Name: Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Découvrez le protocole SiMPull pour quantifier la phosphorylation des protéines à l'échelle moléculaire unique. Cette méthode améliore le marquage des anticorps et réduit l'autofluorescence.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 et R01CA248166 à DSL. EMB a été soutenu par le programme ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) et JAR par le programme UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Nous remercions l’utilisation de la ressource partagée de microscopie à fluorescence du Comprehensive Cancer Center de l’Université du Nouveau-Mexique, soutenue par NIH P30CA118100. Nous tenons à remercier les Drs Ankur Jain et Taekijip Ha, dont le développement original de SiMPull a inspiré ce travail. ES-C adresse actuelle: Groupe immunodynamique, Laboratoire d’immunologie intégrative du cancer, Centre de recherche sur le cancer, Institut national du cancer, Bethesda

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
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<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici a été optimisé pour permettre des mesures quantitatives de la phosphorylation des récepteurs au niveau d’une seule protéine. Plusieurs modifications simples mais importantes du protocole SiMPull ont été développées pour améliorer la fiabilité de la mesure pour la détection de la phospho-tyrosine, y compris la réduction de l’autofluorescence avec le traitement NaBH4 et la postfixation de l’échantillon pour prévenir la dissociation des anticorps. L’utilisation du masque de canal vert pour...

