Name: Préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Apprenez la préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo. Cette méthode permet d'observer des phénomènes neurophysiologiques avec des résultats reproductibles et robustes.

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Les auteurs remercient le Dr Gerald Hunsberger de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, États-Unis, et Galvani Bioelectronics (Stevenage, Royaume-Uni) pour avoir partagé leur technique originale de préparation nerveuse avec nous. Les auteurs remercient Robert Toth pour la conception du bain nerveux à double chambre. Les auteurs reconnaissent le financement de la subvention Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) du Conseil de recherches en génie et en sciences physiques (EPSRC). Les auteurs remercient le High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) de l’Imperial College London pour le financement d’Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux est actuellement financé par le UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Les auteurs remercient Zack Bailey de l’Imperial College, du Département de bioingénierie, pour son aide dans les expériences et l’accès aux tissus animaux pendant la production de l’article vidéo JoVE.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
DÉCLARATION SUR LE LIBRE ACCÈS : Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Common Attribution (CC BY) (lorsque l’UKRI l’autorise, la « Licence Open Government » ou la licence Creative Commons Attribution Sans dérivés (CC BY-ND) peut être indiquée à la place) à toute version manuscrite acceptée par l’auteur.

PARTAGE DES DONNÉES : Les données brutes utilisées dans les chiffres de cet article seront mises à disposition par les auteurs, sans réserve indue.

Dans ce travail, nous avons décrit un protocole pour préparer les nerfs sciatiques de rat à la neurophysiologie ex vivo. L’extraction tissulaire prend environ 30 minutes, y compris la manipulation des animaux, l’anesthésie, l’abattage et la dissection, tandis que le nettoyage des nerfs, la mise en bain et l’implantation d’électrodes devraient nécessiter 30 minutes supplémentaires avant que l’enregistrement puisse commencer. La préparation du tampon peut être effectuée en 30 minutes, bien que cela puisse être fai...

