Analyse à molécule unique de moteurs de la famille Sf9 superprocessive kinésine-3 purifiée

Le protocole offre une méthode simple pour purifier les moteurs moléculaires actifs à l’aide du système de baculovirus Sf9. Il détaille également la motilité d’une molécule unique et les tests de glissement multimoteur pour étudier le mécanisme de régulation des protéines motrices. Toute cette expression vectorielle traditionnelle du baculovirus Sf9 et la purification de l’affinité en une seule étape conduiront la protéine motrice pure et active à étudier les détails mécanistes des kinésines superprocessives dans les systèmes monomoléculaires et multimoteurs.

En plus des moteurs Kinesin, le protocole peut être appliqué pour étudier les propriétés biochimiques et biophysiques d’autres protéines à base de cytosquelette telles que la dionine et la myosine. Le protocole est détaillé et facile à suivre. Certaines suggestions sont de manipuler les cellules Sf9 avec précaution car elles sont sujettes à la contamination, et de suivre les notes fournies dans le protocole.

La démonstration visuelle est très efficace, facile à suivre et à comprendre les étapes critiques, en particulier pour ceux qui n’ont jamais effectué ces tests. Pushpanjali Soppina et Dipeshwari Shewale, doctorants travaillant avec moi et Pradeep Naik, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, ensemencez les cellules dans un plat de 35 millilitres, à une densité de 4,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.

Après 24 heures, mélanger un microgramme d’ADN bacmidique et 100 microlitres de média de Grace non supplémenté dans un tube. Mélanger six microlitres de réactif de transfection dans un autre tube avec 100 microlitres de média de Grace non supplémenté. Transférer soigneusement le contenu du premier tube dans le deuxième tube.

Mélangez-les et incuber le mélange pendant 45 minutes à température ambiante. Ajouter 0,8 millilitre de média de Grace non supplémenté au mélange. Mélangez et aspirez le support SFM Sf900 des cellules.

Ajouter le milieu de transfection préparé goutte à goutte sur le dessus des cellules et incuber la plaque pendant six heures. Ensuite, retirez délicatement le mélange de transfection. Ajouter deux millilitres de SF900 SFM et incuber davantage à 28 degrés Celsius pendant 48 heures.

Ensuite, vérifiez l’expression de la protéine motrice sous un microscope à fluorescence inversée. Récolter le milieu avec les cellules infectées et faire tourner pendant cinq minutes, à 500 G.Recueillir le surnageant et congeler les aliquotes. Ajouter 10 millilitres de milieu SF900 SFM avec des cellules et un millilitre de souche de virus P-zéro, dans une fiole conique stérile de 100 millilitres.

Incuber à 28 degrés Celsius avec agitation constante à 90 tr / min. Après 72 heures, faites tourner les cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres à 500 G pendant cinq minutes et recueillez le surnageant. Pour l’expression protéique à grande échelle, infectez 30 millilitres de la culture en suspension avec un millilitre de virus stock P1.

72 heures après l’infection, vérifier l’expression protéique des cellules et recueillir les cellules dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres. Après la filature, jetez le surnageant et récupérez la pastille de cellule. Pour lyser les cellules, ajoutez trois millilitres de tampon de lyse glacée à la pastille cellulaire.

Faites tourner le lysat cellulaire à 150 000 G pendant 30 minutes, à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant et mélangez-le avec 40 microlitres de résine d’affinité M2 à 50%ANTI-FLAG. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant trois heures avec un culbutage de bout en bout.

Maintenant, pelletez la résine FLAG en tournant à 500 G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Lavez la pastille de résine FLAG trois fois avec un tampon de lavage à froid glacé. Et après le troisième lavage, égoutter soigneusement le tampon de lavage.

Ensuite, ajoutez 70 microlitres de tampon de lavage contenant 100 microgrammes par millilitre de peptide FLAG, à la pastille de résine, et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius, comme démontré précédemment. Après filage, recueillir le surnageant contenant des protéines purifiées dans un tube frais. Préparez un mélange de polymérisation comme décrit dans le manuscrit et ajoutez 10 microlitres de tubuline au mélange de polymérisation.

Transférer le tube dans un bloc chauffant, préchauffé à 37 degrés Celsius, et incuber pendant 30 minutes. Après avoir préparé le tampon de stabilisation des microtubules, réchauffez-le et ajoutez-le aux microtubules polymérisés. Une fois la chambre cellulaire d’écoulement de motilité préparée, écoulez 30 microlitres de solution de microtubule diluée à travers la chambre.

Après 30 minutes, coulez 40 à 50 microlitres de tampon bloquant et incuberez-le. Préparez un mélange de motilité et ajoutez-y un microlitre du moteur purifié. Bien mélanger et faire couler la solution dans la chambre de motilité.

Sceller les deux extrémités de la chambre de motilité et l’image sous éclairage TIRF. Concentrez-vous sur les moteurs individuels marqués mCitirine, se déplaçant processivement. Mélanger la tubuline marquée à la rhodamine avec la tubuline non marquée dans un rapport de un à 10.

Après 30 minutes de polymérisation, ajouter doucement 30 microlitres de tampon de stabilisation des microtubules préchauffés et incuber davantage, pendant cinq minutes, à 37 degrés Celsius. Cisailler les microtubules en pipetant avec l’embout de chargement capillaire. Après avoir préparé la chambre d’écoulement de motilité, écoulez 50 microlitres de nanocorps GFP purifiés Sf9 et incuber pendant 30 minutes.

Bloquez la surface du glissement du couvercle en faisant couler 50 microlitres de tampon de bloc. Préparez 50 microlitres du mélange de moteurs. Écoulez-le dans la chambre après avoir mélangé doucement la solution et incuber pendant 30 minutes.

Lavez la chambre, deux fois, avec 50 microlitres de caséine P12. Préparez le mélange d’essai de glissement et mélangez-le délicatement, avant de le faire couler dans la chambre de motilité. Scellez les extrémités de la chambre de motilité et imagez le microtubule glissant sous l’éclairage de la TIRF.

Après 48 heures de transfection, les cellules non transfectées apparaissent petites, rondes et fermement attachées. Cependant, les cellules transfectées exprimant la protéine étaient faiblement attachées à la surface et présentaient un diamètre cellulaire élargi. Après 72 heures, plus de 90% des cellules Sf9 exprimaient le moteur KIF1A de kinésine-3 marqué par fluorescence, et les cellules étaient faiblement liées à la surface.

La protéine motrice kinésine-3 a été purifiée à partir des cellules Sf9 transfectées. Le kymographe représente le moteur kinésine-3 marchant processivement, le long de la surface du microtubule. Les événements de motilité ont montré une vitesse moyenne et une longueur d’exécution d’environ 2,44 micromètres par seconde et 10,79 micromètres respectivement.

Le kymographe indique le glissement lisse des microtubules par les moteurs kinésine-3, avec une vitesse moyenne d’environ 1,37 micromètre par seconde. Le plus important est d’ajouter le tampon de stabilisation sans perturber le mélange de microtubules et de ne pas cisailler le microtubule. Le protocole serait utile pour d’autres applications, telles que les mesures de l’ATPase, l’analyse biophysique, les mécanismes, les essais de reconstitution in vitro, etc.

En utilisant des moteurs purifiés sf9, nous avons récemment démontré que les moteurs kinesin-3 sont rapides et superprocesseurs. Fait intéressant, ces moteurs présentent des taux de rotation ATP élevés par rapport au moteur bien caractérisé, Kinesin-1.