Étude des effets atténuants de l’administration de Bacillus cereus sur la colite par la modulation du microbiote intestinal

Ce protocole permet d’évaluer l’effet régulateur bidirectionnel de la supplémentation en probiotiques sur la santé et des résultats stables et reproductibles. Un modèle alternatif de colite induite par le DSS a été établi en utilisant des souris pseudo-libres de germes afin d’éviter certaines limitations de laboratoire dans l’utilisation de souris sans germes comme récepteurs de probiotiques. Pour explorer les effets bénéfiques des probiotiques dans cette technique, il s’agit d’une approche prometteuse pour développer de nouvelles stratégies de traitement visant à soulager les symptômes des troubles inflammatoires chroniques associés.

Pour commencer, préparez un cocktail d’antibiotiques en dissolvant de l’ampicilline, du sulfate de néomycine, du métronidazole et de la vancomycine dans l’eau potable. Après la dissolution complète, conservez les solutions à quatre degrés Celsius. Mettez les solutions de cocktail d’antibiotiques dans une bouteille d’eau.

Assurez-vous d’utiliser des bouteilles brunes ou d’envelopper les bouteilles avec du papier d’aluminium pour protéger les solutions antibiotiques de la lumière. Placez la bouteille sur la cage de la souris. Pour faire une solution de sulfate de sodium à 2,5 % de dextran, dissolvez 2,5 grammes de DSS dans 100 millilitres d’eau distillée.

Remplacer l’eau potable par la solution DSS à 2,5 % dans le groupe de souris modèles de colite. Pour évaluer l’effet positif de B cereus sur le soulagement de la colite, répartissez au hasard les souris dans les trois groupes suivants, le groupe témoin, le modèle de colite induite par le DSS et la supplémentation en probiotiques B cereus pour les souris induites par le DSS. Pour explorer le rôle du microbiote intestinal dans la régulation des effets probiotiques de B cereus sur la colite induite par le DSS, répartissez au hasard les souris dans les trois groupes suivants, ABX/contrôle, ABX/DSS et ABX/B cereus plus DSS.

Enregistrez le poids corporel des souris comme poids de référence après l’administration du cocktail d’antibiotiques. Traiter immédiatement les six souris mâles C 57 BL avec une solution DSS à 2,5 % dans l’eau potable pendant sept jours. Préparez huit microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre remplis de 900 microlitres de solution saline normale stérile.

Pipeter 100 microlitres de croissance logarithmique B cereus et dissoudre dans 900 microlitres de sérum physiologique stérile. Diluer en série B cereus à l’aide de tubes. Placez 40 microlitres de chaque dilution sur la plaque de gélose LB correspondante étiquetée avec le taux de dilution.

Répétez l’opération trois fois pour chaque taux de dilution. Cultivez les plaques dans un incubateur à température constante de 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Sélectionnez les plaques avec environ 20 à 70 colonies pour le comptage.

Après la quantification de B cereus, prélever un millilitre de milieu B cereus contenant un fois 10 à la neuvième UFC et centrifuger à 8 000 G pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules bactériennes deux fois avec de l’eau stérile par centrifigation à 8 000 G pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Diluer le B cereus concentré avec une solution saline normale stérile jusqu’à une concentration finale de deux fois 10 à la huitième UFC par 200 microlitres.

Pipetez la dilution de haut en bas à plusieurs reprises pour obtenir une suspension de B cereus dispersée. Essuyez l’extérieur de l’aiguille de gavage avec de l’éthanol à 70 % et maintenez l’application de la dose appropriée. Pour retenir les souris, saisissez-les par la queue et saisissez fermement la peau lâche du dos avec l’extrémité de la queue fixée entre les deux derniers doigts du manipulateur.

Gardez les souris en position verticale. Ensuite, insérez l’aiguille de gavage avec précaution et douceur dans la bouche jusqu’à l’œsophage. Administrez la solution de B cereus, retirez doucement l’aiguille et remettez la souris dans sa cage.

Mesurez quotidiennement le poids corporel des souris et collectez immédiatement les échantillons d’excréments dans un tube à centrifuger stérilisé. Déterminez le sang occulte fécal à l’aide d’un papier réactif de sang occulte dans les selles. Prélever 10 milligrammes d’échantillon de selles sur un bâtonnet applicateur.

Placez l’échantillon sur la carte de test et appliquez une fine tache sur la carte. Ouvrez le rabat arrière et appliquez le révélateur sur le frottis. Fixez les souris en décubitus dorsal sur la table d’opération et ouvrez la cavité péritonéale.

Séparez chirurgicalement tout le côlon et mesurez la longueur à l’aide d’une règle. Ensuite, lavez doucement le côlon avec une seringue de cinq millilitres remplie de PBS pré-refroidi. Déwaxez et hydratez les sections du côlon.

Ensuite, colorez les sections du côlon avec de l’hématoxyline et de l’éosine. Que deux expérimentateurs indépendants évaluent les scores histologiques de l’échantillon au microscope optique, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a révélé que le tissu du côlon des souris modèles de colite présentait une perte de crypte, des lésions des cellules caliciformes, une infiltration de cellules inflammatoires et une perte d’épithélium. Le traitement par B cereus a amélioré les dommages histopathologiques induits par le DSS.

Les scores histopathologiques des souris colite étaient significativement plus élevés que dans le groupe témoin. Cependant, les scores histopathologiques dans le groupe B cereus étaient significativement plus faibles que chez les souris colite. Les souris ont été réparties au hasard en trois groupes, la perte de poids corporel, les scores DAI et les scores histopathologiques étaient plus élevés et la longueur du côlon était plus courte dans le groupe ABX/DSS par rapport aux souris dans le groupe ABX/contrôle.

La perte de poids corporel, la longueur du côlon, les scores DAI et les scores histopathologiques n’étaient pas statistiquement différents entre les groupes ABX/DSS et ABX/B cereus plus DSS. Les résultats actuels suggèrent indirectement que le microbiote intestinal joue un rôle clé dans les effets positifs de B cereus sur la colite. L’une des étapes les plus importantes consiste à utiliser la méthode Bacillus cereus par gavage pour construire la modélisation de la colite chez la souris.

Le traitement de Bacillus cereus a éliminé la colite induite par le DSS, ce qui a conduit à une base pour l’étude de suivi des probiotiques pour le traitement de la colite.