Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Bonjour, je m'appelle Matt Lui. Je suis chercheur postdoctoral dans le laboratoire de Leslie Sal à l'Université Rockefeller. Aujourd'hui, je vais vous parler des expériences que nous avons menées pour étudier la chimiotaxie larvaire.

Le problème qui nous intéresse est assez simple. Il est en réalité illustré ici dans ce montage. Je viens de transférer un groupe de larves de Joseph sur cette surface d'agarose.

Cet environnement est assez hostile et les animaux sont proches de la famine. D'une manière ou d'une autre, ces animaux devront trouver leur chemin vers la source de nourriture la plus proche, et ici, certaines bananes dégagent une odeur qui attire les larves. Cet environnement n'est pas idéal pour étudier le comportement de chimiotaxie, la première amélioration consistera donc à remplacer la banane par une substance chimique.

Ce composé chimique est l'acétate d'isoamyle et constitue l'un des arômes prédominants dans la banane. Il s'agit donc de notre arôme artificiel, qui nous permet un meilleur contrôle du stimulus olfactif. L'amélioration suivante consiste à utiliser un environnement clos afin de tenter de prévenir ainsi les fluctuations dans la distribution des autres composés.

Voici donc le test que nous utilisons en laboratoire depuis assez longtemps. Il s'agit d'une boîte de Pétri contenant à sa base une surface d'agarro. L'agarro est idéal pour les chémo-attaques des larves, car il les maintient hydratées.

Sur les deux côtés de la plaque, vous trouvez un autre capuchon en téflon, et ce que nous allons faire maintenant, c'est introduire de l'acétate d'isamyl d'un côté et rien de l'autre côté. Une fois cette étape terminée, l'idée est de fermer la boîte de Pétri, d'attendre un peu de temps pour que l'odeur diffuse, puis par la suite d'ouvrir la boîte. Introduire un animal ici, et nous laissons l'animal se déplacer pendant une certaine période de temps.

Cet essai repose sur l'hypothèse qu'en introduisant le théodor d'un côté de la boîte, on établit rapidement un gradient qui restera stable pendant la durée du test. Or, le principal problème est qu'aucun chercheur n'a jamais démontré l'existence de ce gradient dans la boîte. Il se pourrait très bien que, très rapidement après l'ajout du théodor, celui-ci se répartisse de manière homogène dans la boîte, rendant le gradient très faible, ou il se pourrait que plusieurs minutes soient nécessaires pour qu'un gradient se mette en place.

Cela dépendra bien sûr principalement de la pression de vapeur du composé utilisé. La deuxième question concerne ce qui est quantifié au cours de l'expérience. Imaginez qu'un animal parte d'ici, du X, et se retrouve après trois minutes à cette lame terminale, le X rouge. Il existe maintenant deux approches possibles.

Une chose que vous pouvez faire consiste à enregistrer uniquement la position finale de l'animal après une certaine période, trois ou cinq minutes. Dans ce cas, la seule information que vous obtiendriez serait la position de départ et, et nous pensons qu'il est important d'avoir une bonne résolution concernant le comportement de l'animal au fil du temps. Par exemple, un animal pourrait à peine s'être déplacé de la position initiale à la position finale, comme ici, ou il pourrait avoir exploré très activement la région entourant theodor pendant une partie importante de l'essai avant d'y revenir peu avant la fin du test.

La conclusion que nous tirerions de ces deux situations est très différente. Dans un cas, l'animal n'a peut-être pas réagi au stimulus, tandis que dans l'autre cas, il y a certainement réagi. Les deux améliorations que nous cherchons à obtenir sont d'abord de contrôler la forme et la stabilité de l'autre gradient dans l'arène.

Deuxièmement, suivez le comportement de l'animal en temps réel et conservez toutes ces informations. Dans la séquence suivante, Sylvia va vous présenter comment nous préparons une dilution en série. Je m'appelle S ti.

Je suis assistant de recherche dans le laboratoire de VAs et je travaille sur le matériel lui. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer les matériaux pour le système de chambre que nous utilisons afin de suivre les animaux. Le principal problème avec notre système de chambre est que nous utilisons une odeur dispersée dans l'air.

Cela signifie que, par exemple, si les plaques d'agros que nous utilisons ne sont pas planes, vous pourriez observer des fluctuations et des variations de concentration entre les expériences, ce qui introduirait du bruit dans le système. Je vais donc vous montrer quelques astuces afin de réduire au minimum le bruit dans le système. Les matériaux nécessaires à la préparation de votre dilution d'odeur sont un bocal en verre, de préférence en verre foncé si vous utilisez des odeurs sensibles à la lumière, ainsi qu'une aliquote de l'odeur qui vous intéresse.

