Name: Imagerie chimique multiplex basée sur la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Découvrez la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande pour l'imagerie chimique multiplex sans marquage. Cette méthode permet d'identifier et de quantifier les constituants chimiques dans les échantillons biologiques de manière non invasive.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D. P. reconnaît le financement du projet CRIMSON de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 101016923 et du projet NEWMED de la région Lombardie au titre de la convention de subvention n° POR FESR 2014-2020. G. C. reconnaît le financement du projet de l’Union européenne GRAPHENE Core3 dans le cadre de la convention de subvention numéro 881603. G. C. reconnaît également le financement de l’Université des sciences et de la technologie du roi Abdallah, numéro de subvention: OSR-2016-CRG5-3017-01.

<ol><li>Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Raman Imaging.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).</li>
<li>Smekal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+quantentheorie+der+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Zur quantentheorie der dispersion.</a> Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).</li>
<li>Vanna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+for+label-free+cancer+diagnosis+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22La+Rivista+del+Nuovo+Cimento%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification.</a> La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).</li>
<li>Eckhardt, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+from+organic+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering from organic liquids.</a> Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).</li>
<li>Hellwarth, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Theory of stimulated Raman scattering.</a> Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).</li>
<li>Maker, P. D., Terhune, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+optical+effects+due+to+an+induced+polarization+third+order+in+the+electric+field+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength.</a> Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).</li>
<li>Bloembergen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulated+Raman+effect%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">The stimulated Raman effect.</a> American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).</li>
<li>Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+resonant+and+nonresonant+three-wave+mixing+in+diamond%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+B%22%5BJournal%5D)">Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond.</a> Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).</li>
<li>Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+coherent+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Broadband coherent Raman scattering microscopy.</a> Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020(2018).</li>
<li>Rigneault, H., Berto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Coherent+Raman+light+matter+interaction+processes%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes.</a> APL Photonics. 3 (9), 091101(2018).</li>
<li>Hu, F., Shi, L., Min, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+of+chemical+bonds+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems%3A+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), (2015).</li>
<li>Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+vibrational+imaging+by+coherent+anti-stokes+raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering.</a> Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+CARS+spectral+phase+retrieval+using+a+time-domain+Kramers-Kronig+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform.</a> Optics Letters. 34 (9), 1363(2009).</li>
<li>Valensise, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+non-resonant+background+from+CARS+spectra+via+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning.</a> APL Photonics. 5 (6), 061305(2020).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheng%2C+JX+%22Coherent+Raman+scattering+microscopy%22">Coherent Raman scattering microscopy</a>. , CRC press. Boca Raton. (2012).</li>
<li>Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodyne+detected+nonlinear+optical+imaging+in+a+lock-in+free+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner.</a> Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).</li>
<li>Blume, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boxcar%27%27+integrator+with+long+holding+times%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Boxcar'' integrator with long holding times.</a> Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
<li>Sarri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+histology%3A+one+to+one+comparison+with+standard+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378(2019).</li>
<li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li>
<li>De la Cadena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+stimulated+Raman+imaging+based+on+multi-channel+lock-in+detection+for+spectral+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology.</a> APL Photonics. 7 (7), (2022).</li>
<li>Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadband+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+wavelength-scanning+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).</li>
<li>Sciortino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-channel+differential+lock-in+amplifiers+with+autobalancing+network+for+stimulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Solid-State+Circuits%22%5BJournal%5D)">Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy.</a> IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).</li>
<li>Coluccelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+30+fs+light+pulses+at+1+W+power+level+from+a+Yb-pumped+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 42 (21), 4545(2017).</li>
<li>Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newcomer%27s+guide+to+ultrashort+pulse+shaping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+B%3A+Atomic%2C+Molecular+and+Optical+Physics%22%5BJournal%5D)">A newcomer's guide to ultrashort pulse shaping and characterization.</a> Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001(2010).</li>
<li>Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150(1984).</li>
<li>Crisafi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-line+balanced+detection+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10475(2017).</li>
<li>Alem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+spectral+density+measured+with+lock-in+amplifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Zurich+Instruments+Company+Blog%22%5BJournal%5D)">Noise spectral density measured with lock-in amplifiers.</a> Zurich Instruments Company Blog. , https://www.zhinst.com/europe/en/blogs/noise-spectral-density-measured-lock-amplifiers (2021).</li>
<li>Palmer, C., Loewen, E. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalmer%2C+C+%22Diffraction+grating+handbook%22">Diffraction grating handbook</a>. , (2005).</li>
<li>Tauler, R., de Juan, A., Jaumot, J. Multivariate curve resolution homepage. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/">https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/</a> (2021).</li>
<li>Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+curve+resolution+applied+to+second+order+data%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Multivariate curve resolution applied to second order data.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).</li>
<li>de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+Curve+Resolution+%28MCR%29.+Solving+the+mixture+analysis+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem.</a> Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+vibrational+imaging+by+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+curve+resolution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis.</a> Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).</li>
<li>Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+analysis+of+hyperspectral+stimulated+Raman+scattering+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).</li>
<li>Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+SD+%22Comprehensive+Chemometrics%3A+Chemical+and+Biochemical+Data+Analysis%22">Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis</a>. , Elsevier. (2020).</li>
<li>Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+group+delay+dispersion+of+high+numerical+aperture+objective+lenses+using+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence.</a> Applied Optics. 36 (1), 397(1997).</li>
<li>Paschotta, R. RP Photonics Encyclopedia. Article on &#34;Relative Intensity Noise.&#34. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html">https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html</a> (2021).</li>
<li>Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+in+stimulated+Raman+scattering+measurement%3A+From+basics+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Photonics%22%5BJournal%5D)">Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice.</a> APL Photonics. 5 (1), 011101(2020).</li>
<li>Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+for+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers.</a> Journal of Polymer Science. , (2021).</li>
<li>Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+absorption+microscopy%3A+advances+in+chemical+imaging+of+photoinduced+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics.</a> Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).</li>
<li>Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodyne+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging.</a> Optics Letters. 31 (2), 241(2006).</li>
<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363(2002).</li>
<li>Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+vibrational+imaging+with+sum+frequency+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy.</a> Optics Letters. 36 (19), 3891(2011).</li>
</ol>

