Name: Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Apprenez à isoler des cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et à les différencier en lignée musculaire squelettique. Cette méthode garantit une haute viabilité cellulaire avec une contamination minimale par les cellules endothéliales.

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Nous remercions M. Ojas Tikoo pour son aide pour le tournage et la production vidéo. Nous reconnaissons également l’aide reçue du personnel du GARBH-Ini (Groupe interdisciplinaire sur la recherche avancée et l’issue de la naissance -DBT India), des infirmières et des agents de recherche principaux de l’hôpital civil gurugram et du Dr Pallavi Kshetrapal pour l’aide à la logistique. Ce travail a été soutenu par des subventions accordées à Suchitra Gopinath par le Département de biotechnologie de l’Inde (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

L’utilisation du tissu de cordon ombilical dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel pour la recherche sur les cellules souches (IC-SCR), le Comité d’éthique institutionnelle, l’Institut translationnel des sciences et de la technologie de la santé (IEC-THSTI), le Comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital civil de Gurugram, Haryana, et le Comité institutionnel de biosécurité, THSTI. Des échantillons de tissu de cordon humain ont été prélevés lors d’accouchements à terme au moment de la naissance. Le consentement écrit éclairé a été obtenu des sujets. Toutes les méthodes ont été mises en œuvre conformément aux directives et réglementations pertinentes.
1. Isolement des CSM du tissu du cordon ombilical
<ol><li>Au moment de l’accouchement, coupez au moins 5 cm de cordon, de préférence plus près du placenta, et stérilisez le cordon en frottant la surface extérieure avec de l’éthanol à 70%. Transférer séquentiellement le morceau de tissu de cordon d’un tube de collecte de 50 mL contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un autre contenant la même chose. Transporter le tube de collecte portant le nom du sujet sur glace jusqu’au laboratoire dans un délai de 1 h. REMARQUE: Pour une étude plus vaste, il peut être utile de code-barres des échantillons pour permettre leur suivi tout au long de l’étude. Il est important de noter que tout le personnel manipulant des tissus humains devrait se voir offrir le schéma thérapeutique complet du vaccin contre l’hépatite B.</li>
	<li>En laboratoire, allumez l’UV pendant 25 minutes dans la hotte BSL-2 pour stériliser les instruments et les pipettes autoclavés avant utilisation.</li>
	<li>Transférer le morceau de tissu de cordon du tube de collecte dans une boîte de 10 cm2 traitée par culture tissulaire contenant du PBS enrichi en 5 g/L de glucose, 50 μg/mL de gentamicine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine B, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (schéma à la figure 1).</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel, trancher le tissu du cordon verticalement le long de son axe longitudinal pour obtenir deux demi-pièces cylindriques. En raison de la torsion du cordon et de la surface mucoïde, épinglez le tissu avec une paire de pinces tenues dans l’autre main.</li>
	<li>À ce stade, observez les artères ombilicales et la veine et retirez les vaisseaux sanguins à l’aide d’un scalpel pour les gratter dans une direction de la surface. Rincez à nouveau le tissu du cordon ombilical dans le PBS pour éliminer tout le sang résiduel associé au tissu. Assurez-vous que le raclage est doux pour préserver l’intégrité des cellules dans le WJ entourant les vaisseaux.</li>
	<li>Hacher chaque moitié du tissu du cordon en fragments de 0,5 cmde 3 tailles et placer les fragments avec la surface luminale vers le bas sur le plat. Incuber brièvement le plat pendant 10 min dans une chambre humidifiée à 37 °C contenant 5 % de CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, inonder la boîte contenant les morceaux de tissu du cordon avec 20 mL de milieu contenant MEM Alpha Modification sans L-glutamine, ribo- et désoxyribonucléosides, 15% de sérum bovin fœtal (non inactivé par la chaleur) et 50 μg / mL de gentamycine. Ajouter doucement le milieu de croissance le long des côtés pour éviter que les explantes tissulaires ne soient délogées de leur orientation. Ajouter l’excès de milieu pour tenir compte d’une fraction qui sera absorbée par les explantes tissulaires pendant l’incubation.</li>
