Préparation protéomique unicellulaire pour l’analyse par spectrométrie de masse par lyse de la chaleur glaciale et support isobare
9 décembre 2022
Dans ce protocole, nous décrivons comment préparer des cellules de mammifères pour l’analyse protéomique unicellulaire par spectrométrie de masse à l’aide de réactifs et d’équipements disponibles dans le commerce, avec des options pour le pipetage manuel et automatique.
SCoPE2 peut quantifier des milliers de protéines provenant de milliers de cellules de mammifères uniques sans anticorps. Ce protocole peut aider à découvrir une hétérogénéité du protéome qui serait autrement invisible pour les analyses en vrac. La protéomique unicellulaire, utilisant l’approche SCoPE2, a été conçue pour être accessible aux chercheurs disposant d’une gamme de ressources, allant d’une simple pipette à la robotique de manipulation de liquides.
SCoPE2 est largement applicable à de nombreux domaines de recherche, y compris le cancer et l’immunologie, en fournissant un aperçu de la façon dont les protéines sont différentielles en abondance entre les cellules individuelles de la même population. Pour commencer, commencez la procédure de lyse cellulaire en plaçant une plaque de 384 puits avec des cellules individuelles triées dans le cycleur thermique, en la chauffant pendant 10 minutes à 90 degrés Celsius, suivie d’un refroidissement à 12 degrés Celsius. Faites tourner brièvement la plaque dans un spinner de plaque de paillasse à 18 à 22 degrés Celsius.
Soniquer la plaque pendant cinq minutes dans un sonicateur au bain-marie à 18 à 22 degrés Celsius. Ensuite, placez-le sur de la glace. Pour procéder à la digestion de la trypsine, préparez 100 microlitres du mélange maître et ajoutez 0,2 microlitre du mélange maître à chaque puits de la plaque de 384 puits à l’aide d’un manipulateur de liquide.
Scellez la plaque, tourbillonnez pendant cinq secondes et faites tourner vers le bas dans une plaque de paillasse à 18 à 22 degrés Celsius. Chauffer la plaque de 384 puits pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec la température du couvercle réglée à 52 degrés Celsius. Pour définir une réaction d’étiquetage de masse en tandem, retirez les 85 millimolaires d’étiquettes de masse en tandem du congélateur à moins 80 degrés Celsius.
Avant de les ouvrir, réchauffez les tubes à température ambiante et diluez les étiquettes à 22 millimoles dans de l’acétonitrile anhydre. À l’aide de cette stratégie d’étiquetage, ajoutez 0,5 microlitre d’étiquettes de masse en tandem diluées à chaque puits de la plaque de 384 puits, à l’aide d’un robot distributeur de liquide ou d’une pipette manuelle. Scellez la plaque, tourbillonnez pendant cinq secondes et faites tourner vers le bas dans une plaque de paillasse à 18 à 22 degrés Celsius.
Laissez la réaction d’étiquetage se dérouler à 18 à 22 degrés Celsius pendant une heure. Pour la trempe de la réaction d’étiquetage de masse en tandem, ajouter 0,2 microlitre d’hydroxylamine à 0,5%, dilué dans de l’eau de qualité CLHP, à chaque puits de la plaque de 384 puits à l’aide d’un manipulateur de liquide. Scellez la plaque, tourbillonnez pendant cinq secondes et faites tourner vers le bas dans une plaque de paillasse avant de maintenir la plaque à 18 à 22 degrés Celsius pendant 30 minutes.
La préparation de l’analyse LC-MS commence par retirer le support combiné ou le matériau de référence du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Pour chaque ensemble, pipeter un microlitre de support et de matériau de référence dans le premier puits, fera partie d’un seul ensemble. Pipeter le volume complet du premier puits au puits suivant.
Continuer à pipeter le volume complet d’un puits à l’autre jusqu’à ce que tous les puits inclus dans un seul ensemble aient été combinés dans le puits final. Pour chaque ensemble, ajouter cinq microlitres d’acétonitrile à 50% dilué dans de l’eau de qualité CLHP pour le premier puits à cellule unique à inclure dans chaque ensemble. Pipeter le volume complet du premier puits au puits suivant.
Continuez à pipeter le volume complet d’une cellule à l’autre, jusqu’à ce que tous les puits inclus dans un seul ensemble aient été combinés dans le puits final. Maintenant, transférez chaque ensemble dans leurs inserts en verre d’échantillonneur automatique. Sécher les échantillons une fois que tous les ensembles sont combinés et placés dans des inserts en verre.
Avant l’analyse LC-MS-MS, ajoutez 1,2 microlitre d’acide formique à 0,1% à chaque ensemble pour remettre en suspension les peptides marqués. Placez les inserts de l’échantillonneur automatique dans les flacons d’échantillonneur automatique en verre et fermez chaque échantillon avec un bouchon. Vortex chaque flacon pendant cinq secondes pour s’assurer que la remise en suspension est complète, puis tourner vers le bas dans un filateur de flacon à 18 à 22 degrés Celsius.
Assurez-vous que chaque échantillon se trouve au bas de l’insert plutôt que d’être éclaboussé sur les côtés. Placez les flacons dans le plateau de l’échantillonneur automatique et pour chaque ensemble, injectez un échantillon d’un microlitre pour l’analyse LC-MS-MS. L’efficacité de la digestion et du marquage des cellules individuelles peut ne pas être directement dosée comme avec le support, mais le logiciel DO-MS fournit des graphiques qui estiment l’efficacité de la digestion et du marquage.