Des pipettes en verre pour préparer cet aliquot et une pipette mécanique adéquate. Ensuite, des embouts de pipette pour huile de paraffine, votre pipeteur standard et de petits flacons pour la dilution. Encore une fois, ceux-ci doivent être en verre et de préférence opacifiés, puis une balance pour effectuer des mesures précises et réduire les variations entre les expériences.

Étant donné que les odeurs sont très volatiles et que certaines sont toxiques, les manipulations s'effectuent sous hotte. La première étape pour préparer une dilution d'odeur consiste à prélever une aliquote de l'odeur que vous allez diluer. Pour préparer des dilutions précises et minimiser les variations entre les expériences, il est nécessaire de tout peser.

Commencez donc par l'étiquetage, vous allez préparer une concentration molaire d'ester butyrique d'éthyle. Tout d'abord, préparez l'huile de paraffine. L'huile de paraffine est très visqueuse, il est donc important d'immerger la pointe de la pipette le moins possible dans l'huile de paraffine, juste assez pour pouvoir aspirer l'huile sans générer de bulles.

Ensuite, il est conseillé d'essuyer l'excès d'huile à paraffine sur le côté de la bouteille. Encore une fois, comme l'huile à paraffine est visqueuse, il est très important de la laisser s'écouler lentement dans le flacon. Une fois que vous avez pipeté l'huile para dans votre bouteille, ne jetez pas immédiatement la pointe, car davantage de liquide s'accumulera au fond de celle-ci.

Il est conseillé de préparer une feuille de calculs avant de commencer les dilutions, dans laquelle vous aurez déjà mesuré le volume d'huile de paraffine que vous allez ajouter ainsi que le poids, puis fait de même pour votre odeur, en notant également le poids. Ainsi, vous pouvez vérifier sur la balance que vous disposez de toute l'huile de paraffine nécessaire et de toute l'odeur requise. Si nécessaire, versez davantage d'huile de paraffine et reprenez la mesure jusqu'à obtenir le poids correct.

Une fois que vous avez le poids correct d'huile de paren, tout ce que vous avez à faire est d'ajouter un arôme en utilisant les mêmes principes. Très bien. Ici, je vais montrer comment préparer les larves pour le suivi.

Nous utilisons généralement des larves âgées de six jours. Nous procédons ainsi car elles sont suffisamment grandes pour être facilement détectées par notre logiciel, et elles sont également encore très actives. Pour déterminer si vos larves sont trop âgées pour être utilisées dans le suivi, il suffit de vérifier si certaines larves grimpent sur les parois. S'il y a des larves qui grimpent sur la paroi, elles sont trop âgées et ne seront pas particulièrement actives.

La première étape de la préparation de vos larves consiste à les immerger dans du saccharose à 15 %. La raison pour laquelle nous utilisons du saccharose à 15 % est que les larves flotteront dans cette solution, tandis que la nourriture se dissoudra partiellement ou tombera au fond. Versez suffisamment de saccharose pour qu’il atteigne environ, je dirais un peu moins d’un pouce du bord supérieur de votre flacon ou de votre tube.

Ensuite, prenez une spatule. Vous pouvez déjà voir les larves remonter à la surface ; creusez délicatement dans le milieu pour déloger les individus qui s'y enfouissent, puis tournez légèrement pour les séparer du milieu. Laissez reposer pendant quelques minutes. Une fois que le milieu et les larves sont suffisamment séparés, prenez une boîte de Pétri préalablement étiquetée et versez-les dans la partie réceptrice.

Gardez le couvercle de la boîte de Pétri, car vous allez le remplir d'eau et l'utiliser comme récipient pour les larves suivies, afin de distinguer celles que vous avez déjà analysées de celles qui ne l'ont pas encore été. Maintenant que vous avez versé les larves dans la boîte de Pétri, vous devez attendre 30 minutes pour qu'elles s'adaptent au saccharose et atteignent un état de privation alimentaire. Cela signifie qu'elles se comporteront mieux pendant la phase de suivi, durant laquelle les larves s'adaptent pendant 30 minutes.

Le saccharose est un bon moment pour préparer les plaques destinées au suivi. Ce sont des couvercles de plaques de 96 puits. Vous pouvez les acheter séparément, et ceci est une solution d'agarose à 3 % qui a déjà été chauffée.

