Name: Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Découvrez la production de virus NDV recombinant à haut titre à partir de liquide allantoïdien. Cette méthode utilise la filtration tangentielle pour obtenir plus de 6 × 10⁹ unités formant plage/mL, adaptée aux études in vivo.

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J.G.E.Y a reçu une bourse de doctorat du Collège vétérinaire de l’Ontario et une bourse d’études supérieures de l’Ontario. Ces travaux ont été financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada à SKW (subvention no 304737) et LS (subvention no 401127).

<ol><li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
<li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+paramyxoviruses%3A+mechanism+of+action%2C+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molekuliarnaia+Biologiia%22%5BJournal%5D)">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li>
<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
<li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li>
<li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219(2021).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+the+spike+protein+of+SARS-CoV-2+as+a+live+virus+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate.</a> EBioMedicine. 62, (2020).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
<li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic%3A+clinical-grade+production%2C+purification%2C+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).</li>
<li>Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).</li>
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<li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).</li>
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<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li>
<li>Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+respiratory+syncytial+virus+by+ultracentrifugation+in+iodixanol+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient.</a> Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li>
<li>Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les virus utilisés comme agents thérapeutiques dans les études précliniques doivent être hautement purifiés pour éviter toute toxicité lorsqu’ils sont administrés in vivo15. Si les agents adventices ou les contaminants ne sont pas éliminés, cela peut entraîner des effets indésirables graves annulant l’effet thérapeutique de l’agent viral28. Comme le NDV est produit dans les œufs de poule embryonnés, il existe plusieurs protéines d’œuf contaminantes, telles que l’ov...