	<li>Après 3 jours d’incubation, ajoutez du milieu frais aux cultures. Assurez-vous que les cultures sont protégées des chocs et des mouvements des explants lors de la manipulation de la vaisselle.</li>
	<li>Après 1 semaine, retirez les fragments de tissu individuellement à l’aide d’une pince stérile et jetez-les à l’aide de sacs appropriés pour l’élimination. Conserver le milieu existant et ajouter 10 mL de milieu de croissance frais. Remplacez le milieu de croissance tous les 4 jours jusqu’à ce que les colonies individuelles atteignent une confluence de 70%. REMARQUE: Il est probable que les cellules ne seront pas réparties uniformément dans tout le plat, car il y aura des colonies prolifératives individuelles qui devront être surveillées pour la confluence avec le temps. Généralement, en un mois, un plat de 10 cm2 génère suffisamment de cellules pour être divisé en un plat séparé.</li>
	<li>Récoltez les cellules adhérentes à l’aide d’une solution de trypsine/EDTA (1x 0,25% de trypsine et 0,02% d’EDTA dans la solution saline équilibrée de Hanks [HBSS]). Centrifuger la suspension cellulaire à 470 × g pendant 5 min à 25 °C et remettre la pastille cellulaire en milieu de croissance.</li>
</ol>2. Immunophénotypage et propagation de l’uMSCS
<ol><li>Procéder à l’immunophénotypage une fois que les cellules adhérentes ont atteint 50% à 60% de confluence et sont bien réparties. N’effectuez pas d’analyse des marqueurs MSC sur des cultures entièrement confluentes, car cela tend à provoquer une régulation négative des marqueurs MSC clés.</li>
	<li>Après la trypsinisation, distribuer une suspension cellulaire de 1 × 106 cellules/mL dans des tubes FACS (1 × 105 cellules/tube) et la coloration avec des anticorps appropriés liés aux fluorophores (tous dilutions 1:50) en combinaison : non colorés ; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluorophore commun); contrôles d’isotype pour chaque fluorophore. Enregistrez un nombre total d’événements d’au moins 10 000 sur le cytomètre en flux pour une analyse plus approfondie. REMARQUE : Étant donné que les cellules sont analysées séparément pour chaque marqueur de surface, il n’est pas nécessaire de contrôler les sous-ensembles de cellules.</li>
	<li>En plus des marqueurs ci-dessus, confirmer la présence de marqueurs de surface positifs et négatifs dans les lignes uMSC créées à partir d’échantillons individuels de tissu de cordon (tableau 1).</li>
	<li>Analysez les cellules marquées par cytométrie en flux et déterminez le pourcentage de cellules CD105+CD90+ et CD105+CD73+ . Analysez séparément les cellules CD105+ et CD34−CD45− .</li>
</ol>3. Différenciation des cSM en muscle squelettique
<ol><li>Enduire les plaques de culture tissulaire avec 0,01% de collagène et 20 μg/mL de laminine dans le PBS. Enduisez ces plaques pendant au moins 4 h à température ambiante.</li>
	<li>Plaque uMSC à une densité de 10 000 cellules/cm2 en milieu de croissance.</li>
	<li>Lorsque les cellules sont confluentes à 70%, aspirez le milieu de croissance et rincez les cultures 2x avec du PBS. Ajouter au CSM un milieu de différenciation myogénique (M1) composé de DMEM + 5 % de sérum de cheval + 0,1 μM de dexaméthasone + 50 μM d’hydrocortisone. Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, ajouter le milieu M1 tous les deux jours aux cultures.</li>
	<li>Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, analysez les cSM pour l’expression de Pax7, MyoD, Myogénine et MyHC à 2 jours, 4-5 jours, 6-7 jours et 10-14 jours, respectivement.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Étapes critiques Une étape critique de ce protocole est la collecte de tissus dans des conditions aseptiques, du moment de l’accouchement au maintien des cultures stériles, pendant toute la durée de la propagation. Lors de la collecte du cordon, il est essentiel que le cordon ne touche aucune surface non stérilisée et soit tamponné à l’extérieur avec de l’éthanol à 70% avant d’être collecté dans des tubes contenant du PBS complété par des antibiotiques. Il est important de limiter le temps entre la co...