G. C. déclare son implication dans la société, Cambridge Raman Imaging, qui vise à commercialiser la technologie de microscopie SRS à large bande. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La microscopie SRS à large bande est une technique d’imagerie puissante qui offre un contraste chimique authentique pour identifier et démêler les constituants chimiques d’un échantillon hétérogène. Le potentiel de cet outil analytique peut être bénéfique pour plusieurs domaines de recherche, allant de la science des matériaux à l’histopathologie. L’inconvénient de la microscopie SRS à large bande est le fait qu’elle est techniquement exigeante; l’expérimentateur a non seulement besoin d’un savoir-faire sur les sources laser à large bande, mais doit également manipuler les impulsions laser pour générer efficacement srS, un signal qui, à son tour, doit être mesuré avec des schémas de détection sophistiqués. Cet article présente un protocole qui décrit un flux de travail pour produire des cartes chimiques de composés chimiques mélangés à l’aide d’un microscope SRS multiplex à large bande. Bien que les travaux décrits puissent être triviaux pour certains physiciens laser et microscopistes non linéaires, ce n’est peut-être pas le cas pour les lecteurs intéressés par les avantages de la microscopie SRS à large bande dont les connaissances scientifiques résident en dehors de ces domaines. Par conséquent, nous avons cherché à détailler chaque étape pour guider le large public intéressé par la microscopie SRS à large bande.
Le protocole en question a commencé par montrer comment préparer un échantillon simple mais riche en spectroscopie composé de plusieurs diffuseurs Raman forts et bien connus. Nous avons discuté de la façon d’obtenir la pompe à large bande et les faisceaux Stokes à bande étroite nécessaires à la mise en place d’un microscope SRS. La figure 5C montre un schéma des configurations SHG et OPO. Notez que la lentille f1 focalise le faisceau fondamental sur le LBO1 pour générer le SHG, tandis qu’un miroir dichroïque réfléchit le rayonnement SHG et transmet le faisceau fondamental résiduel. Une deuxième lentille f2 collimale le faisceau SHG. Comme f2 &gt; f1, le faisceau SHG est élargi d’un facteur égal à f2/f1. Une troisième lentille f3 focalise le faisceau SHG expansé sur un deuxième cristal LBO de type I (LBO2) coupé à θ = 90° et φ = 29,0°. En pompant le LBO2 avec le SGH susmentionné (520 nm), le rayonnement dans la plage de 680-910 nm émergera du LBO2 par génération de fréquence de différence (DFG), produisant deux faisceaux: le signal et le ralenti27 (Figure 5D, E). Ce dernier est jeté tandis que le premier est amplifié dans la cavité OPO pour délivrer les impulsions de pompe utilisées dans les expériences SRS. La pompe de l’OPO à 520 nm, à savoir le faisceau SHG, ne doit pas être confondue avec la pompe des expériences SRS (c’est-à-dire le faisceau de signal de l’OPO).
Le contraste en microscopie SRS provient d’un signal non linéaire généré au point focal du microscope, un signal qui exige de confiner un grand nombre de photons dans le plan de l’échantillon à un moment donné. Ce confinement des photons est réalisé avec un objectif de microscope à haute ouverture numérique (NA), un ensemble de lentilles qui définit également la résolution spatiale du système: plus le NA est élevé, plus la résolution spatiale est élevée. Cependant, les objectifs NA élevés sont densément remplis de verre, ce qui introduit un GDD positif au rayonnement pulsé, un gazouillis de fréquence qui élargit finalement le profil temporel des impulsions39. Ainsi, le GDD introduit par l’objectif du microscope pourrait augmenter la durée des impulsions de la pompe à large bande, la rendant encore plus longue que l’enveloppe temporelle de Stokes et réduisant la bande passante effective et accessible du signal Raman. En outre, cet élargissement pourrait également introduire une distorsion du profil spectral du spectre SRS mesuré.
Dans CARS, le signal spectroscopiquement pertinent émerge à des longueurs d’onde différentes de celles des champs d’excitation. Un simple tube photomultiplicateur ou une caméra CCD (Charge-Coupled Device) peut être utilisé pour intégrer le signal CARS à temps, résumant des milliers d’impulsions pour faire la moyenne du bruit laser. Au lieu de cela, le signal SRS apparaît comme un léger transfert de modulation intégré dans un arrière-plan laser fort et fluctuant. Parce que cette modulation est faible, le bruit laser peut facilement la submerger, réduisant à la fois la vitesse d’imagerie et la sensibilité du microscope SRS. Par conséquent, avant l’imagerie, il est impératif de mesurer le bruit d’intensité relative (RIN) pour déterminer si le laser convient à l’imagerie SRS à grande vitesse et pour sélectionner la fréquence de modulation avec le bruit le plus faible. Le RIN est défini comme la densité spectrale de puissance de bruit [δP(f), avec des unités W2/Hz] du laser normalisée par la puissance optique moyenne (<img alt="Diagramme d’équilibre statique ΣFx=0 ; l’équilibre des forces dans l’analyse structurelle ; Outil de physique pédagogique." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2">)40,41. En d’autres termes, le RIN décrit les fluctuations laser normalisées à différentes fréquences (Eq [4]).
<img alt="Bruit d’intensité relative, équation : RIN=10log₁₀(δP(f)/P̅²) [dB/Hz], stabilité du signal optique." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq07.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 7"> (4)
Ainsi, le RIN est un paramètre du système SRS qui détermine la gamme de fréquences de modulation idéale pour les expériences. Par exemple, la barre d’olive de la figure 8 montre la plage de fréquences de modulation idéale pour l’imagerie SRS. Dans le cas du SRS à bande étroite, l’utilisateur doit mesurer le RIN de la pompe et de Stokes pour choisir le faisceau à moduler pour obtenir des performances optimales. Notez de la figure 8, par exemple, que le faisceau de Stokes a un RIN légèrement plus élevé que la pompe, ce qui implique que les mesures SRG s’avéreraient plus bruyantes que leurs homologues SRL. Dans le cas du SRS à large bande, le faisceau à moduler est le faisceau à bande étroite.
La dispersion angulaire D du réseau exprime l’angle de diffraction en fonction de la longueur d’onde et est définie comme la dérivée de l’équation du réseau. Pour la configuration de Littrow, la dispersion angulaire est donnée par Eq (5).
<img alt="Formule de diffraction D = dβ/dλ = 2/λ tanβ ; Analyse de dispersion optique, équation de physique." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq08.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 8"> (5)
Pour obtenir Eq (5), nous avons supposé α = β, résolu Eq (2) pour m/d et inséré le résultat dans dβ/ dλ. Notez que dans la configuration de Littrow, β = sin-1(mλ/2d). Dans l’approximation à petit angle, le changement de position le long du spectre est fdβ ≈ dl (Figure 10). Ainsi, en insérant dβ dans Eq (5), on peut calculer la dispersion linéaire, une grandeur avec des unités de nm mm-1 en utilisant Eq (6) :
<img alt="Équation différentielle pour la dispersion de longueur d’onde ; formule d’équation ; Concepts d’optique, de spectroscopie." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq09.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 9"> (6)
Pour un réseau de diffraction fonctionnant dans la configuration Littrow avec 1 851,85 rainures/mm, d = 540 nm. Si nous utilisons la diffraction de premier ordre de la lumière à ~789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Avec un objectif f = 750 mm, nous obtenons une dispersion linéaire de ≈ 0,5 nm mm-1, se traduisant par ≈ 7,8 cm-1 mm-1. Ainsi, la distance focale de la lentille détermine la « densité » de nm par mm au niveau du plan du détecteur : plus la distance focale est longue, moins on obtient de nm par mm, ce qui augmente l’espace entre les raies spectrales de la pompe à large bande. Inversement, avec des distances focales plus courtes, il y aura plus de nm par mm au niveau du plan du détecteur, ce qui réduira l’espace occupé par la pompe dispersée.
La détection équilibrée améliore la qualité d’image et la sensibilité des configurations bruyantes. Par exemple, selon les spectres RIN illustrés à la figure 8 et compte tenu du SRS typique d’une amplitude de 1 x 10-5, le rapport signal/bruit (SNR) déséquilibré est de ≈60. En utilisant une détection équilibrée (c’est-à-dire proche du bruit de tir), il est possible d’atteindre un SNR de ≈145. La figure 11 montre des spectres et des images composites dans des conditions équilibrées et déséquilibrées. Naturellement, les effets de la détection équilibrée ont un impact sur les résultats finaux des expériences, à savoir les cartes chimiques. Forts de ces résultats, nous soulignons que la détection équilibrée est une technique puissante pour contrer les effets néfastes des fluctuations laser sur la qualité de l’image. Il convient de mentionner que la détection équilibrée est la mieux adaptée aux lasers bruyants, tels que les oscillateurs à fibre. Les microscopes SRS fonctionnant avec des sources lumineuses optiques silencieuses (p. ex., les lasers à semi-conducteurs) peuvent ne pas nécessiter une détection équilibrée.
Le protocole explique également une approche basée sur l’optique non linéaire pour trouver le chevauchement spatio-temporel entre les impulsions de ces faisceaux. Nous avons décrit les avantages d’utiliser le 1ème au lieu du 0ème ordre de diffraction d’une AOM comme faisceau de Stokes modulé. En outre, les effets néfastes de la dispersion sur l’efficacité de la production de SRS ont été décrits avec des suggestions de moyens de les atténuer via un compresseur à prisme. En outre, le protocole explique comment aligner les prismes et met en évidence trois aspects critiques à prendre en compte pour des performances optimales. Nous discutons non seulement de la pertinence du RIN pour la microscopie SRS, mais nous montrons également comment le mesurer avec un amplificateur à verrouillage et, avec le spectre RIN, définir la meilleure fréquence de modulation. Avec un exemple concret, cet article explique comment l’équation de caillebotis aide à concevoir la chaîne de détection. Enfin, le protocole illustre, avec des données SRS réelles, la structure de l’hypercube SRS et comment l’analyser avec un langage de programmation scientifique classiquement utilisé.
Ce protocole comporte trois limitations mineures. Tout d’abord, le schéma de détection utilisé dans cette contribution consiste en un détecteur de verrouillage multicanal non conventionnel conçu et construit en interne par Sciortino et al.26 Comme démontré précédemment25, ce détecteur peut être remplacé par une photodiode équilibrée prête à l’emploi. Bien que cette modification ne concerne que le détecteur et laisse le protocole pratiquement inchangé, avec une photodiode unique, il faut scanner chaque composant spectral du détecteur au lieu de les mesurer tous en même temps. Deuxièmement, ce protocole utilise la détection équilibrée en ligne, ce qui nécessite l’insertion de plusieurs éléments optiques dans le trajet du faisceau. Ces éléments optiques augmentent la complexité du système et entraînent des pertes de puissance optique et un élargissement des impulsions.
La détection équilibrée en ligne exige également que les deux répliques de pompe traversent l’échantillon, une situation qui peut ne pas être idéale pour les échantillons sensibles à la lumière, tels que les cellules vivantes, ou pour les échantillons fortement biréfringents dans lesquels les deux répliques de pompe peuvent présenter des propriétés optiques différentes, annulant ainsi la détection équilibrée. Troisièmement, le protocole repose sur un OPO construit à la maison, un appareil qui peut ne pas être facilement disponible. Cependant, les alternatives aux spectres à large bande délivrés par l’OPO sont le supercontinua des fibres optiques non linéaires ou des cristaux en vrac. Ce dernier ne pouvait être utilisé qu’avec des lasers à faible taux de répétition (jusqu’à 5 MHz). Ainsi, comme pour toute conception expérimentale, le protocole en question présente certaines limites. Cependant, ils sont minimes et ne compromettent pas le succès de cette approche.
Bien qu’un échantillon de référence soit décrit ici, ce protocole peut démêler avec succès des espèces chimiques dans les cellules et les tissus animaux et végétaux, tels que la cellulose, les espèces lipidiques ou les protéines, trouvant des applications pratiques dans différentes quêtes biochimiques ou comme outil de diagnostic en histopathologie. De même, ce protocole peut être un outil précieux en sciences des matériaux. Par exemple, en suivant ce protocole, on peut interroger la composition moléculaire et la concentration des espèces polymères42. En outre, cette méthodologie est compatible avec d’autres techniques de microscopie non linéaire, telles que la microscopie à large bande basée sur la sonde pompe43 et les procédés de mélange hétérodyne CARS44 à quatre ondes qui, comme avec SRS, nécessitent également deux faisceaux lumineux d’excitation et des mesures de modulation-transfert. Enfin, certaines des informations contenues dans cet article peuvent être appliquées à des techniques d’imagerie non linéaire qui ne reposent pas sur des techniques de transfert de modulation, mais nécessitent l’alignement de deux faisceaux laser pulsés ou plus, tels que les microscopies conventionnelles CARS45 et SFG46.
En résumé, ce protocole décrit une méthodologie puissante basée sur la microscopie SRS à large bande pour extraire des cartes chimiques et leurs spectres SRS caractéristiques à partir de mélanges chimiquement hétérogènes, fournissant des ensembles de données qui permettent une analyse quantitative simple des données. La polyvalence et la simplicité de la méthode donnent également au lecteur intéressé la possibilité de l’adapter à différentes techniques non linéaires.