La compréhension actuelle de la fonction nerveuse fondamentale telle que modélisée in silico manque à plusieurs égards, notamment en ce qui concerne les effets de la compartimentation du tissu nerveux en dehors du soma, de l’axone et des dendrites. Les interactions axon-myéline sont encore mal comprises, comme en témoigne le fait que même des modèles nerveux computationnels détaillés tels que MRG1 (pour les nerfs de mammifères) qui capturent correctement la réponse de stimulation électrique conventionnelle, ne capturent pas d’autres comportements observés expérimentalement tels que le transfert de bloc à haute fréquence2 ou la réponse d’apparition secondaire3.
Ce protocole fournit une méthode pour étudier efficacement les processus neurophysiologiques au niveau nerveux dans un modèle aigu de petit animal de laboratoire, en utilisant un protocole de préparation standardisé pour isoler le nerf, contrôler son environnement et le faire passer d’un contexte in vivo à un contexte ex vivo. Cela empêchera d’autres processus corporels ou anesthésiques utilisés par les protocoles de stimulation nerveuse in vivo de modifier le comportement nerveux et de confondre les résultats mesurés ou leur interprétation 4,5. Cela permet le développement de modèles plus réalistes se concentrant uniquement sur les effets spécifiques aux tissus nerveux mal compris. Ce protocole est également utile comme banc d’essai pour la nouvelle stimulation nerveuse et l’enregistrement des matériaux et des géométries des électrodes, ainsi que pour de nouveaux paradigmes de stimulation tels que le blochaute fréquence 2,3. Des variantes de cette technique ont déjà été utilisées pour étudier la physiologie nerveuse dans des conditions étroitement contrôlées6, par exemple, pour mesurer la dynamique et les propriétés des canaux ioniques ou les effets des anesthésiques locaux7.
Cette technique offre plusieurs avantages par rapport à des alternatives telles que l’expérimentation aiguë in vivo de petits animaux8. La technique évite d’avoir à maintenir la profondeur de l’anesthésie car le tissu a été extrait du corps, réduisant ainsi la quantité d’équipement requis tel qu’un diffuseur anesthésique, un concentrateur d’oxygène et un coussin chauffant. Cela simplifie le protocole expérimental, réduisant ainsi le risque d’erreurs. Comme les anesthésiques peuvent potentiellement altérer la fonction nerveuse4, cette technique garantit que les mesures ne seront pas confondues par les effets secondaires de ces composés anesthésiques. Enfin, cette technique est plus appropriée que les expériences in vivo aiguës lors de l’étude des effets de composés neurotoxiques tels que la tétrodotoxine, qui tueraient un animal anesthésié par paralysie.
Les sections nerveuses périphériques sont un système ex vivo unique car il y a de fortes chances que les fibres responsables des signaux neuronaux enregistrés ne contiennent pas de soma. Comme ceux-ci seraient normalement situés, pour les motoneurones, dans la colonne vertébrale, et pour les neurones sensoriels dans les ganglions de la racine dorsale à côté de la colonne vertébrale, la préparation d’une section du nerf mammifère peut être grossièrement modélisée comme une collection de membranes tubulaires avec des canaux ioniques, ouverts aux deux extrémités9. Le métabolisme est maintenu par les mitochondries situées dans l’axone au moment de la dissection tissulaire10. La suture des extrémités ouvertes de l’axolemme est encouragée après l’extraction pour les fermer et aider ainsi à maintenir les gradients ioniques existants à travers la membrane, qui sont essentiels pour le fonctionnement normal des nerfs.
Pour maintenir l’homéostasie tissulaire à l’extérieur du corps, plusieurs variables environnementales doivent être étroitement contrôlées. Il s’agit de la température11, de l’oxygénation12, de l’osmolarité, du pH13,14 et de l’accès au glucose pour maintenir le métabolisme. Pour ce protocole, l’approche consiste à utiliser un tampon Krebs-Henseleitmodifié 15,16 (mKHB) aéré en continu avec un mélange d’oxygène et de dioxyde de carbone. Le mKHB fait partie de la famille des tampons cardioplégiques 6,17 utilisés pour préserver les tissus disséqués à l’extérieur du corps, par exemple dans des expériences ex vivo. Ces tampons ne contiennent pas d’hémoglobine, d’antibiotiques ou d’antifongiques et ne conviennent donc qu’aux préparations impliquant de petites quantités de tissu pendant un temps limité. Le contrôle du pH a été réalisé avec la paire redox carbonate et dioxyde de carbone, nécessitant une aération constante du tampon avec du dioxyde de carbone pour maintenir l’équilibre du pH. Il s’agit d’éviter d’utiliser d’autres agents tampons courants tels que HEPES, qui peuvent modifier la fonction des cellules nerveuses18. Pour oxygéner le tampon et contrôler le pH, un mélange de 5% de dioxyde de carbone dans l’oxygène appelé carbogène (95% O2, 5% CO2) a été utilisé. Un agitateur chauffant a été utilisé pour le contrôle de la température d’un récipient tampon, et le tampon a été perfusé à travers un bain nerveux, puis recirculé dans le récipient de départ. Une expérience typique durerait de 6 à 8 heures avant que le nerf ne perde sa viabilité et ne réponde plus suffisamment à la stimulation pour que les mesures soient représentatives des tissus sains.
Pour optimiser le rapport signal/bruit, des électrodes de chlorure d’argent ont été utilisées pour l’enregistrement, qui ont été préparées selon les méthodes décrites précédemment19. Pour la stimulation, une combinaison d’électrodes de brassard en platine prêtes à l’emploi et d’électrodes de brassard en polymère conducteur sur mesure peut être utilisée. Les électrodes conductrices à manchette en polymère ont des capacités de charge nettement plus élevées, ce qui est utile pour stimuler le nerf à l’aide de formes d’onde de haute amplitude20.
Le stimulateur utilisé dans ce protocole a déjà été décrit20. La documentation, les fichiers de conception et les scripts logiciels pour l’utiliser sont accessibles au public21. D’autres stimulateurs peuvent être utilisés pour exécuter ce protocole; cependant, le stimulateur personnalisé est également capable de bloc de courant alternatif à haute fréquence (HFAC) 2,20, ce qui permet un plus large éventail d’expériences de neurophysiologie. Pour utiliser le bloc HFAC, des poignets en élastomère conducteurs sont recommandés pour éviter d’endommager le nerf. Les poignets nerveux en élastomère conducteur sont des réseaux d’électrodes souples et entièrement polymères produits à partir d’élastomères conducteurs comme composant conducteur et de polydiméthylsiloxane comme isolant22. Les dispositifs ont été fabriqués dans une configuration bipolaire en utilisant des techniques conventionnelles de microfabrication laser.

