Spectroscopie de force d’ensemble par forces de cisaillement

Ce protocole fournit une technique à haut débit pour étudier la liaison intermoléculaire entre l’ADN et les ligands. Cette technique a démontré un débit élevé dans l’étude d’un ensemble massif de structures biomoléculaires. Il le fait en convertissant les propriétés chimiques mécaniques des molécules individuelles en celles des ensembles moléculaires.

Je pense que c’est une expérience très avancée, mais il y a peu d’étapes critiques. Par exemple, l’alignement du microscope, de l’homogénéisateur et du tube de réaction. Ces trois éléments doivent être parfaitement alignés afin de suivre avec précision le changement de fluorescence.

Commencez par assembler l’homogénéisateur et le microscope sur une table de montage. Après avoir porté des lunettes, allumez le microscope à fluorescence, puis ajustez l’homogénéisateur pour vous assurer que le faisceau lumineux d’excitation passe par le centre de l’extrémité dispersante de l’homogénéisateur. Ensuite, préparez une chambre de réaction à fond plat de cinq centimètres de hauteur et de 1,5 centimètre carré sur 1,5 centimètre carré de section, en veillant à ce que le matériau de chambre choisi ne devienne pas fluorescent pour réduire le bruit de fond.

Ensuite, serrez la chambre de réaction sur l’étage d’échantillonnage du microscope à fluorescence, puis ajustez la chambre pour maintenir l’extrémité dispersante de l’homogénéisateur, en veillant à ce que la pointe soit légèrement au-dessus de la surface inférieure de la chambre de réaction. Ensuite, ajustez la position verticale de l’homogénéisateur et de la chambre ensemble pour vous assurer que le microscope est focalisé sur la surface de la pointe de dispersion. Ajustez ensuite la position horizontale de l’extrémité dispersante pour vous assurer que la zone de détection est définie entre le rotor et le statère.

Allumez les canaux fluorescents, selon le colorant fluorescent utilisé dans l’expérience. Avant l’expérience de cisaillement à grande vitesse, on utilisait de l’eau désionisée pour tester le cisaillement à faible vitesse de cisaillement. Tout d’abord, préparez un ADN télomérique humain à motif i marqué avec un colorant et un quencher à ses deux extrémités respectivement dans de l’eau désionisée comme décrit dans le manuscrit.

Ensuite, diluez l’ADN à cinq micromolaires dans un tampon MES de 30 millimolaires à pH 5,5 ou pH 7,4. À la solution d’ADN, ajouter le ligand L2H24OTD"dans une plage de concentration de zéro à 60 micromolaires et mélanger doucement la solution pendant 10 minutes pour replier les structures i-motif sans lumière. Vérifiez et minimisez l’intensité de fluorescence de fond de la chambre de réaction remplie d’eau désionisée à l’aide du microscope fluorescent sans cisaillement.

Réglez ensuite les paramètres de la caméra CCD à l’aide du logiciel avec un temps d’exposition de 0,5 seconde, une sensibilité CCD de 1 600 et une durée d’enregistrement égale à 20 minutes. À l’aide d’une longue pipette, ajoutez la solution d’ADN dans la chambre de réaction vide et propre et couvrez la chambre de réaction d’une boîte noire. Démarrez ensuite l’homogénéisateur pour effectuer un cisaillement à une fréquence de cisaillement sélectionnée allant de 9 724 par seconde à 97, 245 par seconde pendant 20 minutes, avec la caméra CCD allumée pour enregistrer les données.

Après l’expérience, retirez la chambre et lavez-la à l’eau désionisée. Préparez l’ADN i-motif et l’eau désionisée. Ensuite, incuber 10 micromolaires d’ADN i-motif et 300 microlitres de tampon tris millimolaire 30 millimolaires complétés par 150 micromolaires de chlorure cuivrique et 300 micromolaires d’acide ascorbique pendant 10 minutes pour plier les structures i-motif.

Ensuite, ultra filtrez la solution avec un dispositif d’ultrafiltration à une force centrifuge de 14 300 fois G.Reconstituer la solution à environ 500 microlitres avec 30 tampons tris millimolaires complétés par 300 micromolaires d’acide ascorbique après chaque filtration. Après avoir recueilli la solution résiduelle, faire un volume final de 300 microlitres en ajoutant 30 tris millimolaires complétés par 300 micromolaires d’acide ascorbique avec 20 micromolaires CalFluor 488 azotures, 20 micromolaires HPG et 10 micromolaires TBTA. Une fois les réactifs ajoutés, déplacez la solution dans la chambre noire.

Ensuite, vérifiez et minimisez l’intensité de fluorescence de fond de la chambre de réaction remplie d’eau désionisée à l’aide du microscope avant les expériences de cisaillement. Ensuite, ajoutez la solution d’ADN dans la chambre de réaction vide avec une longue pipette, puis démarrez le cisaillement de l’homogénéisateur à une fréquence de cisaillement de 63, 209 par seconde pendant 20 minutes avec la caméra CCD allumée. Après l’expérience, retirez la chambre et lavez-la à l’eau désionisée.

L’intensité de fluorescence de l’ADN i-motif a été observée pour augmenter avec le taux allant de 9, 724 par seconde à 97, 245 par seconde dans un tampon de pH 5,5 MES. Cependant, l’intensité de fluorescence n’a pas augmenté lorsque le même ADN i-motif a été cisaillé à un taux de 63, 209 par seconde, car il ne se replie pas à pH 7,4 dans le tampon MES. La liaison du ligand aux molécules d’ADN i-motif soumises au flux pur a été évaluée, ce qui a montré que l’augmentation de l’intensité de fluorescence devenait moins évidente avec l’augmentation de la concentration du ligand.

La constante de dissociation a été déterminée pour l’interaction entre le ligand et le motif i et s’est avérée être de 34 micromoles. Le motif i chélaté en cuivre a été déplié à la vitesse de cisaillement de 63, 209 par seconde, et celui en cuivre libéré a déclenché la réaction de clic fluorgénique, ce qui a entraîné une augmentation de l’intensité de fluorescence au fil du temps. Tout d’abord, assurez-vous que la zone de détection est définie entre le rotor et le stater.

Deuxièmement, vérifiez et minimisez le fond de fluorescence. Et enfin, assurez-vous de filtrer la réaction avant d’effectuer une réaction de clic. Cette méthode ouvre une porte pour explorer la résistance mécanique, le pliage et le dépliage de toutes sortes de polymères.

Il pourrait s’agir d’autres structures d’ADN, de protéines ou d’autres polymères, et de leur interaction avec d’autres types de molécules. Comme nous l’avons dit, plusieurs autres macromolécules pourraient être étudiées en utilisant cette approche.