La microscopie Raman est une technique d’imagerie puissante qui fournit de riches cartes chimiques en mesurant la diffusion Raman1, un processus radiatif inélastique qui provient de molécules vibrantes en réponse à la lumière incidente 2,3. Chaque pixel d’une carte Raman contient un spectre qui transporte des informations directes sur la composition chimique et la structure de l’échantillon, ce qui donne des images avec un contraste vibratoire intrinsèque. À ce jour, la microscopie Raman est le point de vue de référence pour les études de microspectroscopie des vibrations moléculaires, car aucune autre technique d’imagerie ne peut produire des images à la fois avec une spécificité chimique élevée et une résolution spatiale élevée4. Malgré sa spécificité chimique exceptionnelle, l’efficacité de génération de la diffusion Raman est faible, ce qui nécessite soit des temps de séjour prolongés des pixels, soit une excitation de haute puissance, entraînant respectivement de faibles taux d’acquisition et une incompatibilité avec des échantillons sensibles.
Cette seule déficience de la microscopie Raman a conduit les chercheurs à appliquer la diffusion Raman cohérente 5,6,7,8,9 comme source de contraste pour la microscopie. Il s’agit d’un processus optique non linéaire qui améliore la réponse vibratoire de plusieurs (jusqu’à sept) ordres de grandeur, permettant ainsi une imagerie chimique à grande vitesse 10,11,12,13. En particulier, les deux techniques de diffusion Raman cohérente les plus utilisées sont la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS)14 et la diffusion Raman stimulée (SRS)15. Contrairement à CARS, SRS montre une dépendance linéaire à la concentration de molécules résonnantes. Il est immunisé contre le fond non résonant, un effet non linéaire sans rapport avec une transition vibratoire mais déformant les formes lorentziennes caractéristiques des spectres Raman des vibrations moléculaires16,17. Ainsi, la microscopie SRS produit des informations Raman authentiques qui permettent une analyse quantitative directe de l’image.
SRS est un processus optique non linéaire de troisième ordre qui fournit des informations directes sur les liaisons chimiques d’un échantillon. Elle provient de la superposition spatio-temporelle de deux champs optiques généralement dans la région spectrale proche infrarouge, à savoir la pompe et les Stokes à la fréquence ωpu et ωS, respectivement 10,11,18. Cette superposition génère un battement au désaccordage de fréquence pompe-Stokes Ω = ωpu-ω S. Lorsque Ω correspond à une vibration moléculaire ΩR, la molécule résonne, provoquant un transfert d’énergie cohérent entre les champs lumineux et la molécule. En conséquence, la molécule atteint un état vibratoirement excité. Ce processus peut être surveillé en mesurant soit l’annihilation des photons de la pompe (un signal connu sous le nom de perte Raman stimulée [SRL]) ou l’amplification concomitante des photons de Stokes (un processus connu sous le nom de gain Raman stimulé [SRG]). SRG et SRL sont de petits signaux (ΔI) qui se trouvent au-dessus d’un arrière-plan intense et fluctuant (I). Comme les valeurs typiques du signal SRS (ΔI/I) sont dans la gamme 10-6-10-4, le bruit laser peut facilement l’obscurcir. Pour atténuer les effets néfastes du bruit laser sur le rapport signal/bruit (SNR) et, par conséquent, sur la vitesse d’imagerie, la détection SRS repose sur des techniques de transfert de modulation (par exemple, des amplificateurs de verrouillage, des circuits de résonance ou des moyenneurs de wagons-boîtes) à des fréquences de modulation élevées (>1 MHz), où le bruit laser atteint ses valeurs minimales 15,19,20.
La microscopie SRS conventionnelle utilise une pompe à bande étroite (≈10 cm−1) et des impulsions de Stokes pour produire des images chimiques à une seule fréquence vibratoire, permettant une imagerie à débit vidéo avec des temps de séjour en pixels aussi bas que ≈100 ns21,22. Cependant, comme la microscopie SRS à bande étroite forme des cartes chimiques en scannant séquentiellement l’échantillon à seulement quelques fréquences vibratoires, ses informations sont limitées23. Les images SRS avec un ou deux contrastes vibratoires peuvent ne pas suffire à différencier les espèces chimiques avec des bandes Raman qui se chevauchent, en particulier dans les systèmes hétérogènes. Par conséquent, le microscope SRS à bande étroite paradigmatique n’exploite pas tout le potentiel du SRS, car l’étude d’une poignée de fréquences vibratoires entrave sa spécificité chimique et néglige la richesse des informations codées dans les spectres vibratoires. De plus, le balayage séquentiel de l’échantillon à différentes fréquences entraîne des temps de séjour prolongés des pixels qui peuvent déclencher des photodommages et empêcher un corsage spatial rigoureux entre des images consécutives, conduisant à des artefacts de mouvement.
Contrairement à son homologue à bande étroite, la microscopie SRS à large bande récupère un spectre vibratoire par pixel à chaque balayage d’échantillon 10,12,24. Ainsi, le SRS à large bande fournit une imagerie hyperspectrale avec un enregistrement spatial strict des différents contrastes vibratoires, permettant une analyse rigoureuse des données. Cela révèle non seulement les constituants chimiques de l’échantillon à travers les spectres Raman, mais aide également à déterminer leurs concentrations relatives. Selon la façon dont les spectres sont acquis, la microscopie SRS à large bande est classée soit comme SRS hyperspectrale, soit srS multiplex. Dans le SRS hyperspectral, le spectre SRS par point scanné de l’échantillon est acquis séquentiellement (c’est-à-dire qu’il est récupéré en balayant le désaccordage de fréquence Ω), construisant un spectre SRS en empilant les signaux SRS lors de décalages Raman consécutifs. Le spectre Raman est mesuré simultanément à plusieurs modes vibratoires dans le SRS multiplex. Ainsi, l’approche SRS multiplex combine une impulsion modulée en bande étroite avec une impulsion à large bande pour piloter le signal SRS à différentes fréquences, et utilise un détecteur multicanal avec une sensibilité comparable à celle du SRS à bande étroite pour détecter les spectres SRS.
Cet article présente un protocole pour produire des cartes chimiques d’échantillons hétérogènes en utilisant la microscopie SRS multiplex. Un schéma du microscope SRS utilisé dans ce protocole est représenté à la figure 1 et décrit en détail ailleurs 25,26,27. En bref, un laser à fibre Yb à verrouillage de mode commercial, produisant des impulsions de 140 fs centrées à 1040 nm, avec une puissance moyenne de 10 W et un taux de répétition de 80 MHz, pilote le microscope SRS à large bande. Un séparateur de faisceau polarisant (PBS) sépare le faisceau fondamental en deux branches. Pour produire les impulsions de Stokes à bande étroite, une branche avec 4 W du faisceau fondamental est envoyée à un étalon qui génère un faisceau à bande étroite (≈15 cm-1), qui est ensuite modulé à 1,6 MHz avec un modulateur optique acoustique (AOM). La fraction restante avec 6 W du faisceau fondamental est doublée de fréquence avec un cristal de triborate de lithium (LBO) de 2,8 mm d’épaisseur, coupé pour l’appariement de phase de type I (θ = 90°, φ = 13,8°). La deuxième génération harmonique résultante à 520 nm se déplace vers une cavité pliée en X pour pomper un oscillateur paramétrique optique (OPO), un dispositif qui utilise un cristal LBO de 3,0 mm d’épaisseur (correspondance de phase de type I, θ = 90 °, φ = 9,8 °) comme milieu actif pour délivrer un rayonnement optique à large bande accordable dans la région spectrale 680-910 nm (Figure 2). Ces impulsions à large bande servent de pompe dans les expériences SRS et se propagent à un compresseur à prisme pour précompenser les effets de dispersion induits par l’objectif du microscope.
Après l’étape de compression, une plaque d’onde λ/2, combinée à une plaque biréfringente YVO4 , produit deux répliques orthogonalement polarisées dont la soustraction électronique au plan de détection annule le bruit de la pompe à large bande. Un miroir dichroïque combine la pompe et les faisceaux de Stokes et les envoie à un microscope vertical. Un objectif d’immersion dans l’eau avec une ouverture numérique (NA) de 1,27 concentre la lumière sur l’échantillon, tandis qu’un objectif d’immersion dans l’huile avec un NA de 1,4 la recueille. Avant l’étape de détection, un filtre passe-court (FPS) élimine les Stokes modulés, tandis qu’un réseau de diffraction fonctionnant en configuration Littrow disperse la pompe à large bande transmise. Un deuxième PBS2 sépare les répliques de pompe et un objectif les concentre sur deux réseaux de photodiodes. Les signaux de ces réseaux de photodiodes sont soustraits électroniquement et envoyés à un amplificateur multicanal (M-LIA) construit à la maison. Le signal démodulé est ensuite normalisé par les lectures de courant continu (DC) de l’un des réseaux de photodiodes, produisant ainsi le spectre SRL.
À titre d’expérience exemplaire, nous imageons des mélanges de plusieurs diffuseurs Raman bien connus, chacun avec un spectre Raman unique. Ainsi, le protocole commence par décrire comment préparer les échantillons de référence. Au fur et à mesure que nous détectons SRL, nous continuons à expliquer comment obtenir des impulsions Stokes à bande étroite et configurer la source optique qui délivre les impulsions de pompe à large bande (≈250 cm-1), à savoir l’OPO maison. Le protocole montre l’alignement et l’optimisation des faisceaux optiques, décrivant des paramètres critiques tels que la puissance et les spectres de la Stokes à bande étroite et de la pompe à large bande. Le protocole décrit en détail le chemin optique de la pompe à large bande car il nécessite des éléments optiques spéciaux. Il explique également comment trouver le chevauchement spatio-temporel entre les impulsions pump-Stokes et montre un moyen pratique de déterminer le bruit d’intensité relative (RIN), qui à son tour aide à définir la meilleure fréquence de modulation pour les expériences SRS. Ensuite, nous expliquons le principe de fonctionnement et l’étalonnage de la chaîne de détection. Enfin, le protocole montre le processus d’acquisition de données, la chimiométrie et le pipeline de traitement d’images.

