Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Le profilage spatial numérique, ou DSP, offre une méthode efficace de quantification des protéines stratifiées spatialement. Sa mise en œuvre nous permet de caractériser l’expression des protéines dans des régions distinctes d’une tumeur et du microenvironnement. Une caractéristique clé de DSP est sa capacité de multiplexage, permettant un traitement de données à haut débit.

La possibilité de définir des régions d’intérêt personnalisées fournit en outre une dimension spatiale à l’analyse des données. Le DSP peut être appliqué à tout échantillon dans lequel la quantification spatiale de la protéine ou l’expression de l’ARN peut aider à élucider un processus pathologique ou physiologique. Ceci est particulièrement pertinent en oncologie, où la variabilité régionale de la cible peut être corrélée à une croissance maligne ou à une invasion.

Scott Palisoul, histotechnologue, et Rachael Barney, technologue en génomique, feront la démonstration de la procédure. Pour préparer les lames, commencez par prélever plusieurs carottes de deux millimètres de chaque biopsie et placez-les dans un seul bloc de microréseau tissulaire. Coupez des sections de quatre microns du bloc et montez-les sur des lames de verre.

Placez chaque lame à l’intérieur du joint du porte-lames et incuberez-la à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Dans le système IHC semi-automatisé, remplissez le récipient en première position avec 150 microlitres de tampon de lavage par lame, plus cinq millilitres de volume mort, et laissez le couvercle ouvert. Remplissez la même quantité de solution de blocage dans le récipient en position deux.

Chargez le bac du récipient de réactif sur la machine. Sélectionnez le processus IHC, suivi du blocage du nom de la solution dans la liste déroulante du champ Marqueur. Une fois toutes les diapositives terminées, cliquez sur Fermer.

Cliquez ensuite sur Imprimer les étiquettes, cochez Toutes les étiquettes de diapositives non encore imprimées, puis cliquez sur Imprimer. Apposez des étiquettes sur le haut des diapositives. Chargez les lames sur le plateau de glissière, en veillant à ce que l’échantillon et l’étiquette soient orientés vers le haut.

Appuyez sur le bouton LED pour abaisser le plateau et permettre à l’instrument de commencer la numérisation et la reconnaissance des diapositives. Cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’expérience. Une fois l’exécution terminée, appuyez sur le bouton LED lorsqu’il clignote en vert.

Retirez le plateau de l’instrument et soulevez délicatement les carreaux de couvercle de chaque glissière. Placez les lames dans la solution saline tamponnée au phosphate 1X. Retirez l’excès de tampon et délimitez chaque section de tissu avec un stylo hydrophobe pour créer une barrière hydrophobe.

Faire une solution d’oligo PC anticorps en ajoutant huit microlitres de chaque anticorps par lame et en utilisant Buffer W pour atteindre un volume final de 200 microlitres. Ensuite, appliquez la solution oligo d’anticorps PC sur les lames et incuber les lames pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, placez les lames dans un plateau humidifié et lavez trois fois pendant 10 minutes dans 1X TBST.

Post-fixation dans 4% de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à température ambiante, suivi d’un lavage deux fois pendant cinq minutes dans 1X TBST. Ajouter la coloration nucléaire SYTO 13 pendant 15 minutes à température ambiante, puis laver deux fois avec 1X TBST. Passez la souris sur Collecte de données dans le Centre de contrôle et sélectionnez Nouveau ou Continuer l’exécution.

Placez la diapositive dans le porte-diapositive avec l’étiquette vers l’utilisateur. Abaissez la pince du plateau coulissant, en veillant à ce que le tissu soit visible dans la fenêtre allongée. Ajoutez six millilitres de Buffer S.Suivez les instructions du Centre de contrôle.

Effectuez un zoom entre différents axes à l’aide des curseurs x et y pour délimiter une région à numériser. Sélectionnez Scan, puis laissez l’analyse se poursuivre jusqu’à ce que toute la zone cible définie ait été imagée. Générez une image 20 fois.

Définissez les ROI en sélectionnant trois ROI circulaires de taille égale d’un diamètre de 250 micromètres pour chaque noyau tissulaire. Approuvez le retour sur investissement en cliquant sur le bouton Quitter l’espace de travail d’analyse. Attendez ensuite que la lumière UV clive les oligos des anticorps.