<table><tbody><tr><td>1 L Bouteille en verre</td><td>VWR International Ltd</td><td>215-1595</td><td>Verre borosilicaté</td></tr><tr><td>1 L Flacon gradué en verre</td><td>VWR International Ltd</td><td>612-3626</td><td>Verre borosilicaté</td></tr><tr><td>2 L Bouteille en verre</td><td>VWR International Ltd</td><td>215-1596</td><td>Verre borosilicaté</td></tr><tr><td>2 L Flacon gradué en verre</td><td>VWR International Ltd</td><td>BRND937254</td><td>Verre borosilicaté</td></tr><tr><td>Adaptateur, pneumatique, 8 mm à 1/4 NPT</td><td>RS UK</td><td>536-2599</td><td>Adaptateur droit à emboîter entre le tuyau d’oxygène et le tube de dispersion de gaz</td></tr><tr><td>Revêtement conforme Alkoxy</td><td>Farnell</td><td>1971829</td><td>ACC15 Revêtement conforme Alkoxy pour la dissection Préparation de la boîte de Pétri</td></tr><tr><td>Anesthésique</td><td>Chanelle</td><td>N/A</td><td>Isoflurane Anesthésique par inhalation, flacon de 250 mL</td></tr><tr><td>Bécher, 2 L</td><td>VWR International Ltd</td><td>213-0469</td><td>Verre borosilicaté</td></tr><tr><td>Ballon nerveux bipolaire</td><td>Cortec GMBH</td><td>N/A</td><td>diamètre intérieur de 800 microns, sortie de fil perpendiculaire, pas de terminaison de connecteur</td></tr><tr><td>Bossages</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bossages de laboratoire humide standard pour la fixation des pinces aux tiges</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td>500 g en bouteille plastique</td></tr><tr><td>Bidon de carbogène</td><td>BOC</td><td>N/A</td> Tube à centrifuger à <td>cartouche de taille F</td></tr><tr><td>, volume de 15 mL</td><td>VWR International Ltd</td><td>734-0451</td><td>Tubes</td></tr><tr><td>Falcon Ballon nerveux en élastomère conducteur</td><td>N/A</td><td>N/A Ballon</td><td>nerveux à haute capacité de charge pour la stimulation, voir protocole de référence de fabrication</td></tr><tr><td>Connecteur, Termimate</td><td>Mouser UK</td><td>538-505073-1100-LP</td><td>Ceux-ci doivent être soudés à un fil terminé par des pinces crocodiles (voir entrée 11)</td></tr><tr><td>Connecteurs à pince crocodile</td><td>RS UK</td><td>212-1203 Ceux-ci</td><td>doivent être soudés à un fil terminé par des connecteurs TermiMate (voir entrée 10)</td></tr><tr><td>Eau déminéralisée</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Obtenue à partir d’un distributeur d’eau déionisée</td></tr><tr><td>Pince inclinée à 45 degrés</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91110-10</td><td>Pince fine, gamme étudiante</td></tr><tr><td>Pince standard Dumont #7</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91197-00</td><td>Pince pour enfants</td></tr><tr><td>Pince à gaz Tube de dispersion, porosité 3</td><td>Merck</td><td>12547866</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Glucose anhydre, poudre</td><td>VWR International Ltd</td><td>101174Y</td><td>500 g en bouteille plastique</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pinces de laboratoire humide standard montées sur tige</td></tr><tr><td>Agitateur chauffant</td><td>RS UK</td><td>768-9672</td><td>Stuart US152</td></tr><tr><td>Hémostatiques</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tout appareil de >12 cm de longueur convient</td></tr><tr><td>Épingles à insectes, acier inoxydable, taille 2</td><td>InterFocus Ltd</td><td>26001-45</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ordinateur portable</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tout ordinateur portable sans danger pour le laboratoire avec au moins 2 ports USB inutilisés convient</td></tr><tr><td>Filtre à bruit de ligne</td><td>Digitimer</td><td>N/A</td><td>Éliminateur de bruit Humbug (filtre à bruit de ligne 50 Hz)</td></tr><tr><td>Silencieux Préamplificateur, SR560</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR560</td><td>Préamplificateur de tension à faible bruit</td></tr><tr><td>Sel de sulfate de magnésium</td><td>VWR International Ltd</td><td>291184P</td><td>500g en bouteille plastique</td></tr><tr><td>Scripts MATLAB</td><td>Github</td><td>https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch</td><td>Scripts d’initialisation, d’étalonnage et de stimulation pour le</td></tr><tr><td>logiciel MATLAB de stimulateur personnalisé</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>Ensemble standard</td></tr><tr><td>Microscope Light, PL-2000</td><td>Photonic</td><td>N/A</td><td>Source lumineuse avec cols de cygne. Le produit peut être obtenu auprès d’un fournisseur tiers</td></tr><tr><td>Microscope, SMZ 745</td><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Nikon</td><td>SM745</td></tr><tr><td>Huile minérale, non toxique</td><td>VWR International Ltd</td><td>31911.A1</td><td>Huile pour bain nerveux</td></tr><tr><td>Bain nerveux</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Bain nerveux usiné en plexiglas, voir protocole pour plus de détails.