La signalisation associée à la membrane est réglée par une combinaison d’activation des récepteurs membranaires induits par les ligands et de recrutement de protéines accessoires en aval qui propagent le signal. La phosphorylation des tyrosines clés dans les queues cytoplasmiques des récepteurs est essentielle pour initier la formation de complexes de signalisation, ou signalosomes 1,2. Par conséquent, une question importante en biologie est de savoir comment les modèles de phosphorylation sont créés et maintenus pour recruter des partenaires de signalisation et dicter les résultats cellulaires. Cela comprend la compréhension de l’hétérogénéité de la phosphorylation des récepteurs, à la fois en abondance et dans les modèles spécifiques de phosphotyrosine qui peuvent fournir un moyen de manipuler les sorties de signalisation en dictant la composition du signalosome 3,4,5,6,7. Cependant, il existe des limites dans les méthodes actuelles pour interroger la phosphorylation des protéines. L’analyse par transfert de Western est excellente pour décrire les tendances de la phosphorylation des protéines, mais elle est semi-quantitative8 et ne fournit pas d’informations sur l’hétérogénéité du système, car des milliers à des millions de récepteurs sont moyennés ensemble. Bien que les transferts de Western permettent de sonder un échantillon à l’aide d’anticorps spécifiques aux phosphos contre des tyrosines spécifiques, ils ne peuvent pas fournir d’informations sur les modèles de phosphorylation multisite au sein d’une même protéine. La phosphoprotéomique quantitative rend compte de l’abondance de la phosphotyrosine, mais il existe des limites à la détection de la phosphorylation multisite, car les résidus d’intérêt doivent être situés dans le même peptide (généralement 7-35 acides aminés) qui est généré par la digestion enzymatique 9,10,11.
Pour surmonter les limites mentionnées ci-dessus, le test SiMPull (Single-Molecule Pull-Down) a été adapté pour quantifier les états de phosphorylation des récepteurs intacts au niveau de la molécule unique. SiMPull a été démontré pour la première fois comme un outil puissant pour interroger les complexes macromoléculaires par Jain et al.12,13. Dans SiMPull, les complexes macromoléculaires ont été immunoprécipités (IP) sur des couvercles de verre fonctionnalisés par anticorps, puis analysés par microscopie à molécule unique pour le nombre de sous-unités protéiques et la co-IP avec des composants complexes12. Une modification de Kim et al.14, appelée SiMBlot, a été la première à utiliser une variante de SiMPull pour analyser la phosphorylation des protéines dénaturées. Le protocole SiMBlot repose sur la capture de protéines de surface cellulaire biotinylées à l’aide de couvercles recouverts de NeutrAvidin, qui sont ensuite sondés pour la phosphorylation avec un marquage d’anticorpsspécifiques au phospho 14. Malgré ces progrès, des améliorations étaient nécessaires pour rendre la quantification de la modification post-traductionnelle plus robuste et applicable à un plus large éventail de protéines.
Le présent protocole décrit une approche SiMPull optimisée qui a été utilisée pour quantifier les modèles de phosphorylation du récepteur du facteur de croissance épidermique intact (EGFR) en réponse à une gamme de conditions de ligand et de mutations oncogènes15. Bien que ces travaux se concentrent sur l’EGFR, cette approche peut être appliquée à n’importe quel récepteur membranaire et protéine cytosolique d’intérêt (POI), pour lesquels des anticorps de qualité sont disponibles. Le protocole comprend des étapes pour réduire l’autofluorescence des échantillons, une conception de réseau d’échantillons qui nécessite un volume d’échantillon minimal avec la préparation simultanée de jusqu’à 20 échantillons, et l’optimisation des conditions de marquage et de fixation des anticorps. Des algorithmes d’analyse de données ont été développés pour la détection et la quantification de protéines phosphorylées à molécule unique.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Tubes à microcentrifuger</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 Tampon</td></tr><tr><td>100 mm Boîte de culture tissulaire</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Stockage du piranha verre dépoli/matrices</td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td></td><td></td><td></td>conique</tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde Aqueux Solution</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Dangereux Tube</td><td></td><td></td> conique de 50 mL <td>Stockage en verre fonctionnalisé/ Réutilisation du KOH</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM</td> Composant tampon de <td>lyse</td>NaCl <td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Boîte de culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8 % Glutaraldéhyde Solution aqueuse</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16020</td><td>Acétone dangereuse</td></tr><tr><td>(C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>Dangereuse Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>Femelle humaine recombinante sans animaux</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>EGFR anti-humain (domaine externe) &ndash ; Biotine</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Bath-sonicator</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5 000</td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td> <td>sérique bovineGold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Composant tampon de Tyrode</td></tr><tr><td>Entonnoir</td><td></td><td></td><td></td>de Buchner</tr><tr><td>Bec</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Composant tampon de Tyrode</td></tr><tr><td>Racleur de cellules</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Fiole filtrante conique</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 60 #1.5</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>Caméra emCCD</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Fusion 360</td> inactivé par la chaleur <td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfate</td><td>Caisson Labs