<table><tbody><tr><td>Objectif de collection</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo Lambda S 60x Huile, NA=1.4,</td><td>Objectif à immersion Nikon Oil</td></tr><tr><td>Lamelles Thermo</td><td>Fisher</td><td>043211-KJ</td><td>Quartz, lamelle pour lame de microscope, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm</td></tr><tr><td>Ligne à retard</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>M-406.6PD</td><td>Platine de microtraduction de précision, portée de course de 150 mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>D8418-500ML</td><td>Méthylsulfinylméthane, DMSO de qualité biologie moléculaire, DMSO, étalon de méthylsulfoxyde</td></tr><tr><td></td><td>SLS Optics Ltd</td> Revêtement antireflet <td>sur mesure</td><td>à 1 040 nm, monté dans une cellule en acier inoxydable de 38 mm de diamètre x 35,5 mm de long avec capuchons anti-poussière de protection, et une cellule de 50 mm de diamètre pince à pince bague de montage</td></tr><tr><td>Objectif d’excitation</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon</td><td>Objectif à immersion dans l’eau</td></tr><tr><td>Caillebotis</td><td>LightSmyth</td><td>T-1850-800s Series</td> High <td>Efficiency Transmission Grating T-1850-800s</td></tr><tr><td>Series Laser</td><td>Coherent</td><td>Custom made</td><td>Fidelity, HP</td></tr><tr><td>&lambda ;/2</td><td>Thorlabs</td><td>SAHWP05M-1700</td><td>Superachromatique monté plaque demi-onde</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thorlabs</td><td>CM5-PBS203/M</td><td>16 mm Cube polarisant monté sur cage Cube,</td></tr> <tr><td>billes PMMA</td><td>Merck</td><td>MFCD00198073</td><td>Microparticules à base de polyméthacrylate</td></tr><tr><td>Prismes</td><td>Crisel</td><td>320-8218</td><td>PRISMES DE DISPERSION LASER en billes SF11</td></tr><tr><td>PS</td><td>Merck</td><td>72986-10ML-F</td><td>Microparticules à base de polystyrène</td></tr><tr><td>YVO4 crystal</td><td>Dr. Sztatecsny GmbH</td><td>Sur mesure</td><td>&nbsp ; Epaisseur 8 mm, dia 1,00 cm, 1 689,00 689,00 Convient pour monture 1", revêtu pour 850 - 1 100 nm</td></tr></tbody></table>