</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>LeCroy</td><td>N/A</td><td>434 Wavesurfer. Le produit peut être obtenu auprès de fournisseurs tiers</td></tr><tr><td>Tuyau d’oxygène, 1 mètre</td><td>BOC</td><td>N/A</td><td>1/4 » Terminaisons NPT</td></tr><tr><td>Régulateur d’oxygène</td><td>BOC</td><td>C106X/2B :3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique P-1</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>N/A</td><td>Le produit peut être obtenu auprès du fournisseur tiers</td></tr><tr><td>Petri Dish, Glass</td><td>VWR International Ltd</td><td>391-0580&nbsp ;</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sel Sigma Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td>250 g en bouteille plastique</td></tr><tr><td>Sel de sulfate de dihydrogène de potassium</td><td>Merck</td><td>1.04873.0250</td><td>250 g en bouteille plastique</td></tr><tr><td>Rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Sprague Dawley, 250-330 grammes,</td></tr><tr><td>électrode de référence femelle, ET072</td><td>eDaQ (Australie)</td><td>ET072-1</td><td>Électrode de référence en chlorure d’argent</td></tr><tr><td>Tige</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tiges de laboratoire humides standard avec raccords pour supports</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorius</td><td>N/A</td><td>M-Power, pour le pesage des poudres. Le produit peut être obtenu auprès de fournisseurs tiers</td></tr><tr><td>Ciseaux droits 12 cm bord</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91400-12</td><td>terminaison émoussée-émoussée, gamme étudiante</td></tr><tr><td>Dispositif d’acquisition de signal</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Micro3-1401</td><td>Micro3-1401 ADC multicanal</td></tr><tr><td>Graisse silicone, non toxique</td><td>Farnell</td><td>3821559</td><td>pour l’étanchéité de la cloison de baignoire</td></tr><tr><td>Tube en silicone, intérieur de 2 mm diamètre</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tube en silicone, 5 mm diamètre intérieur</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fil d’argent</td><td>Alfa Aesar</td><td>41390</td><td>0,5 mm, recuit</td></tr><tr><td>Sel de bicarbonate</td><td>de sodium Sigma Aldrich</td><td>S5761-500g</td><td>500 g en bouteille en plastique</td></tr><tr><td>Sel de chlorure de sodium</td><td>VWR International Ltd</td><td>27810.295</td><td>1 kg en bouteille en plastique</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort coudés bord 2 mm</td><td>InterFocus Ltd</td><td>15010-09</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Support</td><td>N/A</td><td>N/A N/A</td><td>Supports de laboratoire humides standard avec douilles pour tiges</td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>Digitimer</td><td>DS3</td><td>DS3 ou Stimulateur personnalisé (voir références)</td></tr><tr><td>Agitation puce</td><td>VWR International Ltd</td><td>442-0270</td><td>À utiliser avec l’agitateur chauffant</td></tr><tr><td>Embout de seringue, émoussé, 1 mm de diamètre</td><td>N/ A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Embout de seringue, émoussé, 2 mm de diamètre</td><td>N</td><td>/A N/A</td> N<td>/A</td></tr><tr><td>Seringue, plastique, volume 10 mL</td><td>N/A</td><td>N/A La</td><td>seringue doit être munie d’un raccord Luer</td></tr><tr><td>Lock Ruban adhésif résistant à l’eau</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pour fixer les tubes et le câblage à l’établi</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>VWR International Ltd</td><td>620-0806</td><td>Thermomètre en verre</td></tr><tr><td>USB Power Banque</td><td>RS UK</td><td>135-1000</td><td>Alimentation stimulateur personnalisé, charge complète avant l’expérience. Non nécessaire en cas d’utilisation de la vanne DS3</td></tr><tr><td>, Leuer Lock, 3-Way</td><td>VWR International Ltd</td><td>229-7440</td><td>Pour fixer la seringue au tube d’alimentation du bain et au siphon d’amorçage</td></tr></tbody></table>

préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Les préparations ex vivo permettent d’étudier de nombreux processus neurophysiologiques isolément du reste du corps tout en préservant la structure tissulaire locale. Ce travail décrit la préparation des nerfs sciatiques de rat pour la neurophysiologie ex vivo, y compris la préparation du tampon, les procédures animales, la configuration de l’équipement et l’enregistrement neurophysiologique. Ce travail donne un aperçu des différents types d’expériences possibles avec cette méthode. La méthode décrite vise à fournir 6 h de stimulation et d’enregistrement sur le tissu nerveux périphérique extrait dans des conditions étroitement contrôlées pour une cohérence optimale des résultats. Les résultats obtenus à l’aide de cette méthode sont des potentiels d’action composés (CAP) de fibres A avec des amplitudes de crête à crête de l’ordre du millivolt sur toute la durée de l’expérience. Les amplitudes et les formes de CAP sont cohérentes et fiables, ce qui les rend utiles pour tester et comparer de nouvelles électrodes à des modèles existants, ou les effets d’interventions sur les tissus, tels que l’utilisation de produits chimiques, d’altérations chirurgicales ou de techniques de stimulation neuromodulatrice. Les électrodes de brassard conventionnelles disponibles dans le commerce avec des contacts platine-iridium et les électrodes en élastomère conducteur sur mesure ont été testées et ont donné des résultats similaires en termes de réponse force-durée du stimulus nerveux.