Le cordon ombilical humain a été crédité de posséder un réservoir robuste de cellules souches mésenchymateuses, qui sont actuellement explorées pour les thérapies régénératives en raison de leurs taux de prolifération et de différenciation robustes, de leurs propriétés immunomodulatrices et de leur capacité à générer des cellules à partir des trois couches germinales1. Le tissu du cordon ombilical se compose de plusieurs compartiments tels que le sang de cordon ombilical, le sous-endothélium de la veine ombilicale et la gelée de Wharton (WJ), qui englobe en soi trois régions indistinctes: la zone périvasculaire, la zone intervasculaire et le sous-amnion ou la muqueuse du cordon (CL)2. Bien que les uMSC puissent être isolés de toutes ces différentes régions et exprimer largement les marqueurs clés du MSC, il n’est pas clair si ces compartiments contiennent la même population d’uMSC ou présentent des différences dans leurs puissances de différenciation3. Par conséquent, les protocoles d’isolement des uMSC nécessitent une plus grande précision dans leur mode et leur région d’isolement, la caractérisation robuste des potentiels de différenciation et, enfin, une analyse comparative à partir de différents compartiments du cordon. 
Dans ce contexte, peu d’études ont démontré des différences dans les potentiels prolifératifs et différentiatifs de l’uMSC entre les différentes parties du cordon. Parmi ceux-ci, des analyses comparatives entre des uMSC isolés des régions CL et WJ ont révélé un plus grand potentiel prolifératif dans les uMSC dérivés de CL 3,4. Dans une étude distincte, les uMSC dérivés du WJ ont obtenu de meilleurs résultats dans les essais de prolifération que les cellules périvasculaires (HUCPV)5. Lors de l’examen des différences entre les cSEm dérivés du sang de cordon et les cSEm dérivés du tissu de cordon ombilical dépourvus de contamination vasculaire, une expression différentielle des marqueurs clés du CSM a été rapportée entre les deux compartiments, ainsi qu’une augmentation des taux de prolifération dans les cSEm dérivés du tissu du cordon6.
Parmi les nombreuses études examinant les potentiels de différenciation des cSEm principalement dans les tissus de la lignée mésodermique tels que les lignées ostéogéniques, adipogéniques et chondrogènes, très peu ont fourni des protocoles détaillés pour la différenciation myogénique et la caractérisation ultérieure, ainsi que des analyses comparatives entre divers compartiments du cordon. Dans ce contexte, nous avons développé un protocole robuste de différenciation musculaire et observé que les uMSC dérivés du tissu du cordon présentaient des capacités de différenciation myogénique supérieures à celles du sang de cordon6. Ici, un protocole par étapes est détaillé pour l’isolement des uMSC de l’ensemble du tissu du cordon dépourvu de cellules associées au système vasculaire, leur caractérisation et leur différenciation dans la lignée myogénique.

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique 100x Liquide, testé pour les endotoxines (10 000 U de pénicilline et 10 mg de streptomycine/mL dans une solution saline normale à 0,9 %)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAPDH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-MyHC (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-MyoD (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-myogénine (clone F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Clone CD90 anti-humain 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II ou FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, qualifié Brésil</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>ne pas être inactivé thermiquement</td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humaine Clone CD106 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humain CD14 clone M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humain clone CD31 WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humain CD34 clone 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humain CD45 clone HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humain CD49D clone 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humaine CD90 clone 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humaine HLA-A,B,C clone G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humain IgG clone G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha Modification sans L-glutamine, ribo- et désoxyribonucléosides</td><td>Hyclone</td><td>SH30568. FS</td><td>Milieu basal pour uMSCs</td></tr><tr><td>PE Souris clone CD105 anti-humain 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Souris clone CD44 anti-humain 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Souris anti-humain CD49E clone llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE Souris clone IgG anti-humain G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Souris anti-humaine CD73 CLONE AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH = 7,4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>Solution de trypsine/EDTA (1x 0,25 % de trypsine et 0,02 % d’EDTA dans une solution saline équilibrée Hanks (HBSS)</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