imagerie chimique multiplex basée sur la microscopie à diffusion raman stimulée à large bande

Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technique optique non linéaire pour l’imagerie chimique sans étiquette. Cet outil analytique fournit des cartes chimiques à grande vitesse et une résolution spatiale élevée d’échantillons minces en interrogeant directement leurs vibrations moléculaires. Dans sa mise en œuvre standard, la microscopie SRS est à bande étroite et forme des images avec une seule fréquence vibratoire à la fois. Cependant, cette approche non seulement entrave la spécificité chimique du SRS, mais néglige également la richesse des informations codées dans les spectres vibratoires. 
Ces limitations peuvent être surmontées par le SRS à large bande, une implémentation capable d’extraire un spectre vibratoire par pixel de l’image en parallèle. Cela fournit des données hyperspectrales qui, lorsqu’elles sont associées à une analyse chimiométrique, maximisent la quantité d’informations extraites de l’échantillon. Ainsi, le SRS à large bande améliore la spécificité chimique du système, permettant la détermination quantitative de la concentration des différents constituants d’un échantillon. Ici, nous rapportons un protocole d’imagerie chimique avec microscopie SRS à large bande, basé sur un microscope SRS fabriqué à la maison fonctionnant avec une détection d’amplificateur différentiel multicanal personnalisé. Il traite de la préparation de l’échantillon, de l’alignement de l’appareil SRS et de l’analyse chimiométrique. En acquérant des spectres Raman vibratoires, le protocole illustre comment identifier différentes espèces chimiques dans un mélange, en déterminant leurs concentrations relatives.