Nous utilisons de l'agarose à 3 % car elle empêche les larves de creuser, tout en étant suffisamment dense pour leur permettre de marcher dessus et de rester humidifiées sur le dessus de chaque boîte. Vous devez pipeter 25 mils d'agarose. Il est important d'essayer d'éviter la formation de grosses bulles dans le gel.

Il est également important de placer les boîtes sur une surface plane, sinon vous pourriez obtenir des gels en pente qui pourraient affecter le comportement des larves. Une fois que le gel a pris, nous empilons les boîtes et les enveloppons dans du film étirable afin d'éviter qu'elles ne s'assèchent. Cela permet de les conserver en bon état pour le suivi pendant plusieurs jours.

Dans cette séquence, je vais vous présenter notre test comportemental, qui diffère légèrement du test de la boîte de Pétri dont je vous ai parlé précédemment. Vous aurez besoin de plateaux de 96 puits, ainsi que de ceux contenant la couche d'agar. Le test est composé de trois couvercles, qui sont empilés les uns sur les autres.

La première couche ne contient rien, est vide et sert uniquement à isoler le système de la surface sur laquelle il repose. La deuxième couche contient la surface Diego agro. Ici, les animaux seront placés sur la surface et, comme je vais vous le montrer ensuite, nous introduisons le théodor dans la plaque.

Il est important d'utiliser un couvercle frais et neuf à chaque fois que vous chargez le theodor. Cela permet d'éviter toute contamination d'une expérience à une autre. Vous aurez également besoin d'autres dilutions.

Nous n'utilisons normalement pas de colorant pour charger leodor, mais ici je m'en servirai à des fins illustratives. Ceci est une concentration élevée de leodor. Alors que celle-ci est très diluée, mon objectif sera de créer un gradient le long d'une ligne.

Dites cette phrase et nous voulons avoir une concentration croissante de la gauche vers la droite. Pour y parvenir, j'utiliserai plusieurs gouttelettes ordonnées placées dans l'anneau de condensation avec une concentration croissante. Je commence par la concentration la plus élevée, qui sera placée à l'extrémité.

Il est important de le disperser dans l'anneau. J'effectue maintenant la concentration suivante, qui est diluée deux fois par rapport à la première, et je la place sur cet anneau. Donc, non, j'ai six gouttelettes.

La première contient une concentration d'environ un. La deuxième, une concentration de 0,5, deux fois moins que la première. La troisième a une concentration de 0,25, et ainsi de suite.

Nous avons donc une série géométrique le long de la ligne. L'étape suivante consiste à retourner ce couvercle sur la surface AAL, et grâce à la tension superficielle, toutes les gouttelettes restent suspendues au-dessus du couvercle. Nous mettons au point une technique fondée sur la spectroscopie infrarouge afin de mesurer la concentration totale dans la plaque.

En appliquant cette technique, nous avons pu montrer que si vous avez une série géométrique le long de la ligne de déodorant ici, vous obtenez une concentration de théodor le long de la longueur qui augmente de façon exponentielle, comme indiqué ici, et selon la largeur de la plaque. Nous avons un profil qui présente un maximum juste sous la ligne d'agent odorant. Voici à quoi ressemble la géométrie réelle du gradient.

Si l'on considère la concentration de théodol dans l'air, le point positif est que nous avons pu démontrer que le gradient de sa géométrie reste stable pendant au moins 15 minutes. Après la mise en place du couvercle supérieur, nous attendons 30 secondes pour permettre l'établissement du gradient. Ensuite, nous introduisons l'animal dans l'arène.

L'animal est introduit sous l'autre extrémité, entre les positions trois et quatre. Nous utilisons une petite épingle pour transférer les larves de la solution de saccharose vers la surface d'agar. Ce transfert s'effectue en prenant délicatement une larve autour de la tête de l'épingle. Nous ouvrons rapidement le couvercle et déposons la larve sur la surface de l'agar.

Ensuite, nous fermons le couvercle. Il est important de minimiser le temps pendant lequel le couvercle reste ouvert. Ensuite, vous enregistrez le mouvement de l'animal pendant trois ou cinq minutes.

L’enregistrement réel est effectué. Avec ce dispositif de suivi, nous disposons d'une caméra connectée à un ordinateur. Le logiciel de suivi d'images utilisé est Aton vision de Nordis, qui permet de collecter les informations sur le mouvement de l'animal et de les stocker sous forme de fichier numérique.

Nous sommes maintenant sur le point de commencer l'expérience comportementale. Nous avons le couvercle avec la couche de aro. Nous avons les dilutions.

