Name: Imagerie 3D quantitative de cellules infectées par Trypanosoma cruzi, d’amastigotes dormants et de cellules T dans des organes clarifiés intacts (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez la microscopie à feuille de lumière pour visualiser Trypanosoma cruzi et les cellules T dans des organes clarifiés. Cette méthode permet d'évaluer les traitements contre la maladie de Chagas.

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Nous remercions le Dr Etsuo Susaki pour son aide précieuse et ses recommandations concernant les protocoles de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage. De plus, nous sommes reconnaissants à M. Kandasamy du noyau de microscopie biomédicale du CTEGD pour son soutien technique à l’aide de LSFM et de l’imagerie confocale. Nous remercions également tous les membres du Tarleton Research Group pour leurs suggestions utiles tout au long de cette étude.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
<li>Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).</li>
<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

L’absence d’imagerie approfondie des parasites et de la réponse immunitaire limite la compréhension de la complexité des interactions hôte-parasite et entrave l’évaluation des thérapies pour la maladie de Chagas. La présente étude a adopté le pipeline CUBIC pour clarifier et colorer les organes et tissus intacts de souris infectées par T. cruzi.
Plusieurs protocoles de nettoyage tissulaire ont été testés dans cette étude (PACT32, ECi 33, FLASH...

La maladie de Chagas, causée par le parasite protozoaire T. cruzi, est l’une des maladies tropicales les plus négligées au monde, causant environ 13 000 décès annuels. L’infection progresse souvent d’un stade aigu à un stade chronique produisant une pathologie cardiaque chez 30% des patients, y compris des arythmies, une insuffisance cardiaque et une mort subite 1,2. Malgré la forte réponse immunitaire de l’hôte provoquée contre le parasite pendant la phase aiguë, un faible nombre de parasites persiste de façon chronique tout au long de la vie de l’hôte dans des tissus tels que le cœur et les muscles squelettiques. Plusieurs facteurs, dont l’apparition tardive de réponses immunitaires adaptatives et la présence de formes non réplicatives du parasite, peuvent contribuer à la capacité de T. cruzi d’éviter une élimination complète par le système immunitaire 3,4,5,6. De plus, les formes dormantes non réplicatives du parasite présentent une faible sensibilité aux médicaments trypanocides et peuvent en partie être responsables de l’échec du traitement observé dans de nombreux cas 7,8.
Le développement de nouvelles techniques d’imagerie permet de mieux comprendre la distribution spatiale des parasites dans les tissus infectés et leur relation avec les cellules immunitaires impliquées dans leur contrôle. Ces caractéristiques sont cruciales pour une meilleure compréhension des processus de contrôle des parasites par le système immunitaire et le suivi des rares parasites dormants présents dans les tissus chroniques.
La microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) est l’une des méthodes les plus complètes et les plus impartiales pour l’imagerie 3D de grands tissus ou organes sans coupe mince. Les microscopes à feuille de lumière utilisent une fine feuille de lumière pour exciter uniquement les fluorophores dans le plan focal, réduire le photoblanchiment et la phototoxicité des échantillons et enregistrer des images de milliers de couches tissulaires à l’aide de caméras ultra-rapides. Le haut niveau de transparence tissulaire nécessaire à la bonne pénétration de la lumière laser dans les tissus est obtenu en homogénéisant l’indice de réfraction (IR) suite à la délipidation et à la décoloration des tissus, ce qui réduit la diffusion de la lumière et rend des images de haute qualité 9,10,11.
Des approches de nettoyage tissulaire ont été développées pour l’imagerie de souris entières 12,13,14, d’organoïdes 15,16,17, d’organes exprimant des marqueurs fluorescents rapporteurs 18,19,20,21,22,23 et, récemment, d’un nombre limité de tissus humains 24 . Les méthodes actuelles de nettoyage tissulaire sont classées en trois familles : (1) les méthodes à base de solvants organiques telles que les protocoles DISCO 25,26, (2) les méthodes à base d’hydrogel, telles que CLARITY27, et les méthodes aqueuses, telles que CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Les protocoles CUBIC maintiennent la forme des organes et l’intégrité des tissus, préservant la fluorescence des protéines rapporteures exprimées de manière endogène. La mise à jour la plus récente de cette technique, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), permet également la détection d’épitopes à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence et de marquage ADN28.
Dans le présent protocole, le pipeline CUBIC pour détecter T. cruzi exprimant des protéines fluorescentes dans des tissus de souris intacts clarifiés a été utilisé. Des tissus optiquement transparents ont été imagés LSFM, reconstruits en 3D et le nombre total précis de cellules infectées par T. cruzi , d’amastigotes dormants et de cellules T par organe a été automatiquement quantifié. En outre, ce protocole a été adopté avec succès pour obtenir un marquage uniforme des organes nettoyés avec des anticorps et des colorations nucléaires. Ces approches sont essentielles pour comprendre l’expansion et le contrôle de T. cruzi chez les hôtes infectés et sont utiles pour évaluer pleinement les chimiothérapies et immunothérapeutiques pour la maladie de Chagas.

