Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique

Nous décrivons notre protocole pour isoler les cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain et une méthode robuste pour les différencier en lignée musculaire squelettique. Cette technique nous permet d’isoler des cellules souches mésenchymateuses possédant une viabilité et une chaleur élevées, avec peu ou pas de contamination des cellules d’origine endothéliale et d’induire efficacement la différenciation myogénique dans ces maladies. La torsion du cordon et la consistance mucoïde rendent difficile la manipulation du cordon.

Nous montrons comment traiter le cordon, ne pas gratter la gelée de Wharton et exclure les cellules endothéliales de la population. Après avoir prélevé le tissu de cordon au moment de la livraison, transférez le morceau de tissu de cordon du tube de collecte dans un plat traité par culture de tissu de 10 centimètres carrés et lavez soigneusement le tissu avec du PBS frais. Pour prendre soin de la torsion du cordon et de la surface mucoïde, épinglez le tissu avec une paire de pinces tenues dans une main.

À l’aide d’un scalpel, trancher le tissu du cordon verticalement le long de son accès longitudinal pour obtenir deux demi-pièces cylindriques. À ce stade, observez les artères ombilicales et les veines. À l’aide d’un scalpel, retirez les vaisseaux sanguins en les grattant dans une direction de la surface et rincez le tissu du cordon dans le PBS pour éliminer tout le sang résiduel associé au tissu.

Hachez chaque moitié du tissu du cordon en fragments de 0,5 centimètre cube. Placez les fragments avec la surface luminale vers le bas sur le plat et incubez brièvement le plat pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajouter doucement 20 millilitres de milieu contenant la modification MEM Alpha le long des côtés du plat contenant le tissu du cordon.

Assurez-vous que les explantes ne sont pas délogées de leur orientation et ajoutez un excès de milieu pour tenir compte d’une fraction que les explantes tissulaires absorberont pendant l’incubation. Ensuite, placez le plat dans l’incubateur pendant trois jours. Après la fin de l’incubation, ajoutez du milieu frais à la culture et assurez-vous que les cultures sont protégées des chocs et des mouvements des explants lors de la manipulation des plats.

Après une semaine, à l’aide de pinces stériles, retirez les fragments de tissu individuellement et jetez-les à l’aide de sacs de risque biologique appropriés pour l’élimination. Conserver le milieu existant et ajouter 10 millilitres de milieu de croissance frais. Remplacez le milieu de croissance tous les quatre jours jusqu’à ce que les colonies individuelles atteignent une confluence de 70% Après avoir coloré les cellules comme décrit dans le manuscrit, analysez les cellules marquées par cytométrie en flux et déterminez le pourcentage de cellules CD105 CD90 positives et CD105 CD73 positives.

Analysez séparément les cellules CD105 positives et CD34 NÉGATIVES CD45. Enduisez la plaque de culture tissulaire de 0,01% de collagène et de 20 microgrammes par millilitre de laminine dans du PBS et placez-la sur le culbuteur pendant au moins quatre heures à température ambiante. Après l’incubation, retirez le collagène et lavez la plaque avec du PBS, puis plaquez des uMSC à 10 000 cellules par centimètre carré de densité dans le milieu de croissance.

Une fois que les cellules atteignent 70% de confluence, aspirez le milieu de croissance et rincez la plaque de culture deux fois avec du PBS. Pour déterminer la cinétique de la progression myogénique, ajoutez le milieu M1 tous les deux jours aux cultures et analysez les cSEm pour l’expression de la chaîne lourde pax7, MyoD, myogénine et myosine à deux jours, quatre à cinq jours, six à sept jours et dix à quatorze jours respectivement. Les cSEm affichent l’expression de CD105 et CD90 et n’expriment pas les marqueurs hématopoïétiques CD34 et CD45.

Les uMSC étaient également positifs pour l’expression du marqueur CD73 des uMSC, ce qui indique que les uMSC exprimaient plusieurs marqueurs clés. Les uMSC ont montré une expression de pax7 dans les deux premiers jours suivant l’ajout de M1, suivie de l’expression de MyoD dans les quatre premiers jours de l’ajout de M1. Les cellules expriment la protéine de myogénine à six jours de différenciation, suivie de l’expression de la chaîne lourde de myosine entre 10 jours et 14 jours après l’induction de la différenciation.

970 gènes ont été régulés à la hausse en réponse à l’induction de la différenciation myogénique par rapport aux cSEm indifférenciés. Plus de gènes myogéniques ont été régulés à la hausse dans les cSEm dérivés du tissu de cordon par rapport aux cSEm dérivés du sang de cordon. Le tissu de cordon et le sang de cordon ont montré une régulation à la hausse des gènes liés aux protéines du cytosquelette, associés à la liaison à l’actine et à l’assemblage du sarcomère, aux transporteurs associés à la fonction contractile, au maintien de la masse musculaire, à la signalisation du calcium et à la fonction enzymatique.

Prélever le tissu dans un état aseptique et maintenir une culture stérile. Le cordon doit être balayé à l’extérieur avec de l’éthanol à 70% et traité le plus rapidement possible. De nombreuses thérapies régénératives nécessitent un grand nombre de cellules provenant des premiers passages.

Il peut également être utilisé comme modèle pour imiter l’ensemble de l’environnement sec et refléter le métabolisme postnatal.