Les résultats représentatifs qui peuvent être obtenus avec ce protocole sont les potentiels d’action composé cohérents des fibres nerveuses de type A dans le nerf sciatique. Ces potentiels d’action ont généralement une amplitude de crête à crête d’environ 1 mV à l’électrode et donc de 100 mV une fois amplifié (Figure 2). Des amplitudes de stimulation et des largeurs d’impulsion similaires devraient donner des amplitudes CAP similaires. Les électrodes de brassard en élastomère conductrice néc...

Ce protocole décrit la préparation de tissu nerveux sciatique entier de rat pour la stimulation électrophysiologique ex vivo et l’enregistrement dans un bain salin perfusé à deux compartiments régulé par l’environnement.

Préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

Ce protocole permet d’observer de nombreux phénomènes neurophysiologiques qui ne sont pas bien compris, tels que le transfert de bloc nerveux après une injection de courant à haute fréquence / haute amplitude, tout en empêchant les interférences d’autres processus dans un corps vivant. Cette technique donne des résultats hautement reproductibles et robustes et est plus pratique que l’électrophysiologie in vivo, car des variables complexes telles que la profondeur de l’anesthésie n’ont pas besoin d’être contrôlées et ne peuvent donc pas influencer les mesures. Après une procédure d’euthanasie sous anesthésie, placez un rat femelle sur la table de dissection, tenez fermement la cheville entre le pouce, l’index et le majeur et coupez le tendon calcanéen à l’aide de ciseaux contondants droits de 12 centimètres.À l’aide de pinces fines et de ciseaux, faites des incisions minutieuses à travers les couches musculaires près du milieu de l’arrière de la jambe jusqu’à ce que le nerf sciatique soit exposé. Une fois que le nerf est visible, hydratez la cavité à l’aide d’un tampon Krebs-Henseleit modifié par le froid glacial, ou MKHB, pour empêcher le nerf de se dessécher. À l’aide d’hémostats, tirez les lambeaux de peau de chaque côté et maintenez l’incision ouverte pour une dissection plus fine.En partant de l’emplacement de l’incision du tendon calcanéen, à l’aide de ciseaux fins, interrompez le muscle du côté médian de la jambe pour libérer le nerf. Continuez à maintenir les niveaux d’humidité dans la région avec du MKHB glacé. Lorsque le nerf est exposé tout en remontant la jambe, disséquez le tissu musculaire sus-jacent.Libérez le nerf plus près de la colonne vertébrale des tissus conjonctifs jusqu’à atteindre la fente vertébrale, auquel cas il y a un pli dans le nerf. Ne nettoyez pas encore le nerf, car la vitesse est essentielle à ce stade. Pour faciliter la dissection, à l’aide d’une pince, tirez doucement l’extrémité du nerf près de la cheville.Ensuite, à l’aide de ciseaux fins, gravez le nerf près de la colonne vertébrale. Placez le nerf disséqué dans un tube centrifuge de 15 millilitres rempli de MKHB et replacez le tube sur la glace jusqu’au début de la procédure de nettoyage. Remplissez la boîte de Petri enduite à mi-chemin avec du MKHB oxygéné réfrigéré, puis placez un nerf sciatique disséqué dans le plat et épinglez les deux extrémités du nerf au plat de sorte que le nerf soit droit sans plis, torsion ou torsions.À l’aide de sutures de soie 6-0 ou d’un fil fin, nouez un double nœud autour de chaque extrémité du nerf pour éviter les fuites de cytosol dans le tampon. Placez les nœuds juste à côté des épingles à insectes sur le côté plus près du centre du nerf pour éviter les fuites du tissu nerveux dans le tampon. Au microscope, à l’aide de ciseaux à ressort inclinés de deux millimètres et de pinces fines, retirez la graisse, les vaisseaux sanguins et le tissu musculaire du nerf.Taillez toutes les branches nerveuses qui ne seront pas utilisées dans la stimulation et l’enregistrement. Après toutes les cinq minutes de nettoyage, remplacez le tampon par du MKHB frais, réfrigéré et oxygéné. Après le nettoyage, replacez le nerf dans le tube de transport rempli de tampon et reposez le tube sur de la glace.Préparez un bain nerveux propre à double chambre. À l’aide de têtes de bossage et de pinces de laboratoire standard, placez le bain nerveux sous le niveau de la bouteille de deux litres placée sur l’agitateur chauffant. Connectez le drain du bain à l’entrée de la pompe péristaltique.Connectez la sortie de la pompe péristaltique à un tube renvoyant au flacon tampon. Connectez l’entrée de bain à un tube avec une soupape de débit réglable et placez le tube à l’intérieur de la bouteille. Utilisez une valve à trois voies avec une seringue connectée à la sortie centrale pour aider à amorcer le tube en tant que siphon pour l’entrée de tampon assistée par gravité.Amorcer le siphon en tirant la seringue jusqu’à ce que le tampon s’y écoule. Configurez la vanne de telle sorte que le débit tampon dans le bain soit de cinq à six millimètres par minute. Le débit peut être augmenté initialement pour remplir le bain.Une fois que le niveau de tampon du bain a atteint le drain, placez les nerfs dans le bain. À l’aide d’une épingle à insectes, fixez l’extrémité du nerf au coin de la chambre de bain remplie de tampons. À l’aide de pinces fines inclinées à 45 degrés et en pinçant le nerf uniquement aux extrémités, enfilez soigneusement le nerf à stimuler à travers le trou dans la cloison entre les deux chambres de bain.