La figure 3 montre des résultats exemplaires obtenus en utilisant ce protocole avec PS, PMMA et huile d’olive. Cette rotation du LBO1 modifiera l’indice de réfraction ressenti par le champ SHG, modifiant directement sa vitesse de phase. Lorsque la vitesse de phase du champ SHG correspond à celle de la polarisation non linéaire induite dans LBO1, le champ généré non linéairement et la polarisation non linéaire seront en phase, ce qui entraînera un rayonnement SHG intense. En d’autres termes, le réglage de l’angle de φ de LBO1 permettra à l’utilisateur d’atteindre la condition idéale de correspondance de phase pour SHG. Comme un cristal correspondant à une phase de type I est utilisé ici, la polarisation du faisceau SHG sera orthogonale à celle du faisceau fondamental (figure 5B).
La figure 8 montre le RIN des sources optiques utilisées dans ce protocole et la limite de bruit de tir, qui est une conséquence de la nature quantique des électrons et des photons qui fixe une limite fondamentale au bruit laser. Le RIN limité par bruit de tir est calculé avec <img alt="Décibels par hertz (dB/Hz) représenté en fraction, concept mathématique pour l’analyse de l’intensité du signal." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> comme indiqué par Eq (3).
<img alt="Équation du bruit de tir, RIN_shot = 10log10(2hv/P̅), formule pour l’analyse du bruit optique." src="/files/ftp_upload/63709/63709eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> (3)
Où h est la constante de Planck, et ν est la fréquence optique. Ainsi, le bruit de prise de vue fournit des directives utiles pour la conception électronique.
La figure 11A et la figure 11C montrent des données exemplaires de spectres équilibrés et déséquilibrés. Naturellement, les effets de la détection équilibrée ont un impact sur les résultats finaux des expériences, à savoir les cartes chimiques. La figure 11B et la figure 11D montrent des images composites dans des conditions déséquilibrées et équilibrées, respectivement. La mise en œuvre réussie du protocole décrit aidera à identifier et à localiser les différents constituants chimiques d’un échantillon hétérogène et à extraire leurs spectres SRS caractéristiques. En soumettant les données hyperspectrales de la figure 12 à une analyse chimiométrique, on obtient la figure 13. La figure 13A montre un composite des cartes de concentration des différents constituants chimiques de l’échantillon, tandis que la figure 13B montre leurs spectres SRS caractéristiques. Notez que les données présentées à la figure 13A permettent non seulement à l’utilisateur d’identifier facilement les différents constituants de l’échantillon, mais aussi d’effectuer des analyses plus quantitatives. Par exemple, en utilisant les cartes de concentration, nous pourrions calculer la moyenne de la concentration fractionnée de chaque espèce chimique: 38% de DMSO, 25% de PMMA, 14% de PS et 22% d’huile d’olive.
<img alt="Schéma de configuration de la spectroscopie laser ; oscillateur paramétrique optique, SHG, absorption transitoire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Schéma du microscope SRS à large bande utilisé dans ce protocole. Abréviations: PBSx = séparateur de faisceau polarisant; SHG = deuxième module de génération harmonique; OPO = oscillateur paramétrique optique; AOM = modulateur optique acousto; SPF = filtre passe-court; M-LIA: Amplificateur de verrouillage multicanal; DM = miroir dichroïque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme spectral de la chromatographie ; pompes accordables et lignes Stokes ; Analyse de longueur d’onde." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Spectres de la pompe à large bande accordable (bleu) et des faisceaux stokes à bande étroite (rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Image microscopique de la dispersion du polymère dans les gouttelettes ; PS, PMMA, DMSO, étiqueté à l’huile ; analyse de dispersion." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Image en champ clair de l’échantillon chimiquement hétérogène. Notez que la microscopie conventionnelle ne permet pas de distinguer les différents constituants. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : PS = polystyrène; PMMA = polyméthacrylate de méthyle; DMSO = diméthylsulfoxyde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique de transmission en fonction du temps avec configuration de spectroscopie AOM, indiquant la modulation d’impulsion optique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: Modulation des impulsions de Stokes à bande étroite. (A) La trace bleue transparente montre le 0ème faisceau diffracté, tandis que la trace noire montre le1er ordre correspondant. (B) Configuration optique pour optimiser l’efficacité de modulation du faisceau diffracté de1er ordre et réglage fin de la taille du faisceau de Stokes avant d’arriver à l’objectif d’excitation. Abréviations : AOM = modulateur optique acousto ; fx = distance focale de l’objectif X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagrammes SHG et DFG ; Configuration optique avec cristaux LBO pour la conversion de fréquence et la génération de signaux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5 : Processus optiques non linéaires requis pour piloter l’OPO. (A) Géométrie de l’interaction SHG. Deux photons fondamentaux à ω1 amènent le système matériel à un niveau virtuel de haute énergie, d’où le système matériel saute à l’état fondamental, émettant un photon à ωSHG. (B) Schéma de l’expérience SHG. (C) Un schéma des configurations SHG et OPO. (D) Géométrie de l’interaction DFG. Un photonSHG ω est divisé en photons de signal (signal ω) et de ralenti (ωIdler). Un gain du faisceau de signal est obtenu en renvoyant les photons du signal et en les faisant résonner dans la cavité. (E) Schéma de l’expérience DFG. Abréviations : SMx = miroir sphérique (R = 75 mm) ; OPO = oscillateur paramétrique optique; SHG = deuxième module de génération harmonique; DFG = génération de différence de fréquence; LBO = triborate de lithium; OC = condenseur d’huile; DM = miroir dichroïque; fx = distance focale de l’objectif X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme de dispersion du prisme avec angles, deux prismes, réflexion miroir, analyse du chemin optique" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figure 6 : Géométrie du compresseur à prisme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Configuration optique pour la génération de somme-fréquence (SFG) ; graphique montrant l’amplitude SFG en fonction de la position de la ligne de retard." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figure 7 : Génération de fréquences de somme pour optimiser le chevauchement spatio-temporel. (A) SFG entre la pompe et Stokes et leur SHG respectif empiétant sur un écran. Ici, une lentille a focalisé la pompe et les faisceaux de Stokes sur le cristal, tandis qu’un filtre passe-bas les a retirés. (B) Intensité du SFG entre la pompe et Stokes en fonction du délai. Définissez le temps zéro de la configuration SRS à la position qui maximise le SFG. L’asymétrie de la corrélation croisée dans B est due au profil temporel causé par l’étalon sur le faisceau de Stokes. Abréviations : SFG = génération somme-fréquence ; SHG = deuxième module de génération harmonique; SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique d’analyse du bruit de Stokes-Pump ; RIN par rapport à la fréquence ; la bande passante idéale du SRS mise en évidence ; étude spectroscopique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figure 8 : Spectres RIN. La bande surlignée en vert montre la meilleure région spectrale pour les expériences SRS. La modulation du faisceau stokes à n’importe quelle fréquence de cette bande garantit que les effets du bruit laser sur le signal SRS seront les plus faibles possibles. Abréviations : RIN = bruit d’intensité relative; SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Configuration cohérente de la spectroscopie Raman anti-Stokes (CARS) montrant la pompe, le Stokes et les signaux combinés." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figure 9: Profils des faisceaux. (A) Pompe, (B) Stokes, et (C) Pompe et Stokes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme de réseau de diffraction, alignement linéaire du détecteur, β d’angle, distance focale f, mesure optique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig10.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 10"> Figure 10: Géométrie supposée d’un réseau de dispersion et d’un détecteur à réseau de photodiodes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig10large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Comparaison spectroscopique, analyse des spectres SRS et images de microscopie, configuration équilibrée ou déséquilibrée." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig11.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 11"> Graphique 11. Les effets de la détection équilibrée. Effets sur les spectres (A, C) et les images chimiques (B, D). Les composites présentés dans les panneaux (B) et (D) sont les résultats finaux des expériences (c’est-à-dire après analyse chimiométrique des données hyperspectrales). Voir la section 4 du protocole pour plus de détails). Barres d’échelle = 10 μm. Abréviation : SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme d’imagerie spectrale 3D avec analyse des numéros d’onde, mettant en évidence les pics d’absorption en microscopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig12.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 12"> Figure 12 : Un hypercube SRS représentatif acquis avec la microscopie SRS à large bande. Le plan x-y stocke les coordonnées des positions scannées, tandis que chaque vecteur le long de z enregistre un spectre SRS. Abréviation : SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig12large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Image microscopique de nanoparticules et graphique de spectroscopie ; Analyse de données spectrales avec pics de longueur d’onde." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63709/63709fig13.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 13"> Figure 13: Analyse chimiométrique des données HYPERSPECTRAL SRS. (A) Composite des cartes de concentration des différents constituants de l’échantillon. B) Spectres caractéristiques des espèces chimiques. Dans les deux panneaux, jaune: huile d’olive, bleu: DMSO, cyan: PS et orange: PMMA. Barre d’échelle = 20 μm (A). Abréviations : SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée ; PS = polystyrène; PMMA = polyméthacrylate de méthyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63709/63709fig13large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons un protocole pour acquérir des images chimiques avec la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande (SRS). Basé sur un microscope SRS qui fonctionne avec une détection différentielle multicanal, le protocole décrit la préparation de l’échantillon, l’ajustement de l’appareil SRS et la chimiométrie pour démêler différents constituants d’échantillons chimiquement hétérogènes.