Diego est bloqué sur le premier bouchon. Avant de charger theodor, il est important de vortexer chaque flacon. Nous utilisons notre dilution avec la plus petite à gauche et la plus élevée à droite.

Toutes les six gouttes seront déposées sur la plaque en même temps. Pour éviter la perte d'odeur, nous utilisons ici une pipette multipipette à six canaux ; 10 microlitres d’odeur sont prélevés de chaque échantillon de dilution, et l’odeur est chargée simultanément. Une fois le chargement effectué, le couvercle est inversé à la surface de l’agaros.

Le gradient a été créé dans la plaque au cours des 30 dernières secondes, comme je vous l'ai montré précédemment. Maintenant, je vais introduire un animal à la surface de Diego. Dès que l'animal est introduit, je commence l'enregistrement.

L'animal est ici et son mouvement est actuellement suivi. Comme vous pouvez le voir, l'animal suit la traînée d'odeur et se dirige vers le point de concentration maximale du gradient. Rappelez-vous que la concentration augmente de gauche à droite selon une forme exponentielle.

Comme vous pouvez le constater, la direction du mouvement est constamment corrigée. Par rapport au stimulus, l'animal a maintenant atteint le point de concentration maximale du gradient, et nous l'extrayons de la boîte. L'animal est mis de côté sur une autre boîte afin de s'assurer que nous ne suivons pas deux fois directement le même individu.

Après avoir introduit une nouvelle larve et démarré un nouvel enregistrement, voici les règles que nous suivons pour le suivi. Nous interrompons le suivi dès que l'animal atteint la rangée de plus haute concentration sur la plaque, ce qui correspond à celle-ci, celle-ci ici. De plus, si un animal heurte le bord, le suivi est interrompu afin d'éviter toute interférence.

La première question que nous avons abordée était assez simple. Ce que nous voulions savoir, c’était si un animal pouvait sentir l’odeur du théodor à une certaine concentration. Pour effectuer un tel test, ce que nous faisons habituellement consiste à utiliser une source unique d’odeur plutôt que plusieurs sources.

Cela vous permet d'avoir un degré de liberté pour modifier la concentration dans la goutte finale de Theodor. Ici, par exemple, vous avez une goutte de forte concentration, et ici une goutte de faible concentration. Ce que nous faisons habituellement consiste à introduire l'animal sur la surface de Diego juste sous la goutte de Theodor et à observer si l'animal est capable de détecter sa présence et de rester à proximité.

Maintenant, je souhaite faire un usage plus avancé de notre test. Imaginez que vous ayez une goutte d'ordre et que vous enregistriez plusieurs trajectoires qui sont superposées ici, et que vous en ayez trois. Vous avez un individu qui génère cette trajectoire verte.

Vous avez cette piste orange qui est moins centrée, puis vous avez cette trajectoire rose qui représente un animal tournant apparemment autour de la source. Nous pensons qu'il existe de nombreuses informations à exploiter concernant les détails des trajectoires. Pour cette raison, nous importons la trajectoire sous forme de série de positions dans Matlab, puis nous effectuons l'analyse après l'analyse avec Matlab.

Voici la distance par rapport à la source, probablement en fonction du temps. Pour les trois trajectoires qui ont été affichées précédemment, on observe la trajectoire verte, qui reste très proche de la source. On observe également la trajectoire orange, qui présente un bruit nettement plus important.

Ensuite, vous avez cette trajectoire violette, qui montre de manière intéressante que l'animal a quitté la source pour rester à une certaine distance, ce qui correspond probablement à une concentration optimale. Ici, vous voyez l'illustration de 10 trajectoires, d'animaux incapables de sentir. Ce sont des mutants ou des mutants trois B, qui sont non-ellers.

Et comme vous pouvez le constater, toutes ces trajectoires illustrent le fait que les animaux n'ont pas détecté la source de l'odeur et l'ont simplement évitée. En revanche, nous avons enregistré ici 10 trajectoires consécutives pour les animaux du type blanc. Ces animaux sont bien sûr capables de sentir, et comme vous pouvez le voir, ils s'accumulent tous juste sous la source du déodorant.

Les 20 trajectoires, qui viennent d'être présentées, ont en réalité été acquises sans connaître l'identité des animaux. Cela démontre l'efficacité et la fiabilité de notre test. Pour déterminer si certains mutants sont capables de sentir ici en utilisant un gradient exponentiel, nous générons plusieurs trajectoires et nous souhaitons évaluer dans quelle mesure les animaux parviennent à suivre le stimulus situé à l'autre extrémité.