G030-5GM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>Dangereux</td></tr><tr>Pipettes <td></td><td></td><td></td><td>sérologiques en verre</td></tr><tr>Tige <td></td><td></td><td></td><td>d’agitation en verre</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Composant tampon de Tyrode</td></tr> Arrêt de la <tr><td>phosphotase et cocktail inhibiteur de protéase (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Composant tampon de lyse</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>TyrodeComposant tampon de l’acide</td></tr><tr><td>chlorhydrique (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène dangereux (H2O2) (3 %)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (H2O2) (30 %)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Tampon de lyse Composant</td></tr><tr><td>ImmEdge Barrière hydrophobe Stylo</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F Huile d’immersion</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>ligne</td><td></td><td></td><td></td>de vide interne</tr><tr><td>L-glutamine Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnessium hexahydraté (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Composant tampon de Tyrode Boîte</td></tr><tr>à outils<td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting, Parallel Computing Toolbox et boîte à outils de statistiques et d’apprentissage automatique</td></tr><tr><td>Méthanol (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Eau</td></tr> <tr><td></td><td>Milli-Q dangereuse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix-n-Stain CF Dye Kits de marquage d’anticorps</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Kit de conjugaison suggéré</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-succinimidyl valerate, MW 5 000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td>Nanogrille dangereuse</td></tr><tr><td></td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotine Protéine de liaison</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Azote (gaz comprimé)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPU NVIDIA avec CUDA</td><td></td><td></td><td>Recherchez la compatibilité sur https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>microscope Olympus iX71</td> Film d’étanchéité <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Plaque chauffante analogique</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Récepteur phospho-EGF (Tyr1068) (1H12) Technologie</td><td>de signalisation cellulaire</td> mAb de souris <td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Composant tampon de Tyrode Hydroxyde</td></tr><tr><td>de potassium (KOH)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td></td></tr><tr><td>Filament PLA Premium dangereux, 1,75 mm de diamètre</td><td>Raise 3D</td><td>PMS :2035U/RAL :3028</td><td>Plage de température d’impression : 205-235 &deg ; </td></tr><tr><td>Imprimante 3D C Pro2</td><td>Raise 3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L bécher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PYREX 100 mL bouteilles de stockage</td><td>Corning</td><td>1395-100</td><td>CH3OH/C3H6O réutiliser</td></tr><tr><td>les</td><td></td><td></td><td></td>béchers Pyrex 250 mL</tr><tr><td>Bécher</td><td></td><td></td><td></td>Pyrex 4 L</tr><tr><td>Quad-view Image Séparateur</td><td>Photométrie</td><td>Modèle QV2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>Compteurs de cellules RevCount, Lames de comptage de cellules EVE VWR</td><td></td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Filtres d’émission Semrock : bleu (445/45 nm), vert (525/45 nm), rouge (600/37 nm), rouge lointain (685/40 nm)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de pipette sérologique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensemble</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>d’analyse</td><td></td><td></td> de molécule unique <td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium dangereux (NaBH4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s Composant tampon</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>Activer par cycles successifs de chaleur et</td></tr><tr><td>de pH Hydroxyde de sodium</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium (Na3VO4)Millipore</td> <td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique dangereux (H2SO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td>Microsphères</td></tr><tr><td>TetraSpeck</td> dangereuses <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>perles multi-fluorescentes</td></tr><tr><td>Base Tris (Trizma)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypan bleu, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,05 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle nécessaire qui régule la fonction des protéines et dirige les résultats de la signalisation cellulaire. Les méthodes actuelles de mesure de la phosphorylation des protéines ne peuvent pas préserver l’hétérogénéité de la phosphorylation entre les protéines individuelles. Le test SiMPull (Single-Molecule Pull-Down) a été développé pour étudier la composition de complexes macromoléculaires par immunoprécipitation de protéines sur un couvercle en verre suivie d’une imagerie à molécule unique. La technique actuelle est une adaptation de SiMPull qui fournit une quantification robuste de l’état de phosphorylation des récepteurs membranaires pleine longueur au niveau de la molécule unique. L’imagerie de milliers de récepteurs individuels de cette manière permet de quantifier les modèles de phosphorylation des protéines. Le présent protocole détaille la procédure SiMPull optimisée, de la préparation de l’échantillon à l’imagerie. L’optimisation des protocoles de préparation du verre et de fixation des anticorps améliore encore la qualité des données. Le protocole actuel fournit un code pour l’analyse des données à molécule unique qui calcule la fraction des récepteurs phosphorylés dans un échantillon. Bien que ces travaux se concentrent sur la phosphorylation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), le protocole peut être généralisé à d’autres récepteurs membranaires et molécules de signalisation cytosoliques.