Imagerie chimique multiplex basée sur la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps ...

Notre protocole décrit comment construire une microscopie à diffusion Raman stimulée, qui permet de mesurer le spectre vibratoire des molécules en quelques microsecondes. Et lorsqu’il est appliqué à l’imagerie, il peut fournir une microscopie hyperspectrale pour localiser et quantifier les constituants chimiques de la matière d’une manière non invasive et sans étiquette. Il existe plusieurs applications de ce protocole, principalement dans les sciences biologiques et biomédicales.Par exemple, pour imager des cellules ou des tissus. Notre approche comporte deux défis importants : la source optique à large bande et la chaîne de détection. Pour répondre aux premiers, on peut acheter un OPR ou en construire un soi-même.Alternativement, on peut utiliser le supercontinuum de lumière blanche généré dans des cristaux en vrac ou dans des fibres optiques non linéaires. Ce dernier défi peut être relevé en scannant séquentiellement chaque composant spectral avec une photodiode commerciale et un scanner galvo Pour commencer, extraire deux microlitres d’une suspension aqueuse de polyméthacrylate de méthyle, ou microbilles de PMMA, et verser la suspension sur un couvercle de microscope. Ensuite, extrayez deux microlitres d’une suspension aqueuse de microbilles de polystyrène et combinez-les avec la suspension en PMMA sur le couvercle.Mélangez doucement la suspension avec une pointe de pipette et laissez-la sécher pendant 24 heures. Une couche blanche de perles apparaîtra sur le couvercle lorsque l’eau se dessèchera. Ajouter 20 microlitres de diméthylsulfoxyde et 20 microlitres d’huile d’olive pure sur le couvercle.Et appliquez du vernis à ongles sur les bords du deuxième bordereau de couverture de microscope. Placez le couvercle sur le mélange, avec le vernis à ongles tourné vers le bas, et appliquez suffisamment de pression pour le sceller. Laissez sécher.Optimiser l’efficacité de modulation du faisceau Stokes à bande étroite. Changez la distance entre les lentilles F1 et F2, et mesurez le faisceau modulé avec une photodiode. Ensuite, enregistrez son profil avec un oscilloscope.Ajustez la longueur de la cavité de l’oscillateur paramétrique optique de manière à ce que le spectre de la pompe à large bande résultante, ainsi que le Stokes à bande étroite à 1040 nanomètres, puissent produire un désaccordage de fréquence dans les 2 800 à 3 100 centimètres inverses. Cette gamme spectrale couvre les vibrations de la région d’étirement CH. Envoyez la pompe à large bande à un compresseur à prisme pour compenser les effets de dispersion inclus par l’objectif du microscope d’excitation.Entrez la pompe dans le prisme A, à travers son sommet, et guidez la pompe dispersée vers le sommet du prisme B.Définissez la quantité de dispersion négative nécessaire et définissez la distance entre les prismes apices en conséquence. Utilisez des prismes coupés Brewster et assurez-vous que la polarisation du faisceau de pompe se trouve dans les plans triangulaires des prismes. Pour optimiser le schéma de détection équilibré en ligne, réglez l’axe rapide de ce cristal biréfringent à la verticale et guidez la pompe polarisée vers une plaque YV04 d’une longueur de 13,3 millimètres.Ensuite, utilisez une plaque demi-onde pour régler la polarisation du faisceau de la pompe à 45 degrés. Combinez la pompe et les faisceaux Stokes avec un miroir dichroïque et alignez-les soigneusement avec une paire de trous d’épingle fluorescents. Assurez-vous que les deux faisceaux se propagent de manière co-linéaire.Atténuez les faisceaux et guidez-les sur une photodiode rapide pour les chevaucher temporairement. Après cela, retirez la photodiode. Ensuite, mesurez les profils de faisceau avec une caméra calibrée et utilisez une carte infrarouge pour estimer les diamètres à l’œil.Utilisez deux télescopes. Un pour la pompe et un autre pour le faisceau de Stokes, et essayez de faire correspondre les diamètres du faisceau à l’ouverture arrière de l’objectif d’excitation. Une fois que la diffusion Raman stimulée, ou signal SRS, est obtenue, utilisez le télescope sur le faisceau de la pompe pour modifier son diamètre, en faisant varier sa portée de Rayleigh et, par conséquent, le volume d’interaction au foyer du microscope.Arrêtez-vous lorsque le SRS maximal est atteint. Utilisez une photodiode pour mesurer l’intensité du faisceau de la pompe et, avec la réceptivité de la photodiode, calculez la puissance moyenne qui affecte la zone active du détecteur. Pour mesurer le bruit d’intensité relative du laser, déconnectez le filtre passe-bas et connectez la sortie d’une photodiode à large bande passante à l’entrée d’un amplificateur verrouillable.Stockez la sortie de verrouillage en volts sur la racine carrée de Hertz à différentes fréquences de démodulation et utilisez la réceptivité des diodes photo pour convertir les volts en watts. Guidez la pompe et les faisceaux de Stokes vers le microscope. Placez l’échantillon et trouvez une région sans perles pour aider à aligner le faisceau de la pompe.Ensuite, rendez les objectifs d’excitation et de collecte confocaux. Placez un filtre passe-court pour retirer les Stokes modulés et guidez le faisceau de la pompe vers le nivellement. Placez une lentille après le classement pour focaliser le faisceau dispersé sur les détecteurs.Pour une détection équilibrée, mesurez le spectre de la référence et les répliques de signaux se propageant le long du faisceau de la pompe. Placez une petite fente, ou un iris, entre le graduage et un séparateur de faisceau polarisant, pour garantir la correspondance spectrale entre les deux réseaux de photodiodes et pour filtrer la pompe dispersée dans l’espace. Coupez tous les composants spectraux sauf un des répliques de pompe pour centrer les rayons transmis sur le nième détecteur des réseaux de photodiodes de référence et de signal.Utilisez les rétroviseurs de direction pour ajuster la corrélation des différents canaux de détection. Pour démarrer la microscopie SRS: modulez les Stokes, scannez l’échantillon et acquérez le transfert de modulation sur le spectre de la pompe avec son spectre CC correspondant pour obtenir le spectre SRS normalisé de chaque pixel. Produire des matrices tridimensionnelles, dont les lignes et les colonnes contiennent les positions numérisées de l’échantillon.Sur chaque vecteur orthogonal au plan XY, stockez un spectre SRS. Tracer la concentration et les profils spectraux pour acquérir les images chimiques et les spectres caractéristiques des constituants chimiques de l’échantillon. L’image représentative montre les spectres de bruit d’intensité relative des sources optiques utilisées dans ce protocole.Voici la meilleure région spectrale pour les expériences SRS. La modulation du faisceau stokes à n’importe quelle fréquence de cette bande garantit que les effets du bruit laser sur le signal SRS seront les plus faibles possibles. Des données exemplaires des spectres déséquilibrés et équilibrés sont présentées ici.Les effets d’une détection équilibrée ont un impact sur les résultats finaux des expériences. À savoir, les cartes chimiques. Les images composites dans des conditions déséquilibrées et équilibrées sont montrées ici.Les images représentatives montrent une analyse chimiométrique des données hyperspectrales du SRS. Un composite des cartes de concentration des différents constituants chimiques de l’échantillon et de leurs spectres SRS caractéristiques est présenté ici. À partir de ces données, les différents constituants de l’échantillon, par exemple l’huile d’olive, le polystyrène DMSO et le polyméthacrylate de méthyle, peuvent être facilement identifiés.Actuellement, notre technique ne peut sonder que l’étirement vibratoire CH. Cependant, en optimisant la source optique, la même chaîne de détection nous permettra d’explorer la région d’empreintes digitales plus informative détectant plusieurs modes à la fois. Notre chaîne de détection ouvre la voie à l’intégration du SRS à large bande dans les cliniques, en introduisant une technologie qui complétera et améliorera le flux de travail histopathologique traditionnel pour le diagnostic tissulaire.