Le virus de la maladie de Newcastle, également connu sous le nom d’orthoavulavirus aviaire-1, est un paramyxovirus aviaire enveloppé susceptible d’être utilisé à la fois comme virus oncolytique ou comme vaccin à vecteur viral 1,2,3,4,5,6,7. Plus récemment, le NDV conçu pour exprimer la protéine de pointe du SARS-CoV-2 a été caractérisé comme un vaccin intranasal efficace dans les modèlesde provocation de souris et de hamster 7,8,9. Lorsqu’il est utilisé comme immunothérapie du cancer, il entraîne le recrutement de cellules immunitaires innées, en particulier les cellules tueuses naturelles, la production d’interféron de type I et la génération de cellules T antitumorales spécifiques 10,11,12,13. En plus de ces puissantes propriétés immunostimulantes, le NDV a un profil d’innocuité solide et un système de génétique inverse bien établi14,15. Ces caractéristiques souhaitables ont incité à l’évaluation du VND dans de nombreux essais cliniques précliniques et humains (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Pour faire progresser ce vecteur viral immunostimulant très prometteur, des méthodes détaillées sont nécessaires pour produire et purifier le VND ultra-pur à titre élevé qui peut être administré en toute sécurité in vivo.
Comme le NDV est un paramyxovirus aviaire, il est le plus souvent amplifié dans les œufs de poule embryonnés. Bien qu’il existe des systèmes cellulaires disponibles pour la propagation du VND, la plupart n’ont pas été en mesure de produire des titres similaires à ceux obtenus dans les œufs de poule embryonnés18. Néanmoins, la production de NDV dans les œufs présente certains inconvénients, notamment le fait que la production à base d’œufs est longue et difficilement évolutive, que l’approvisionnement en grandes quantités d’œufs de poule SPF peut être problématique et qu’il existe un risque de contamination par des allergènes d’œufs 13,18,19,20 . Récemment, un groupe a montré que les cellules Vero cultivées en suspension dans un milieu sans sérum peuvent soutenir la réplication du NDV sur des titres comparables à ceux obtenus dans les œufs, avant la purification21. Cependant, cela nécessitait un passage en série du virus pour adapter le virus aux cellules Vero, et l’optimisation d’une méthode pour purifier le NDV des cellules Vero en suspension est toujours nécessaire21.
Comme nous l’avons souligné précédemment, les méthodes utilisées pour purifier le virus in vivo à titre élevé varient en fonction du virus en question22. Il existe un système de génétique inverse bien établi disponible pour la génération de NDV recombinant. Ce processus, impliquant l’utilisation d’un clone d’ADNc, de plasmides auxiliaires et d’un virus auxiliaire exprimant l’ARN polymérase T7, a déjà été décrit en détail15,23. Ce protocole peut être appliqué au VND lentogène ou mésogénique. Le virus décrit dans ce protocole est un NDV mésogénique recombinant codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) de la méduse Aequorea victoria insérée entre les gènes viraux P et M en tant qu’unité de transcription individuelle, car celle-ci a déjà été décrite comme le site optimal pour l’insertion de transgène étranger24.
Les méthodes ci-jointes décrivent la purification du NDV en fonction de sa taille, allant de 100 à 500 nm, et de sa densitéde 15. Cela a permis la génération de stocks de NDV de qualité in vivo et à titre élevé en environ 3 semaines, à partir du moment où les œufs sont reçus jusqu’à la fin du titre. Les techniques fréquemment utilisées dans la production à grande échelle de virus à base d’œufs telles que la filtration à flux tangentiel, la filtration en profondeur et l’ultracentrifugation par gradient de densité sont décrites, permettant la traduction de ces méthodes à une production à plus grande échelle. Les techniques décrites précédemment pour la purification du VND ont été améliorées par l’incorporation d’un tampon stabilisant le virus, l’utilisation de l’iodixanol lors de l’ultracentrifugation du gradient de densité et la description de diverses mesures de contrôle de la qualité pour assurer une qualité in vivo de qualité 15. Cela a permis de purifier le NDV in vivo atteignant des titres allant jusqu’à 3 × 1010 PFU/mL de 0,8 à 1,0 L de liquide allantoïque.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine</td><td>HyClone</td><td>SH30042,02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringue à embout coulissant</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Seringue Luer-Lok</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10 % de solution d’iode de povidone</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes coniques</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 po Aiguille de remplissage émoussée</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de glissement de précision 18G x 1 1/2 po</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 g x 5/8 po Aiguille</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde-PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lok Seringue</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 Puits Plaque de Culture Tissulaire - Fond Plat</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique, Glacial</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Chèvre-Anti-Souris</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14 Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel (5 %)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>Pince large à pointe non dentelée</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Cassette Holder</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>Gel diététique Recovery</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Digital 1502 Sportsman Egg Incubator</td><td>Berry Hill</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>Oeuf Candler</td><td>Berry Hill</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (70 %)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 8,0, 0,5 M in H2O</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Raccords en T filetés femelles, nylon, 1/8 po NPT(F)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Pince à pointe fine de haute précision</td><td>Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>Non nécessaire si l’on n’effectue pas d’IFA ou si le NDV ne code pas pour une protéine fluorescente</td></tr><tr><td>Système de lyophilisation Freezone 4.5</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX Gel Imager</td><td>Syngene</td><td></td><td>Imagerie de gels d’agarose</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcriptase inverse d’ADNc haute capacité</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>haute teneur en glucose Dulbecco’s Essential Medium</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’humidité</td><td>Berry Hill</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Solution à 60 % (p/v) d’iodixanol dans l’eau (stérile)</td></tr><tr><td>Monochlorhydrate de L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lok mâle et femelle A 1/8 po filetage de tuyau national, NPT</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Entraînement numérique</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>Pompe péristaltique avec affichage numérique</td></tr><tr><td>Tête de pompe à chargement facile Masterflex L/S pour tubes de précision</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en silicone Masterflex (platine) L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>BioPharm Silicone durci au platine</td></tr><tr><td>MC Pro 5 Thermocycleur</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE coulée et en cours d’exécution appartus</td></tr><tr><td>Mouse-Anti-NDV</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>Clone 6H12</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Omega Membrane LV Centramate Cassette, 100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A Mini Gel Système d’électrophorèse</td><td>Thermo-Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X Solution</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Poly(éthylène glycol) Moyenne Mn 20 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>Modèle 1655050 - pour électrophorèse sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Q5 Haute Fidélité 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIA Amp Mini Kit d’ARN viral</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer Cassette de dialyse (extra fort), 10 000 MWCO 0,5-3 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (granulés)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>Œufs exempts d’agents pathogènes spécifiques</td><td>ACIA</td><td>NA</td><td>Le fournisseur varie en fonction de l’emplacement</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 Filtre en profondeur</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td> <td>chirurgicauxThermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Sw41Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>Utilisé dans le protocole étape 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td></tr><tr><td>SX4750 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>SxX4750 Adaptateur pour tubes à fond fixe</td><td>Beckman Coulter</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger ultraclairs à paroi mince ( 9/16 po x 3 1/2 po)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Collier de serrage à vis</td><td>pour tubes PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manomètres utilitaires</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

