Utilisez la cellule# déterminée dans les puits parallèles au début de l’essai.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le protocole fournit une méthode facile à utiliser pour déterminer le taux d’oxydation des principaux substrats énergétiques. C’est une alternative plus simple aux autres protocoles qui utilisent des flacons contenant un puits central et coiffés de bouchons en caoutchouc 14,15,16. Bien que l’exemple d’étude ici soit réalisé avec une culture cellulaire, la méthode peut être facilement adaptée pour les explantes tissulaires ou les...

La phosphorylation oxydative (OXPHOS) chez les eucaryotes est le processus par lequel les nutriments sont décomposés à l’intérieur des mitochondries pour libérer de l’énergie chimique sous forme d’ATP par la consommation d’oxygène.  Le catabolisme de divers substrats à l’intérieur des mitochondries par le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) génère directement peu de molécules d’ATP, mais stocke plutôt de l’énergie par réduction des transporteurs d’électrons nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et flavine adénine dinucléotide (FAD+). Les porteurs réduits sont ensuite oxydés par ETC situé sur la membrane interne des mitochondries pour générer un gradient de concentration de protons à travers la membrane. Les protons finissent par descendre leur gradient dans la matrice mitochondriale à travers l’ATP synthase pour produire de l’ATP. OXPHOS est le moyen le plus efficace de production d’ATP à partir de substrats énergétiques et généralement préféré dans les environnements aérobies. Auparavant, la glycolyse aérobie - la production de lactate à partir du glucose alors que l’oxygène est présent - était considérée comme physiopathologique, souvent une caractéristique des cellules cancéreuses. De plus en plus, on découvre que certains types de cellules normales utilisent la glycolyse aérobie pour des raisons qui n’ont pas encore été entièrement déchiffrées.
La flexibilité métabolique est la capacité des cellules ou des organismes à s’adapter à l’évolution des demandes d’énergie et des sources de carburant disponibles. Par exemple, la demande énergétique du muscle squelettique est principalement satisfaite par OXPHOS à l’état d’équilibre mais par la glycolyse anaérobie lors d’exercices de haute intensité1. À mesure que la durée de l’exercice augmente, l’oxydation du glucose et des acides gras contribue davantage à la production globale d’énergie2. Cependant, l’utilisation du substrat ne dépend pas seulement de la disponibilité, car les substrats rivalisent de manière antagoniste lors de l’oxydation. Plus particulièrement, il a été démontré que l’oxydation des acides gras inhibe l’utilisation du glucose par le muscle squelettique dans un phénomène connu sous le nom d’effet Randle3. Un effet réciproque a été démontré par des études ultérieures 4,5. En outre, de nombreuses maladies sont associées à un changement de préférence de substrat et au développement d’une rigidité métabolique dans les cellules. Par exemple, l’oxydation des acides gras est réduite dans le muscle squelettique des patients diabétiques de type II par rapport aux sujets témoins normaux6. Les changements métaboliques dans les contextes de la maladie font l’objet d’une enquête intense car ils peuvent contribuer à la pathogenèse.
Le métabolisme énergétique dans les types de cellules squelettiques est relativement peu étudié, mais a attiré l’attention ces dernières années7. Des travaux antérieurs ont montré que la glycolyse aérobie est la voie énergétique dominante dans les ostéoblastes calvariaires, tandis que l’oxydation du glucose par le cycle TCA joue un rôle dans la formation d’ostéoclastes 8,9. D’autres ont fourni des preuves que les acides gras étaient une source d’énergie pour les ostéoblastes10. Il a également été démontré que le catabolisme de la glutamine favorise la différenciation des ostéoblastes par rapport aux progéniteurs11,12. Cependant, une compréhension globale de l’utilisation du substrat par divers types de cellules squelettiques fait encore défaut. En outre, les changements dans le métabolisme cellulaire au cours de la différenciation cellulaire ou en réponse à des signaux pathologiques devraient modifier l’utilisation du substrat de carburant. Décrit ci-dessous est un protocole facile à utiliser pour tester l’oxydation du substrat in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m filtres</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Utilisé pour filtrer la solution BSA</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Dissocier les cellules des plaques de culture cellulaire</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes Eppendorf</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>Utilisé pour l’incubation réactionnelle</td></tr><tr><td>Plaques de 10 cm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Seringue 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td>Utilisé pour rincer la moelle osseuse des os longs</td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td>Pour la préparation de milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>14C-Glucose</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>Utilisé pour fabriquer des milieux</td></tr> <tr><td>chauds14C-glutamine</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>Utilisé pour fabriquer des milieux</td></tr> <tr><td>chauds14C-oléate</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>Utilisé pour fabriquer des supports chauds</td></tr><tr><td>Aiguille 23 G</td><td>BD</td><td>305120</td><td>Utilisé pour rincer la moelle des os longs Plaques</td></tr> à <tr><td>24 puits</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Utilisé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>70 &mu ; Passoires à cellules m</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>Utilisé pour filtrer le surnageant pendant la digestion cavariale</td></tr><tr><td>Colorant Acridine Orange/Iodure de propidium (AO/PI)</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>Colore les cellules vivantes pour déterminer la densité des graines</td></tr><tr><td>Sérum bovin Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>Utilisé pour la conjugaison des acides gras</td></tr><tr><td>Cellomètre Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>Déterminer le nombre de cellules viables</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>Utilisé pour granuler les cellules</td></tr><tr><td>Collagénase de type II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Dissocier les cellules du tissu</td></tr><tr><td>Custom MEM alpha</td><td>GIBCO</td><td>SKU : ME 18459P1</td><td>Utilisé pour créer des milieux chauds personnalisés</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Utilisé pour dissoudre et diluer les réactifs, et laver les plats de culture</td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Pièges à CO2 avec hydroxyde de sodium</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>Utilisé pour fabriquer des supports personnalisés</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Traps CO2 pendant la culture cellulaire</td></tr><tr><td>L-carnitine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>Supplémenté pour l’oxydation des acides gras</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>Utilisé pour fabriquer des milieux personnalisés</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>Milieu de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney Plastic Packaging</td><td>PM998</td><td>Utilisé pour sceller les boîtes de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Empêche la contamination dans la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acide perchlorique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>Libère du CO2 lors d’un dosage métabolique</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>Utilisé pour fabriquer des supports personnalisés</td></tr><tr><td>Compteur de scintillation</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td>Détermine la radioactivité du papier filtre</td></tr><tr><td>Fluide à scintillation</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>Absorber l’énergie émise par les RAM et la réémettre sous forme d’éclairs de lumière</td></tr><tr><td>Fiole à scintillation</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>Récipients de réaction pour fluide à scintillation</td></tr><tr><td>Carbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Tampon d’équilibre pour hydroxyde de</td></tr><tr><td>sodium</td> moyen <td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>Piège le CO2 pendant le dosage de l’oléate</td></tr> <tr><td></td><td>de sodiumSANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA préparation d’acides gras conjugués</td></tr><tr><td>Filtration sous vide 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>Filtre cMEM&alpha ;</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14co2