L’exploration du potentiel thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses dépend de la facilité d’isolement, de la puissance vers la différenciation, ainsi que de la fiabilité et de la robustesse de la source. Nous décrivons ici un protocole par étapes pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain (cSM), leur immunophénotypage et la propagation de telles cultures sur plusieurs passages. Dans cette procédure, la viabilité des uMSC est élevée car il n’y a pas de digestion enzymatique. De plus, l’ablation des vaisseaux sanguins, y compris les artères du cordon ombilical et la veine, garantit qu’il n’y a pas de contamination des cellules d’origine endothéliale. En utilisant la cytométrie en flux, les cSEm lors de l’isolement sont CD45−CD34−, ce qui indique une absence de cellules de la lignée hématopoïétique. Il est important de noter qu’ils expriment les marqueurs de surface clés, CD105, CD90 et CD73. Lors de l’établissement des cultures, cet article décrit une méthode efficace pour induire la différenciation de ces uMSC dans la lignée musculaire squelettique. Une analyse détaillée de la progression myogénique dans les uMSC différenciés révèle que les uMSC expriment Pax7, un marqueur des progéniteurs myogéniques dans les premiers stades de différenciation, suivis de l’expression de MyoD et Myf5, et, enfin, d’un marqueur de différenciation terminal, la chaîne lourde de myosine (MyHC).

Le succès de l’isolement des cSUm du tissu du cordon ombilical est &gt;95%, contrairement aux faibles taux de réussite du sang de cordon entier. Une fois l’isolement réussi des cSEm, l’analyse FACS révèle que toutes les cellules sont CD34−CD45−CD105+CD90+. Cependant, dans l’analyse comparative, les cSEm isolés du sang de cordon présentent des populations hétérogènes, dans lesquelles une proportion de cellules présentent CD34 + CD45 + CD105+ (~ 1...

Nous décrivons un protocole pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation dans la lignée musculaire squelettique.

Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Nous décrivons notre protocole pour isoler les cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain et une méthode robuste pour les différencier en lignée musculaire squelettique. Cette technique nous permet d’isoler des cellules souches mésenchymateuses possédant une viabilité et une chaleur élevées, avec peu ou pas de contamination des cellules d’origine endothéliale et d’induire efficacement la différenciation myogénique dans ces maladies. La torsion du cordon et la consistance mucoïde rendent difficile la manipulation du cordon.Nous montrons comment traiter le cordon, ne pas gratter la gelée de Wharton et exclure les cellules endothéliales de la population. Après avoir prélevé le tissu de cordon au moment de la livraison, transférez le morceau de tissu de cordon du tube de collecte dans un plat traité par culture de tissu de 10 centimètres carrés et lavez soigneusement le tissu avec du PBS frais. Pour prendre soin de la torsion du cordon et de la surface mucoïde, épinglez le tissu avec une paire de pinces tenues dans une main.À l’aide d’un scalpel, trancher le tissu du cordon verticalement le long de son accès longitudinal pour obtenir deux demi-pièces cylindriques. À ce stade, observez les artères ombilicales et les veines. À l’aide d’un scalpel, retirez les vaisseaux sanguins en les grattant dans une direction de la surface et rincez le tissu du cordon dans le PBS pour éliminer tout le sang résiduel associé au tissu.Hachez chaque moitié du tissu du cordon en fragments de 0,5 centimètre cube. Placez les fragments avec la surface luminale vers le bas sur le plat et incubez brièvement le plat pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajouter doucement 20 millilitres de milieu contenant la modification MEM Alpha le long des côtés du plat contenant le tissu du cordon.Assurez-vous que les explantes ne sont pas délogées de leur orientation et ajoutez un excès de milieu pour tenir compte d’une fraction que les explantes tissulaires absorberont pendant l’incubation. Ensuite, placez le plat dans l’incubateur pendant trois jours. Après la fin de l’incubation, ajoutez du milieu frais à la culture et assurez-vous que les cultures sont protégées des chocs et des mouvements des explants lors de la manipulation des plats.Après une semaine, à l’aide de pinces stériles, retirez les fragments de tissu individuellement et jetez-les à l’aide de sacs de risque biologique appropriés pour l’élimination. Conserver le milieu existant et ajouter 10 millilitres de milieu de croissance frais. Remplacez le milieu de croissance tous les quatre jours jusqu’à ce que les colonies individuelles atteignent une confluence de 70% Après avoir coloré les cellules comme décrit dans le manuscrit, analysez les cellules marquées par cytométrie en flux et déterminez le pourcentage de cellules CD105 CD90 positives et CD105 CD73 positives.Analysez séparément les cellules CD105 positives et CD34 NÉGATIVES CD45. Enduisez la plaque de culture tissulaire de 0,01% de collagène et de 20 microgrammes par millilitre de laminine dans du PBS et placez-la sur le culbuteur pendant au moins quatre heures à température ambiante. Après l’incubation, retirez le collagène et lavez la plaque avec du PBS, puis plaquez des uMSC à 10 000 cellules par centimètre carré de densité dans le milieu de croissance.Une fois que les cellules atteignent 70% de confluence, aspirez le milieu de croissance et rincez la plaque de culture deux fois avec du PBS. Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, ajoutez le milieu M1 tous les deux jours aux cultures et analysez les cSEm pour l’expression de la chaîne lourde pax7, MyoD, myogénine et myosine à deux jours, quatre à cinq jours, six à sept jours et dix à quatorze jours respectivement. Les cSEm affichent l’expression de CD105 et CD90 et n’expriment pas les marqueurs hématopoïétiques CD34 et CD45.Les uMSC étaient également positifs pour l’expression du marqueur CD73 des uMSC, ce qui indique que les uMSC exprimaient plusieurs marqueurs clés. Les uMSC ont montré une expression de pax7 dans les deux premiers jours suivant l’ajout de M1, suivie de l’expression de MyoD dans les quatre premiers jours de l’ajout de M1. Les cellules expriment la protéine de myogénine à six jours de différenciation, suivie de l’expression de la chaîne lourde de myosine entre 10 jours et 14 jours après l’induction de la différenciation.970 gènes ont été régulés à la hausse en réponse à l’induction de la différenciation myogénique par rapport aux cSEm indifférenciés. Plus de gènes myogéniques ont été régulés à la hausse dans les cSEm dérivés du tissu de cordon par rapport aux cSEm dérivés du sang de cordon. Le tissu de cordon et le sang de cordon ont montré une régulation à la hausse des gènes liés aux protéines du cytosquelette, associés à la liaison à l’actine et à l’assemblage du sarcomère, aux transporteurs associés à la fonction contractile, au maintien de la masse musculaire, à la signalisation du calcium et à la fonction enzymatique.Prélever le tissu dans un état aseptique et maintenir une culture stérile. Le cordon doit être balayé à l’extérieur avec de l’éthanol à 70% et traité le plus rapidement possible. De nombreuses thérapies régénératives nécessitent un grand nombre de cellules provenant des premiers passages.Il peut également être utilisé comme modèle pour imiter l’ensemble de l’environnement sec et refléter le métabolisme postnatal.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