Je vais donc vous montrer maintenant 15 trajectoires enregistrées séparément, et comme vous pouvez le constater, les animaux suivent très bien le stimulus sous la ligne d'extrémité opposée. Nous souhaitons maintenant effectuer un contrôle simple. Il se pourrait très bien que les animaux dans le gradient exponentiel aient suivi la ligne en raison de la présence d'un stimulus, indépendamment de sa concentration, les animaux allant simplement tout droit.

Ainsi, afin de démontrer qu’elles calculent effectivement la concentration ou une grandeur liée à celle-ci et qu’elles utilisent cette information pour guider leur déplacement, nous avons mis en place cette géométrie, proche de la forme d’un toit. La larve est introduite ici comme d’habitude, et ce que nous attendons, c’est qu’elle se déplace le long de la ligne, détecte ensuite une diminution de la concentration après ce point précis, puis y revienne. Nous avons donc réalisé le test avec cinq animaux.

Nous avons collecté les trajectoires, et nous les représentons maintenant superposées sur cette diapositive. Comme vous pouvez le constater, les animaux sont partis d'ici, ont suivi la ligne, puis ont exploré la région correspondant à la concentration la plus élevée et y sont principalement restés. Cela suggère fortement qu'ils sont capables de calculer d'autres concentrations en temps réel à l'aide du test à source unique.

Nous avons pu poser principalement une grande question. Un animal peut-il détecter une odeur à une certaine concentration en utilisant un dispositif à multiples sources ? Nous disposons ainsi d'une plus grande souplesse pour modifier la forme du gradient et déterminer si un animal est capable ou non d'utiliser cette information.

J'aimerais illustrer cette idée en réalisant une expérience simple. Dans les gradients que nous avons établis jusqu'à présent, nous avions une forme exponentielle le long de la lentille. Maintenant, la question est la suivante : si nous mettons davantage les al au défi en faisant augmenter la concentration linéairement le long de la lentille, sont-elles encore capables de trouver leur chemin jusqu'à l'autre extrémité ?

Ce graphique représente les deux types de gradient. Nous avons testé le gradient exponentiel en violet et le gradient linéaire en vert. Il s'agit du gradient linéaire, et je vais noter les différentes concentrations d'acétate d'isam en diluant l'huile de paren.

Il s'agit d'une série arithmétique. Nous avons un gradient linéaire qui va s'établir et, comme vous pouvez le constater, la pente est assez faible par rapport au gradient exponentiel ici, où la concentration aux extrémités est également de 0,5, mais atteint 0,03. La question est la suivante : les navi sont-ils capables de répondre à des attaques chimiotactiques lorsqu'ils sont confrontés à un gradient aussi faible ?

Ici, la concentration réelle d'acétate utilisée dans les six gouttelettes pour le gradient exponentiel et pour le gradient linéaire. Comme vous pouvez le constater, même si les concentrations les plus élevées sont identiques dans les deux cas pour le gradient linéaire, la concentration la plus faible ici est relativement élevée. Nous avons réalisé l'expérience avec le gradient linéaire, et 15 trajectoires sont représentées ici pour un animal de type sauvage, et nous pensons qu'il est assez clair que ces animaux ont été capables de détecter le gradient linéaire et de suivre ce signal le long de la ligne de déodorant.

Ainsi, je pense que notre point est clair. Avant de conclure, je souhaite brièvement évoquer les perspectives futures pour ce dispositif de suivi. Bien que ce dispositif permette de réaliser de nombreuses expériences intéressantes, par exemple observer des comportements complexes chez les larves sur une période plus longue et sur une plus grande échelle, il présente toutefois certaines limites.

Par exemple, vous êtes limité par la taille de votre plaque, ce qui limite la durée du suivi et les comportements complexes que vous pouvez observer. Il serait donc intéressant de développer un système dans lequel la plaque est plus grande ou dans lequel les limites de la plaque ne constituent pas une contrainte. Un autre problème est que, avec les logiciels dont nous disposons actuellement, il est difficile de suivre plusieurs animaux simultanément, rendant ainsi impossible l'observation en temps réel des comportements de population.

Un autre aspect intéressant du comportement que nous ne pouvons pas tester avec ce dispositif concerne les mouvements tridimensionnels réels des larves dans l'espace. Lorsque vous suivez les animaux, vous remarquerez par exemple que, lorsqu’ils atteignent une goutte d’odeur, ils peuvent lever la tête ou balayer celle-ci autour afin de détecter des variations de concentration. Cela n’est peut-être pas possible avec notre dispositif actuel, il serait donc intéressant de développer un système permettant de réaliser de telles observations.