multiplex-chemical-imaging-based-on-broadband-stimulated-raman

Research

Recherche

JoVE Journal

Engineering

Ingénierie

&lt;p style='hauteur-de-ligne :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;Source : Espinoza, R., et al. Imagerie par diffusion Raman stimulée bicolore en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire. J. Vis. exp. (2022). La vidéo démontre l’imagerie par diffusion Raman stimulée bicolore (SRS) de sections de tissu cérébral de souris. Deux faisceaux laser synchronisés sont dirigés sur la section tissulaire pour exciter les vibrations moléculaires, ce qui entraîne un...

Imagerie bicolore de diffusion Raman stimulée du tissu cérébral de souris

Dans ce manuscrit, la mise en œuvre d'un microscope à diffusion Raman (SRS) stimulé, obtenue par l'intégration d'un sER expérimental avec un microscope à balayage laser, est décrite. Le microscope SRS est basé sur deux sources laser femtoseconde (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) et un oscillateur paramétrique optique synchronisé (OPO).

Mise en œuvre d'un microscope non linéaire basé sur la diffusion stimulée de Raman

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet l’imagerie sélective et sans étiquette de fractions chimiques spécifiques et elle a été utilisée efficacement pour imager des molécules lipidiques in vivo. Ici, nous fournissons une brève introduction au principe de la microscopie SRS et décrivons des méthodes pour son utilisation dans le stockage des lipides d’imagerie dans Caenorhabditis elegans.

Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technique d’imagerie puissante, non destructive et sans étiquette. Une application émergente est l’histologie Raman stimulée, où l’imagerie SRS bicolore aux transitions Raman protéique et lipidique est utilisée pour générer des images de pseudo-hématoxyline et d’éosine. Ici, nous démontrons un protocole pour l’imagerie SRS bicolore en temps réel pour le diagnostic tissulaire.

Imagerie par diffusion Raman stimulée en deux couleurs en temps réel du cerveau de souris pour le diagnostic tissulaire

L’imagerie électronique par diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) de colorants Raman de type arc-en-ciel est une nouvelle plate-forme pour l’imagerie de protéines à base d’épitopes hautement multiplexées. Ici, nous présentons un guide pratique comprenant la préparation des anticorps, la coloration des échantillons de tissus, l’assemblage du microscope SRS et l’imagerie tissulaire epr-SRS.

Imagerie tissulaire hautement multiplexée avec des colorants Raman

Cet article présente l’intégration d’un module de focalisation spectrale et d’un laser à impulsions à double sortie, permettant une imagerie hyperspectrale rapide des nanoparticules d’or et des cellules cancéreuses. Ce travail vise à démontrer les détails des techniques optiques non linéaires multimodales sur un microscope à balayage laser standard.

Imagerie biomoléculaire de l’absorption cellulaire de nanoparticules à l’aide de la microscopie optique multimodale non linéaire

Cet article compare directement la résolution, la sensibilité et les contrastes d’imagerie de la diffusion Raman stimulée (SRS) et de la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) intégrées dans la même plate-forme de microscope. Les résultats montrent que CARS a une meilleure résolution spatiale, SRS donne de meilleurs contrastes et une meilleure résolution spectrale, et les deux méthodes ont une sensibilité similaire.

Comparaison directe de la diffusion Raman stimulée hyperspectrale et de la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente pour l’imagerie chimique

À l’aide d’une plate-forme multimodale combinant des modalités d’imagerie optique sans marquage, nous avons développé un protocole pour visualiser et quantifier la dynamique cellulaire et le métabolisme. Grâce à l’imagerie par fluorescence multiphotonique, à la génération de secondes harmoniques et à la microscopie à diffusion Raman stimulée, nous pouvons générer une vue d’ensemble holistique de l’environnement cellulaire et moléculaire.

Plate-forme d’imagerie optique multimodale pour l’étude du métabolisme cellulaire

Un microscope à transformée de Fourier à large champ, basé sur un interféromètre biréfringent compact et ultra-stable, permet l’acquisition parallèle des spectres pour tous les pixels d’un détecteur 2D. L’approche dans le domaine temporel permet de démêler la photoluminescence et les signaux Raman, et permet un cartographie Raman rapide (~5 ms/pixel) avec une résolution spatiale de ~1 μm et une résolution spectrale de 23 cm-1 .

Un microscope Raman multimodal à grande transformée de Fourier

Découvrez la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande pour l'imagerie chimique multiplex sans marquage. Cette méthode permet d'identifier et de quantifier les constituants chimiques dans les échantillons biologiques de manière non invasive.

Imagerie chimique multiplex basée sur la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande

Explorer plus de vidéos