À l’aide d’une épingle à insectes, fixez l’autre extrémité du nerf dans la chambre à huile du bain, en veillant à ce que le nerf soit droit sans être étiré et exempt de plis et de torsions. À l’aide de graisse de silicone, faites un joint pour éviter les fuites de tampon de la chambre tampon dans la chambre à huile Remplissez la chambre d’huile avec du silicone ou de l’huile minérale. Placez les crochets d’électrode d’enregistrement argent/chlorure d’argent dans la chambre à bain d’huile et fixez-les à l’aide de têtes de bossage et de pinces.Ensuite, drapez la partie du nerf dans le bain d’huile sur les crochets sans tirer le nerf tendu. Ajustez ou réparez le joint de graisse en silicone si une fuite est observée après avoir déplacé le nerf. Connectez l’électrode de référence en argent/chlorure d’argent à la masse de l’amplificateur et placez l’électrode dans la chambre de bain remplie de tampons en la fixant à l’aide d’une pince de laboratoire.Après avoir préparé une électrode de brassard nerveux propre pour la stimulation, placez l’électrode dans la chambre de bain remplie de tampon. À l’aide d’une pince ou d’une pince à épiler fine avec des pointes émoussées ou inclinées, ouvrez l’électrode dans le bain pour mouiller l’intérieur du brassard. S’il reste des bulles, utilisez une seringue fine pour extraire le tampon du bain et forcez les bulles à sortir du brassard.À l’aide d’une pince, ouvrez doucement le brassard et faites-le glisser sous le nerf. Fermez le brassard autour du nerf, en évitant tout pli ou torsion du nerf. Connectez l’électrode de stimulation et l’électrode de retour de courant au stimulateur.Si vous utilisez une feuille de platine carrée comme électrode de retour de courant, placez la feuille loin du nerf dans le bain. Fixez le fil des deux électrodes avec du ruban adhésif. Connectez la sortie du signal TTL du stimulateur au canal quatre de l’oscilloscope.Sur l’écran de l’oscilloscope, appuyez sur l’onglet Canal de déclenchement et spécifiez le canal quatre comme canal de déclenchement. Réglez le niveau de déclenchement sur un volt à l’aide du bouton de niveau. Sur l’oscilloscope, réglez la résolution temporelle à une milliseconde par division et la résolution de tension à 10 millivolts par division.Centrez la référence du déclencheur dans le temps et réglez le niveau du déclencheur sur un volt. Après avoir connecté le stimulateur à l’ordinateur, allumez le stimulateur en connectant l’alimentation de la batterie à l’entrée d’alimentation. Ensuite, démarrez le logiciel MATLAB sur l’ordinateur.Exécutez le script MATLAB personnalisé. Ensuite, ouvrez le script MATLAB indiqué. Modifiez le script et définissez les paramètres amplitude de l’impulsion du stimulateur à moins 300 microampères, la largeur de l’impulsion du stimulateur à 300 microsecondes, le nombre d’impulsions du stimulateur à 10 et le temps du stimulateur entre les impulsions à une seconde.Démarrez le protocole de stimulation en cliquant sur Exécuter dans le logiciel. Le potentiel d’action du composé, ou CAP, avait une amplitude de crête à crête d’un millivolt à l’électrode et de 100 millivolts lorsqu’il était amplifié. L’excitabilité nerveuse typique des poignets nerveux en platine standard et des poignets nerveux en élastomère conducteurs sur mesure est montrée ici.Le CAP obtenu ex vivo au cours d’une journée d’expériences utilisant les deux nerfs sciatiques est montré ici. Une réduction minimale de l’amplitude de la CAP a été observée avec le nerf sciatique droit. En revanche, l’amplitude cap du nerf sciatique gauche à environ trois millivolts était similaire à celle du nerf sciatique droit au début de l’expérience plus de six heures après l’extraction nerveuse.Mettez l’accent sur la précision et la répétabilité dans la technique de dissection, de nettoyage et de mise en œuvre. Faites attention à ce qui se passe dans le bain. Si le signal nerveux est perdu, il se peut simplement que les électrodes ne soient pas en bon contact ou qu’il y ait une solution saline dans la cloison de l’huile de bain, et non que le nerf soit mort.Les nouveaux utilisateurs peuvent être tentés de se précipiter, en particulier pendant la phase de dissection. Cela conduira probablement à des erreurs et endommagera le nerf. La précision et la cohérence sont essentielles ici et conduiront à des résultats de meilleure qualité.Une attention particulière devrait également être accordée à la cohérence dans la préparation du tampon.