Une mauvaise digestion est indiquée par un rapport élevé de l’intensité des peptides mal clivés à leurs homologues complètement clivés. Un autre facteur à prendre en compte dans les ensembles est la fraction de données manquantes dans l’intensité médiane des ions reporters dans chaque canal de marquage de masse en tandem. Lorsque des cellules individuelles sont préparées avec succès, les données manquantes par cellule et le contrôle positif sont beaucoup plus faibles que les échantillons de contrôle négatifs.
Une manipulation prudente du liquide pendant la préparation des échantillons LC-MS-MS est essentielle pour une récupération maximale des peptides. De petits échantillons d’environ 100 picogrammes à 100 nanogrammes par puits peuvent être préparés pour l’analyse protéomique à l’aide d’un support isobare. SCoPE2 rend les mesures protéomiques unicellulaires accessibles aux chercheurs du monde entier en utilisant uniquement des réactifs courants et des équipements disponibles dans le commerce.
Il se prête à un traitement manuel ou à une automatisation à haut débit par manipulation robotisée de liquides.
Aperçu
Ce protocole décrit la préparation de cellules de mammifères pour l'analyse protéomique unicellulaire par spectrométrie de masse. En utilisant l'approche SCoPE2, il permet aux chercheurs de quantifier des milliers de protéines provenant de cellules individuelles, révélant ainsi l'hétérogénéité du protéome qui est généralement masquée dans les analyses en masse.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Protéomique à l'échelle de la cellule unique
- Recherche sur le cancer
- Immunologie
Contexte
- Hétérogénéité du protéome et sa signification
- Accessibilité des techniques de spectrométrie de masse
- Importance de l'analyse de cellules uniques pour obtenir des informations biologiques
Méthodes utilisées
- Procédure de lyse cellulaire utilisant un thermocycleur et une sonication
- Utilisation d'une plaque de 384 puits pour la préparation des échantillons
- Marquage isotopique en tandem pour la quantification de protéines sans anticorps
Résultats principaux
- Quantification réussie de milliers de protéines à partir de milliers de cellules individuelles
- Mise en évidence de l'abondance différentielle des protéines entre cellules individuelles au sein de la même population
- Estimation de l'efficacité de la digestion et du marquage à l'aide du logiciel DO-MS
Conclusions
- Le protocole SCoPE2 simplifie la protéomique à l'échelle de la cellule unique, rendant cette approche accessible dans le monde entier
- Cette méthode améliore notre compréhension de la diversité cellulaire et de l'expression protéique
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La protéomique unicellulaire utilisant le protocole SCoPE2 permet une quantification à haute résolution de l'hétérogénéité protéique au sein de milliers de cellules individuelles de mammifères, comblant ainsi un manque critique dans la phase initiale de découverte et la validation des cibles. En exploitant des stratégies de lyse par congélation-chaleur et des porteurs isobariques, ce protocole permet un profilage protéomique robuste, évolutif et accessible pour des équipes de recherche et développement variées. Cette approche renforce la confiance prédictive aux points critiques de basculement du processus de découverte, facilitant ainsi des décisions de portefeuille ajustées au risque.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de l'hétérogénéité du protéome au niveau de la cellule unique pour une détection mécanistique des risques.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en quantifiant l'abondance différentielle des protéines au sein des populations cellulaires.
- Facilite une confiance prédictive dans l'analyse des voies biologiques et le tri biologique.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des échantillons unicellulaires validés pour des protocoles en aval de type LC-MS/MS en utilisant des protocoles standardisés.
- Fournit des mesures quantitatives et reproductibles des protéines, adaptées au criblage à haut débit.
- Permet l'extensibilité des tests et la réutilisation de la plateforme grâce à la compatibilité avec l'automatisation et à l'utilisation de réactifs accessibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les systèmes pertinents pour les maladies en permettant le profilage protéomique dans la recherche sur le cancer et l'immunologie.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en permettant une analyse robuste des biomarqueurs et des voies biologiques.
- Réduit le risque de translation en révélant la diversité cellulaire non capturée par les analyses en masse.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le protocole SCoPE2 intègre l'ensemble du processus, de la découverte précoce à l'identification de composés candidats, en soutenant les flux de travail manuels et automatisés pour la protéomique à l'échelle de la cellule unique.
- Découverte en biologie : Fait progresser la vérification des hypothèses et la clarification des voies en quantifiant l'expression protéique à la résolution de la cellule unique.
- Criblage : Produit des résultats reproductibles et quantitatifs pour une évaluation fiable des composés et le développement de tests.
- Analyse : Fournit des résultats statistiques, notamment l'efficacité de la digestion et du marquage, afin de comparer les conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Facilite l'alignement des biomarqueurs et la validation des modèles de maladies dans les études précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Propose un protocole évolutif et accessible, adaptable entre différentes équipes de recherche et systèmes modèles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des échantillons et permet la reproductibilité sur des plateformes manuelles comme automatisées.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » et l'efficacité du capital en fournissant des données robustes au niveau cellulaire unique.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement ajustés au risque des programmes de découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation de cellules uniques, en spectrométrie de masse et en protéomique quantitative.
- Exige un accès à un équipement de LC-MS/MS et à une infrastructure de gestion des liquides.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes pour la préparation des échantillons et l'analyse des données.
- Adaptable à des protocoles manuels et automatisés, soutenant divers environnements de recherche.
- La perte d'échantillons et l'exhaustivité des données doivent être surveillées à l'aide de métriques de contrôle qualité et d'outils logiciels.