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Les mitochondries hébergent la machinerie du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et de la chaîne de transport d’électrons (ETC), qui génèrent de l’adénosine triphosphate (ATP) pour maintenir l’homéostasie énergétique. Le glucose, les acides gras et les acides aminés sont les principaux substrats énergétiques alimentant la respiration mitochondriale dans la plupart des cellules somatiques. Les preuves montrent que différents types de cellules peuvent avoir une préférence distincte pour certains substrats. Cependant, l’utilisation du substrat par diverses cellules du squelette n’a pas été étudiée en détail. De plus, comme le métabolisme cellulaire est adapté aux changements physiologiques et physiopathologiques, des évaluations directes de la dépendance au substrat dans les cellules squelettiques peuvent fournir des informations importantes sur la pathogenèse des maladies osseuses.
Le protocole suivant est basé sur le principe de la libération de dioxyde de carbone par les molécules de substrat après phosphorylation oxydative. En utilisant des substrats contenant des atomes de carbone marqués radioactivement (14C), la méthode fournit un test sensible et facile à utiliser pour le taux d’oxydation du substrat en culture cellulaire. Une étude de cas avec des préostéoblastes calvariaires primaires par rapport à des macrophages dérivés de la moelle osseuse (MGM) démontre une utilisation différente des principaux substrats entre les deux types de cellules.

Dans cet exemple, la méthode de piégeage du CO2 est utilisée pour comparer l’oxydation du substrat par les préostéoblastes calvariaires primaires par rapport aux MBM, qui sont fréquemment utilisés pour la différenciation in vitro des ostéoblastes ou des ostéoclastes, respectivement. Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans cMEMα pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de la confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les préostéoblastes calvaria...

Ce protocole décrit une méthode facile à utiliser pour examiner l’oxydation du substrat en suivant la production de 14CO2 in vitro.

Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

L’utilisation de différents substrats énergétiques est à la fois spécifique au type de cellule et indicative de la maladie. La mesure de la consommation des substrats spécifiques peut éclairer à la fois la biologie normale et la pathologie. La technique ne nécessite pas d’équipement spécialisé et est facile à mettre à l’échelle.Il est également plus facile à utiliser que les méthodes publiées précédemment. Comprendre les changements dans le taux d’oxydation du substrat permettra le développement d’interventions diététiques et pharmacologiques pour les troubles métaboliques. Bien que démontrée avec du tissu osseux, cette technique est facilement personnalisée pour étudier la flexibilité métabolique dans tous les types de cellules, ce qui permet de comprendre à la fois les causes et les conséquences des changements métaboliques.Après avoir sacrifié les chiots de trois à cinq jours postnatals, transférez-les dans une solution antibiotique double de D PBS glacé contenant de la pénicilline streptomycine. Exposez le calvaire en enlevant la peau et les tissus mous. Collectez la région centrale en coupant les tissus environnants de l’arrière vers l’avant dans D PBS.Grattez doucement les surfaces interne et externe de la calvarie à l’aide d’une pince à épiler pour aider à libérer les cellules lors de la digestion ultérieure. Préparer 2 et 4 milligrammes par millilitre de solutions de collagénase de type deux dans D PBS et filtrer chaque solution avec un filtre frais de 0,22 micromètre. Tout d’abord, digérez la calvaire nettoyée avec deux milligrammes par millilitre de solution de collagénase pendant 15 minutes, puis jetez la solution de digestion.Ensuite, digérez les échantillons propres dans quatre milligrammes par millilitre de solution de collagénase trois fois pendant 15 minutes à chaque fois. Ensuite, tirez la solution de digestion et enregistrez-la. Filtrer la solution de digestion à travers des tamis cellulaires de 70 micromètres et centrifuger le filtrat à 300 RCF pendant cinq minutes.Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu alpha MEM complet contenant 10% de FBS et une solution antibiotique double de streptomycine de pénicilline. Comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de 10 centimètres. Cultivez les cellules dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours.Ensuite, dissociez les cellules à 37 degrés Celsius avec 0,25 trypsine EDTA. Après la digestion, comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits avec un milieu alpha MEM complet contenant 10% de FBS et une solution antibiotique double de streptomycine de pénicilline. Ensemencez au moins quatre puits par type de cellule et par substrat, et au moins trois puits supplémentaires pour chaque type de cellule pour le comptage préalable au dosage.Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir retiré le muscle et le tissu conjonctif de souris âgées de huit semaines et recueilli les fémurs et les tibias, coupez et jetez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants. Débusquez la moelle osseuse d’un fémur et d’un tibia dans une boîte de Petri fraîche de 10 centimètres avec une seringue équipée d’une aiguille de calibre 23 contenant 15 millilitres de milieu alpha MEM complet avec une solution antibiotique double de streptomycine à 10% de pénicilline FBS et un milieu conditionné à 10% CGM 14 12.Cultivez les cellules dans la boîte de Pétri dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après trois jours, jetez le milieu de culture et rincez les cellules avec du D PBS. Dissocier les cellules attachées à 37 degrés Celsius avec 0,25% de trypsine EDTA pendant cinq minutes.Après centrifugation, remettez en suspension la pastille cellulaire dans le milieu BMM. Compter et ensemencer les cellules dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits selon la procédure décrite précédemment. Culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans le milieu BMM avant de commencer les essais.Lavez les cellules dans les puits supplémentaires deux fois avec D PBS. Dissocier les cellules avec 0,25% de trypsine EDTA. Suspendre 20 microlitres de cellules digérées dans D PBS.Avec 20 microlitres de solution de colorant à l’orange acridine et à l’iodure de propidium, déterminez le nombre de cellules vivantes avec un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre. Lavez les cellules dans les puits d’essai deux fois avec D PBS. Ajoutez 500 microlitres de milieu chaud à chaque puits d’essai dans la hotte de culture tissulaire désignée RAM.Après avoir scellé la plaque avec un parafilm, incuber les cellules dans un incubateur désigné RAM à 37 degrés Celsius pendant 4 heures. Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires, légèrement plus grands que la zone à l’intérieur du capuchon du tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et insérez le papier bien dans le capuchon. Ajouter 200 microlitres d’un acide perchlorique 1 molaire à chaque tube et 20 microlitres d’hydroxyde de sodium au papier filtre inséré à l’intérieur du bouchon.Après l’incubation des cellules, transférez 400 microlitres de milieu de culture de chaque puits vers les tubes préparés et fermez immédiatement les bouchons. Laissez les tubes dans un porte-tubes à température ambiante pendant une heure. Pendant l’incubation, Parallelae a mis en place un flacon de scintillation pour chaque tube et l’a rempli de quatre millilitres de liquide de scintillation.Transférer chaque morceau de papier filtre dans un flacon de scintillation et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie, le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour détecter toute contamination potentielle par la RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons de scintillation contenant du liquide de scintillation.Mesurez l’activité radio du carbone 14 dans les flacons de scintillation à l’aide d’un compteur de scintillation et enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail, selon les directives de radioprotection, si nécessaire. La figure compare l’oxydation du substrat par les pré-ostéoblastes de calvarie primaire par rapport aux MGM.Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans un milieu alpha MEM complet pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les pré-ostéoblastes calvariaires sont nettement plus grands que les MMC. Les résultats de l’oxydation du substrat ont montré que le taux d’oxydation de chaque substrat est significativement plus élevé dans les pré-ostéoblastes calvariaires que dans les MGM, ce qui indique probablement une production d’énergie plus élevée par phosphorylation oxydative dans les pré-ostéoblastes.Le troisième papier inséré doit être légèrement plus grand qu’un capuchon supérieur de tube ebin de 1,7 millilitre. Cette méthode peut être utilisée en conjonction avec la consommation d’oxygène et pour déterminer le taux global de phosphorylation oxydative et de production lactative dans les cellules. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’utilisation du substrat au cours de stades de différenciation distincts ou de contextes pathologiques.Avec ces connaissances, nous pouvons développer des interventions pour les troubles métaboliques.

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