Une fois le processus de nettoyage de l’instrument terminé, sélectionnez Nouvelle collecte de données pour continuer avec les diapositives ou la plaque actuelles. Ouvrez la fenêtre de la plaque finalisée en double-cliquant sur la zone de l’icône de la plaque. Entrez le numéro de lot du pack de codes d’hybridation et cliquez sur Mettre à jour.

Cliquez ensuite sur Finaliser. Détachez le support de glissière et la plaque de collecte en suivant les instructions. Conservez les lames dans TBST ou recouvrez-les d’un milieu aqueux et d’un couvercle pour un stockage à long terme.

Scellez les plaques à l’aide d’un joint perméable et séchez les aspirats à 65 degrés Celsius dans un thermocycleur avec le couvercle ouvert. Ajouter sept microlitres d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle et mélanger. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes, puis tourner rapidement.

Préparez le mélange de tampons de sonde en choisissant les équations appropriées de la sonde R et de la sonde U en appliquant l’équation décrite dans le protocole texte. Ajouter 84 microlitres de mélange tampon de sonde à chaque paquet de codes d’hybridation. Dans une nouvelle plaque d’hybridation de 96 puits, ajouter huit microlitres de chaque mélange maître de code d’hybridation dans les 12 puits de la rangée indiquée.

Transférer sept microlitres de la plaque de collecte DSP au puits correspondant dans la plaque d’hybridation. Thermoscellez, faites tourner la plaque et incuberez-la pendant la nuit à 67 degrés Celsius. Après l’incubation, refroidissez l’assiette sur de la glace et faites tourner rapidement.

Regrouper les produits d’hybridation de chaque puits dans un tube en bande, en pipetant doucement chaque puits cinq fois. Faites tourner vers le bas et chargez les tubes de bande dans le système d’analyse. Sur l’instrument DSP, enregistrez le fichier CDF sur une clé USB et transférez les données vers l’analyseur numérique.

À l’écran, appuyez sur Démarrer le traitement. Sélectionnez Haute sensibilité puis Suivant. Appuyez sur Sélectionner tout pour le nombre de puits contenant des échantillons, puis sur Terminer, puis sur Suivant dans la notification par e-mail.

Cliquez ensuite sur Démarrer. Une fois la station de préparation terminée, scellez la cartouche et transférez-la dans l’analyseur numérique. Appuyez sur Commencer le décompte.

Sélectionnez Position de la scène. Appuyez sur Charger le fichier CDF existant et sélectionnez Fichier précédemment téléchargé. Appuyez sur Terminé.

Sélectionnez à nouveau Position de la scène, appuyez sur Terminé, puis sur Démarrer pour exécuter le programme. Enregistrez le fichier ZIP des fichiers de conversion du décompte du rapporteur du système d’analyse sur une clé USB. Insérez le lecteur dans la machine DSP.

Dans le Centre de contrôle DSP, passez la souris sur Collecte de données, puis cliquez sur Télécharger des comptes. Sélectionnez le fichier ZIP approprié. Cliquez sur Enregistrements dans le centre de contrôle DSP.

Pour afficher les analyses dans la file d’attente, sélectionnez Ajouter les analyses sélectionnées à la file d’attente, puis Ma file d’attente d’analyse. Sélectionnez Nouvelle étude dans la file d’attente en survolant l’option Analyse des données dans le Centre de contrôle. L’expérience DSP a été réalisée sur des échantillons de glioblastome, et les résultats ont été visualisés sous forme de carte thermique.

Les lignes représentent les cibles protéiques, et chaque colonne correspond à une région d’intérêt. Le niveau d’expression est représenté par une gamme de couleurs variant du bleu, montrant une expression faible, au rouge, ce qui indique une expression élevée. La variabilité de la couleur au sein d’une rangée reflète l’hétérogénéité régionale des protéines et suggère une association spatiale possible avec l’expression différentielle des protéines.

Dans cette expérience, S100 et CD-56 étaient universellement élevés, car ce sont des marqueurs neuronaux. Les marqueurs présentant la plus grande variabilité comprennent B7-H3, KI-67, CD-44 et la fibronectine, qui sont connus pour être associés à la prolifération tumorale, à la migration et aux métastases. À partir d’un large éventail de cibles candidates, DSP peut identifier celles qui présentent des variations régionales importantes.

Cela jette les bases de l’étude des facteurs associés à la variabilité et de leur pertinence pour la maladie.