production du virus recombinant de la maladie de newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Le virus de la maladie de Newcastle (NDV), également connu sous le nom de sérotype 1 de l’orthoavulavirus aviaire, est un virus à ARN simple brin à sens négatif qui a été développé à la fois comme virus oncolytique et comme vaccin à vecteur viral. Le NDV est un agent thérapeutique et prophylactique attrayant en raison de son système génétique inverse bien établi, de ses puissantes propriétés immunostimulantes et de son excellent profil d’innocuité. Lorsqu’il est administré sous forme de virus oncolytique ou de vaccin à vecteur viral, le NDV provoque une réponse immunitaire robuste antitumorale ou spécifique à l’antigène, activant à la fois les bras innés et adaptatifs du système immunitaire. 
Compte tenu de ces caractéristiques souhaitables, le NDV a été évalué dans de nombreux essais cliniques et est l’un des virus oncolytiques les plus étudiés. À l’heure actuelle, deux essais cliniques enregistrés portant sur le NDV sont menés : l’un évaluant un vaccin recombinant à vecteur NDV pour le SARS-CoV-2 (NCT04871737) et l’autre évaluant un NDV recombinant codant pour l’interleukine-12 en association avec Durvalumab, un anticorps antiPD-L1 (NCT04613492). Pour faciliter l’avancement de ce vecteur viral très prometteur, des méthodes simplifiées pour générer du VND (VND) recombinant (RNDV) à titre in vivo à haute teneur sont nécessaires. 
Cet article décrit une procédure détaillée pour amplifier le rNDV dans des œufs de poule embryonnés sans agent pathogène spécifié (FPS) et purifier le rNDV du liquide allantoïque, avec des améliorations pour réduire les pertes pendant la purification. Sont également incluses des descriptions des tests de contrôle de la qualité recommandés, qui devraient être effectués pour confirmer l’absence de contaminants et l’intégrité du virus. Dans l’ensemble, cette procédure détaillée permet la synthèse, la purification et le stockage de NDV à haute teneur , in vivo, recombinant, lentogène et mésogénique pour une utilisation dans des études précliniques.

Récolte du liquide allantoïque Comme le liquide allantoïque est récolté à partir d’œufs de poule embryonnés, il devrait sembler clair et transparent. Si le fluide semble opaque et jaune, cela indique la présence de contaminants. L’inclusion de ce fluide allantoïque pendant la purification entravera le processus de purification, car la pression augmentera rapidement et dépassera 10 psi, entraînant le cisaillement du virus et la perte du virus infectieux. Le liquide allantoïque qui semble sanglant suggè...

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production, la purification et la quantification du virus recombinant à haut titre de la maladie de Newcastle. Ce protocole donne systématiquement > 6 × 109 unités formant de la plaque / mL, fournissant des quantités de virus appropriées pour les études animales in vivo . Des tests de contrôle de la qualité supplémentaires pour assurer la sécurité in vivo sont décrits.

Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Ce protocole décrit les techniques utilisées pour produire le virus de la maladie de Newcastle afin qu’il puisse être administré en toute sécurité aux souris et à d’autres animaux tels que les hamsters et les moutons. L’utilisation de la filtration à flux tangentiel permet de traiter plus efficacement de grands volumes de départ par rapport aux procédures existantes qui n’utilisent que des procédés de centrifugation. Il s’agit d’une longue procédure impliquant plusieurs étapes complexes, ce qui signifie que la gestion du temps peut être un problème.Je recommanderais d’identifier toutes les étapes de pause potentielles afin que la technique puisse être divisée de manière appropriée, minimisant ainsi le stress. Alex, un assistant de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour la purification du virus de la maladie de Newcastle ou NDV, commencez par amorcer le système expérimental précédemment défini en y faisant passer 50 millilitres de PBS.Arrêtez la pompe lorsqu’environ cinq millilitres de PBS sont laissés dans le tube. Ensuite, fixez un filtre de profondeur avec un indice de rétention micromolaire de un à trois sur le tube. Pour évacuer le filtre, retirez le deuxième bouchon du côté épique du filtre de profondeur, puis commencez à faire passer 50 millilitres supplémentaires de PBS dans le système.Une fois que le PBS commence à circuler à travers l’évent situé en haut du filtre, fermez le port et continuez à faire circuler le PBS à travers les lignes. Après cela, remplacez le récipient à déchets par un nouveau récipient de collecte stérile et commencez à faire passer le fluide allantoïque à travers le filtre de profondeur. Ensuite, configurez le système de filtration à flux tangentiel ou TFF dans une confirmation ouverte et exécutez-le comme décrit dans le manuscrit.Lorsqu’il reste environ cinq millilitres de fluide dans le réservoir, mettez la pompe en pause et ajoutez du liquide allantoïque filtré en profondeur au réservoir. Reprenez ensuite le débit de la pompe. Pour éviter le cisaillement du virus, il est important de s’assurer que la pression du système ne dépasse pas 10 livres de force par pouce carré.Pour augmenter l’illusion, une combinaison de la vitesse de la pompe péristaltique et de la pince C doit être utilisée. 150 à 100 millilitres de liquide allantoïque sont laissés dans le réservoir, mettent la pompe en pause et échangent le tampon en ajoutant 150 à 200 millilitres de tampon ML. Encore une fois, mettez la pompe en pause lorsque cinq à 10 millilitres de liquide sont laissés dans le réservoir, puis en utilisant deux pinces C, fermez la taille.Découplez la ligne rétendue alimentant le réservoir et insérez-la dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, reprenez l’écoulement et faites une pause lorsqu’il reste quelques gouttes de liquide dans le réservoir du réservoir. Ensuite, retirez les pinces C des conduites de déchets et rattachez la conduite d’alimentation en place au réservoir du réservoir.Pendant ce temps, pour se préparer à l’ultracentrifugation du gradient de densité de l’iodixanol, ajoutez d’abord un 0,5 millilitre de 40% d’iodixanol à un tube ultra centrifugeuse à paroi mince à toit ouvert de 13,2 millilitres. Ensuite, préparez la colonne avec des ajouts successifs de 2,5 millilitres de 20% d’iodixanol et de 2,5 millilitres de 10% d’iodixanol. Avant l’ultracentrifugation, ajoutez soigneusement six à 6,5 millilitres de la solution virale évoquée du système TFF à la colonne d’iodixanol sans perturber le gradient.Après ultracentrifugation, retirez les tubes avec une paire de pinces stériles. La bande cible doit être une grande bande entre les gradients de 10 et 20 %. Ensuite, suspendez le tube sur le dessus d’un bécher à l’aide d’un support d’autoclave.Après cela, attachez une aiguille de 1,5 pouce de calibre 18 à une seringue de cinq millilitres, puis perforez le côté du tube d’ultracentrifugation avec l’aiguille et retirez la bande cible en étendant lentement le piston. Après avoir retiré l’iodixanol de la solution virale décrite dans le manuscrit, utilisez une seringue pour injecter soigneusement le virus dans une cassette de dialyse. Pour concentrer la solution virale, retirez la cassette de dialyse du tampon de dialyse et placez-la dans un petit sac en plastique scellable.Ajoutez ensuite 15 à 25 millilitres de polyéthylène glycol à 40% dans le sac afin que la cassette de dialyse soit complètement immergée. Après la dialyse, rincez brièvement la cassette de dialyse avec du PBS. Ensuite, remplissez une seringue équipée d’une aiguille de 1,5 pouce de calibre 18 avec de l’air, insérez la seringue dans la cassette de dialyse et poussez le piston.Faites pivoter l’appareil pour éliminer le virus sans retirer l’air introduit. Pour déloger le virus résiduel adhérant à la membrane, massez soigneusement la membrane avec des doigts gantés sans l’endommager. Pour faciliter le processus de délogement, retirez une partie de l’excès d’air dans la cassette de dialyse.Pour les tests de contrôle de la qualité, diluez d’abord la solution virale 100 fois en ajoutant 10 microlitres à 990 microlitres de PBS dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, continuez la dilution en série en ajoutant 100 microlitres de la dilution précédente à 900 microlitres de PBS. Pour les tests d’infection, ajoutez 20 microlitres de chaque illusion à chaque puits d’une plaque de 96 puits.Avant d’examiner l’effet cytopathique de la protéine de fluorescence verte, ou d’effectuer un test d’immunofluorescence indirecte, incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 48 heures. En utilisant ce protocole, le NDV hautement purifié a été obtenu, comme l’a démontré l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de sulfate de sodium des protéines virales. L’infectiosité du virus purifié par cette méthode a également été vérifiée par la dose d’infection par culture tissulaire de 50% ou le test TCID50 effectué dans 96 plaques de puits.Le TCID50 a été déterminé à partir du nombre de puits positifs pour chaque dilution à l’aide du calculateur Spearman-Karber. Le test d’infection a révélé la différence entre les effets cytopathiques du VND lentogène et mésogénique sur les cellules DF one dans différentes conditions après 10 et 24 heures d’incubation. Le test immuno florence s’est également avéré efficace pour étudier l’infection des cellules Vero par le VND lentogène.Lors de l’amorçage du système expérimental, assurez-vous que les lignées sont amorcées efficacement, car tout hydroxyde de sodium résiduel inactivera le virus. Il est également important de maintenir l’intégrité de la membrane, car compromettre cela nuira considérablement à la purification et au rendement du virus.

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Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

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