Un dessin animé illustrant le processus SiMPull est illustré à la figure 1A. Les couvercles sont fonctionnalisés à l’aide de NeutrAvidin comme point d’ancrage pour les anticorps anti-EGFR biotinylés afin de capturer l’EGFR-GFP à partir de lysats de protéines totales. Après avoir éliminé les protéines non liées, les récepteurs phosphorylés sont marqués avec un anticorps anti-phosphotyrosine (anti-PY)15. La figure 1B montre une image du rés...

Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).

Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Ce protocole SiMPull permet une quantification de la phosphorylation des protéines en améliorant les conditions de marquage et de fixation des anticorps, en réduisant l’autofluorescence trouvée dans le canal vert et en fournissant des algorithmes d’analyse de molécule unique robustes. Le principal avantage de SiMPull est qu’il nous permet d’interroger le statut de phosphorylation de protéines intactes individuelles. Avec cette méthode, nous pouvons obtenir de nouvelles informations qui ne sont pas accessibles par des techniques traditionnelles, telles que le transfert western et l’analyse des spécifications de masse.Nous avons une équipe de chercheurs pour aider à démontrer le protocole. Tout d’abord, Julian Rojo montrera comment pirater la gravure du verre de couverture. Rachel Grattan montrera ensuite les étapes de revêtement du verre de couverture.Et Elizabeth Bailey montrera comment dessiner le tableau et les échantillons d’images. Pour commencer, le piranha grave le couvercle glisse en agitant doucement le bécher réactionnel toutes les cinq minutes pendant 30 minutes. Neutraliser la solution de piranha en ajoutant progressivement une base faible.À l’aide d’une tige de verre, transférer les couvercles gravés glissés dans un entonnoir Buchner et rincer pendant cinq minutes à l’eau distillée double. Ensuite, placez les feuillets de couverture dans un bocal coplin en verre et couvrez de méthanol. Scellez le couvercle avec un film d’étanchéité et vaporisez le bain pendant 10 minutes.Après la sonication, videz le méthanol dans une bouteille de stockage en verre. Répétez cette étape avec l’acétone. Rincez le couvercle trois fois avec de l’eau distillée double dans le pot Coplin.Égouttez l’eau des couvercles et séchez-les en agitant à travers la flamme d’un brûleur Bunsen. Placez les couvercles glissés dans un pot coplin sec. Ajoutez ensuite une solution d’amino silane au pot Coplin pour effectuer une silanisation aminée de couverture.Couvrir et appliquer un film d’étanchéité pour le protéger de la lumière. Rincez les couvercles avec du méthanol et jetez la solution utilisée. Encore une fois, rincez les feuillets de couverture trois fois avec de l’eau distillée double pendant deux minutes chacun.Tamponnez l’excès d’humidité et séchez complètement à l’air libre pendant 10 minutes. Ensuite, dessinez un réseau de grilles avec un stylo barrière hydrophobe. Marquez un identificateur sur le bordereau de couverture pour identifier l’orientation appropriée.Une fois l’encre sèche, placez les feuillets de couverture dans une chambre humidifiée. Remettre en suspension 153 milligrammes de mPEG et 3,9 milligrammes de biotine-PEG dans 609 microlitres de bicarbonate de sodium de 10 millimolaires et vortex. Centrifuger à 10 000 x g à partir d’une minute à température ambiante pour éliminer les bulles.Appliquez 10 à 15 microlitres de cette solution par carré pour couvrir complètement la matrice sans déborder. Conservez le couvercle glissé dans la chambre d’humidité dans l’obscurité pendant trois à quatre heures à température ambiante. Ensuite, lavez les couvercles en les trempant pendant 10 secondes séquentiellement dans trois béchers remplis d’eau distillée double.Retirez toute l’humidité des glissières de couverture à l’aide d’azote gazeux. Rangez le couvercle dos à dos dans un tube conique de 50 millilitres rempli d’azote et scellez avec un film d’étanchéité. Enveloppez le tube avec un film d’étanchéité et placez-le à moins 20 degrés Celsius.Retirez les matrices fonctionnalisées biotine-PEG du congélateur et équilibrez-les à la température ambiante. Placez le couvercle avec le réseau tourné vers le haut sur une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres recouverte d’un film d’étanchéité. Incuber chaque carré du réseau avec 10 milligrammes par millilitre de borohydrure de sodium dans du PBS pendant quatre minutes à température ambiante.Laver trois fois avec PBS. Ensuite, incuber avec 0,2 milligramme par millilitre de NeutrAvidin dans T50 pendant cinq minutes, puis laver trois fois avec T50 BSA. Répétez l’incubation avec deux microgrammes par millilitre d’anticorps spécifique POI biotinylés dans le T50 BSA pendant 10 minutes, suivie d’un lavage.Tout d’abord, décongeler mélanger le lysat par pipetage. Diluer un microlitre du lysat en 100 microlitres de IPP T50 BSA glacé. Incuber le lysat sur la matrice pendant 10 minutes, puis lavage.Préparer l’anticorps anti-phosphotyrosine conjugué AF647 dans l’IPP T50 BSA glacé et incuber sur la matrice pendant une heure. Déposez une goutte d’huile sur l’objectif. Placez le nanogrille sur la scène pour l’imagerie.À l’aide de la lumière blanche transmise, concentrez-vous sur le motif de la grille. Acquérez une série de 20 images de la grille, assurez-vous que les pixels ne sont pas saturés et enregistrez la série d’images comme fiducial. Défocaliser le nanogrille pour créer un motif aéré, acquérir une série de 20 images pour des étalonnages de gain et enregistrer l’image en tant que gain.Ensuite, acquérez une série de 20 images pour le décalage de la caméra en bloquant toute la lumière de la caméra et enregistrez l’arrière-plan des images. Pour acquérir des images simples, nettoyez d’abord l’objectif d’huile et déposez de l’huile supplémentaire sur l’objectif. Fixez le réseau de glissements de couverture sur la scène du microscope.Acquérir des images pour chaque échantillon, d’abord dans le canal rouge lointain, suivi de fluorophores de longueur d’onde inférieure. Vérifiez le niveau de tampon toutes les 30 à 45 minutes et réapprovisionnez-le au besoin. En utilisant cette technique, l’EGFR-GFP a été capturé à partir de lysats de protéines totales.L’autofluorescence de l’encre hydrophobe a été utilisée comme guide pour trouver le plan focal de l’échantillon. Les images de données brutes ont été acquises avec des canaux spectraux séparés sur la puce de la caméra. Une superposition des canaux vert et rouge lointain a été examinée plus avant pour l’acquisition de données.L’enregistrement des chaînes a été effectué sur des images acquises à partir du nanogrille. Une superposition d’images fiduciales a montré un enregistrement incomplet. L’alignement a été effectué en appliquant une transformation moyenne pondérée locale sur les coordonnées des canaux rouge lointain et vert, qui a été utilisée pour enregistrer les données SiMPull suivantes.Des émetteurs uniques au-dessus du nombre de photons de fond des canaux GFP et AF647 ont été mis en boîte et une localisation gaussienne a été effectuée pour identifier les emplacements. La colocalisation de l’EGFR-GFP dans un F647 a été réalisée pour identifier les récepteurs phosphorylés. Et le pourcentage de colocalisation a été utilisé pour déterminer la fraction des récepteurs phosphorylés.Les détections de fond ont été réduites lorsque le verre gravé au piranha a été traité avec du borohydrure de sodium. Une liaison robuste de l’EGFR-GFP dans le lysat a été observée avec une liaison PY99-AF647 non spécifique minimale, montrant une rétention de la fonctionnalisation de surface à l’aide de cette technique. SiMPull fournit des informations sur la phosphorylation des protéines et peut répondre à un large éventail de questions d’auto-signalisation.Cela peut améliorer notre compréhension de la signalisation dans les états normaux et pathologiques.

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

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