Isoler des cellules souches adultes provenant de tissus mous musculosquelettiques basé sur la vitesse adhésion de la cellule dans le ballon.

Isoler des cellules souches à partir des tissus mous musculo-squelettiques

Les vaisseaux sanguins à l'intérieur du squelette port musculaire plusieurs populations de précurseurs multi-lignée humaine qui sont idéales pour les applications de régénération. Cette méthode permet l'isolement de purification simultanée de trois populations de cellules précurseurs pluripotentes respectivement à partir de trois couches de structure des vaisseaux sanguins: les cellules myogéniques endotheliales de l'intima, média de péricytes et les cellules de l'adventice de l'adventice.

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Ici, nous décrivons un protocole basé sur la reprogrammation épigénétique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) vers la génération d'une population homogène de progéniteurs musculo-squelettiques, dans des conditions de culture permissive former des amas tridimensionnels de myofibrilles contractiles (les myospheres), qui récapitulent les caractéristiques biologiques de l'homme les muscles squelettiques.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

Ici, nous proposons un protocole pour la différenciation chondrogénique des cellules souches pluripotentes induites par les cellules mononucléaires du sang du cordon de l'omble.

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Cordon ombilical humain (UC) peuvent être obtenu au cours de la période périnatale à la suite de terme prématuré et postterm de livraison. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC dérivées de cellules souches mésenchymateuses (UC-MSCs) du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme

Nous vous proposons un protocole qui montre comment différencier des fibroblastes et des kératinocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites et générer un organoïde peau 3D, à l’aide de ces kératinocytes et des fibroblastes. Ce protocole comporte une étape supplémentaire de la génération d’un modèle de souris humanisées. La technique présentée ici permettra d’améliorer la recherche dermatologique.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

Ce protocole décrit et compare deux méthodes représentatives pour différencier les hiPSCs en cellules stromales mésenchymateuses (CSM). La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile. La méthode des corps embryoïdes (EBs) se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses

Apprenez à isoler des cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et à les différencier en lignée musculaire squelettique. Cette méthode garantit une haute viabilité cellulaire avec une contamination minimale par les cellules endothéliales.

Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique

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