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JoVE Journal

Neuroscience

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Nous démontrons un protocole pour l'isolement du nerf axoplasme sciatique de rat adulte repose sur la dissection des fascicules nerveux et l'incubation dans le milieu hypotonique pour libérer de la myéline et Lyse non axonale structures, suivie de l'extraction de l'axone reste-matériau enrichi.

Isolement axoplasme du nerf sciatique du rat

Grâce à la simplicité de la chirurgie et le résultat robuste du comportement, de constriction chronique du nerf sciatique est l'un des modèles animaux pré-éminents de la douleur neuropathique. Dans les 24 heures suivant la chirurgie, hypersensibilité à la douleur est établi et peut être mesurée quantitativement l'aide d'un von Frey esthésiomètre (essais mécaniques) et le compteur analgésie plantaire (essai thermique).

Constriction chronique du nerf sciatique et les essais hypersensibilité à la douleur chez le rat

Cette vidéo montre un enregistrement à fibre unique de la conduction nerveuse de la fibre C chez le rat. Un rat anesthésié est incisé pour exposer le nerf sciatique, qui fournit l’alimentation sensorielle et motrice des membres inférieurs. Les fibres C individuelles sont ensuite exposées. La stimulation électrique est fournie à l’aide d’électrodes de stimulation implantées dans le pied, et une réponse est enregistrée à partir d’une seule fibre nerveuse.

Enregistrement in vivo d’une seule fibre du nerf sciatique C chez le rat

Ici, nous présentons une technique in vivo de transfert de gènes vers les cellules de Schwann (SC) dans le nerf sciatique du rongeur. Cette technique simple est utile pour étudier les mécanismes de signalisation impliqués dans le développement et le maintien des CS myélinisants.

In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation

Techniques de l’excitabilité axonale fournissent un outil puissant pour étudier la physiopathologie et les changements biophysiques qui précèdent les événements dégénératives irréversibles. Ce manuscrit illustre l’utilisation de ces techniques sur le nerf cubital de rats anesthésiés.

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Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les structures fines des nerfs périphériques en obtenant et en coloration de 1 à 2 µm sections avec toluidine...

Toluidine bleu coloration des Sections enrobées dans la résine pour l’évaluation de la morphologie des nerfs périphériques

L'enregistrement à fibre unique est une technique électrophysiologique efficace qui s'applique aux systèmes nerveux central et périphérique. Avec la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché, le mécanisme de l'échec de conduction est examiné. Les deux protocoles améliorent la compréhension de la relation du système nerveux périphérique avec la douleur.

Utilisation de l'enregistrement in vivo à fibre unique et du ganglion de racine dorsal intact avec le nerf sciatique attaché pour examiner le mécanisme de l'échec de conduction

Ce protocole décrit l’enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurons lombaires de rat avec la stimulation simultanée de courant direct trans-spinal. La méthode nous permet de mesurer les propriétés de la membrane et d’enregistrer le tir rythmique des motoneurons avant, pendant et après la polarisation anodale ou cathodale de la moelle épinière.

Enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct

L’analyse automatisée de démarche est un outil faisable pour évaluer la récupération fonctionnelle dans les modèles de rongeur des dommages périphériques de nerf et des dommages de contusion de moelle épinière. Bien qu’il ne nécessite qu’une seule configuration pour évaluer la fonction locomotrice dans divers modèles expérimentaux, l’ajustement méticuleux des marchandises dures et douces et la formation des animaux est très important.

Analyse automatisée de la démarche pour évaluer la récupération fonctionnelle chez les rongeurs ayant des lésions périphériques du nerf ou de la contusion de la moelle épinière

Dans le système de coculture des ganglions de la racine dorsale et des cellules de Schwann, la myélinisation du système nerveux périphérique peut être étudiée. Ce modèle offre des possibilités expérimentales d’observer et de quantifier la myélinisation périphérique et d’étudier les effets des composés d’intérêt sur la gaine de myéline.

Myélinisation in vitro d’axones périphériques dans une coculture d’explants de ganglions radiculaires dorsaux de rat et de cellules de Schwann

Dans cette étude, nous démontrons un protocole d’électromyographie à fibre unique (SFEMG) affiné pour permettre la mesure in vivo de la transmission de la jonction neuromusculaire (JNM) dans des modèles de rongeurs. Une approche étape par étape de la technique SFEMG est décrite pour permettre la quantification de la variabilité et de l’échec de la transmission de la JNM dans le muscle gastrocnémien du rat.

Électromyographie monofibre stimulée (SFEMG) pour l’évaluation de la transmission des jonctions neuromusculaires dans des modèles de rongeurs

Apprenez la préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo. Cette méthode permet d'observer des phénomènes neurophysiologiques avec des résultats reproductibles et robustes.

Préparation du nerf sciatique de rat pour la neurophysiologie ex vivo

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