<table><tbody><tr><td>1-méthylimidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone (Antipyrine</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire 6 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-souris</td><td>Fab fragment Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-lapin Fragment Fab</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>nanocorps anti-GFP Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alpha ;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C+A2 :A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Nom commun : Ai14 , Ai14D ou Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>souris The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Nom commun : Ai14 , Ai14D ou Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 Iodure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #032080</td><td>Commun Nom : Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes nettoyantes Kimwipes</td><td>&nbsp ; Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit d’immunomarquage 3D</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit de coloration nucléaire 3D</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Superglue en gel à base de cyanoacrylate</td><td>Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7) ; 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-iodure de tétraméthylindotricarbocyanine) Société : Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>Éthylène diamine acide tétraacétique (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes à centrifuger 15 mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Falcon Centrifuge tubes 50 mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>#H3884 ou #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris File Converter x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Imaris</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImSpector</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d’injection intraveineuse 23-G</td><td>Sartori, Minisart Filtre seringue</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>Lingettes non pelucheuses</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent à feuille de lumière</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Système d’imagerie ULtramicroscope II Méthanol</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de micropipette, 10 & micro ; L, 200 et micro ; L et 1 000 & micro ; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y et T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Distributeur de pipettes motorisé</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Solution de montage</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-butyldiéthanolamine</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-méthylnicotinamide</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Tache nucléaire rouge lointain</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Système de perfusion Sacrifice</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>Costar Sterile</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à agitation</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000 Carbonate de</td><td></td></tr><tr><td>sodium (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Teinture d’acide nucléique vert</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie 3d quantitative de cellules infectées par trypanosoma cruzi, d’amastigotes dormants et de cellules t dans des organes clarifiés intacts

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

La maladie de Chagas est une pathologie négligée qui touche des millions de personnes dans le monde, principalement en Amérique latine. L’agent de la maladie de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), est un parasite intracellulaire obligatoire avec une biologie diversifiée qui infecte plusieurs espèces de mammifères, y compris les humains, provoquant des pathologies cardiaques et digestives. Une détection fiable des infections in vivo à T. cruzi est nécessaire depuis longtemps pour comprendre la biologie complexe de la maladie de Chagas et évaluer avec précision les résultats des schémas thérapeutiques. Le protocole actuel démontre un pipeline intégré pour la quantification automatisée des cellules infectées par T. cruzi dans des organes reconstruits en 3D. La microscopie fluorescente à feuille de lumière permet de visualiser et de quantifier avec précision les parasites T. cruzi proliférants et dormants et les cellules effectrices immunitaires dans des organes ou des tissus entiers. En outre, le pipeline CUBIC-HistoVision pour obtenir un marquage uniforme des organes dégagés avec des anticorps et des colorations nucléaires a été adopté avec succès. Le nettoyage des tissus, associé à l’immunomarquage 3D, fournit une approche impartiale pour évaluer de manière exhaustive les protocoles de traitement médicamenteux, améliorer la compréhension de l’organisation cellulaire des tissus infectés par T. cruzi et devrait faire progresser les découvertes liées aux réponses immunitaires anti-T. cruzi , aux lésions tissulaires et à la réparation dans la maladie de Chagas.

Les tissus fixes CUBIC ont été lavés avec du PBS pour éliminer les fixateurs, puis incubés avec des cocktails CUBIC-L, une solution tamponnée de base d’alcools aminés qui extrait les pigments et les lipides du tissu, ce qui entraîne une décoloration des tissus tout en maintenant l’architecture des tissus. Les lignes de la grille dans le papier peuvent être vues à travers les tissus indiquant une clairance appropriée des organes (Figure 2A). Après délipidation, les tissus ont...

Le présent protocole décrit la microscopie fluorescente à feuille de lumière et les méthodes automatisées assistées par logiciel pour visualiser et quantifier avec précision la prolifération et la dormance des parasites Trypanosoma cruzi et des lymphocytes T dans des organes et des tissus intacts et nettoyés. Ces techniques fournissent un moyen fiable d’évaluer les résultats du traitement et offrent de nouvelles perspectives sur les interactions parasite-hôte.

Imagerie 3D quantitative de cellules infectées par Trypanosoma cruzi, d’amastigotes dormants et de cellules T dans des organes clarifiés intacts

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Cette technique a fourni une image 3D plus complète de l’ensemble des organes transparents et a été utile pour la quantification, non seulement de la réplication, mais aussi des cellules parasites dormantes et du facteur immunitaire. Cette technique nous permet de déterminer l’association particulière des parasites, des cellules immunitaires et des lésions tissulaires résultant de l’infection. L’immunomarquage des épitopes et le marquage de l’ADN étaient également comparables à cette technique.Ce protocole a été utilisé efficacement pour évaluer les résultats du traitement dans des modèles murins de la maladie de Chagas. Un traitement à doses individuelles plus élevées, administrées moins fréquemment sur une période de traitement prolongée, élimine à la fois les parasites réplicatifs et dormants. Caleb Hawkins, un technicien de recherche du laboratoire de Rick Tarleton, fera la démonstration de la procédure.Après euthanasie, dissection et fixation des organes d’une souris infectée comme décrit dans le manuscrit, plongez les organes individuels dans 10 millilitres de CUBIC-L dilué à 50%, en agitant doucement à température ambiante dans des tubes coniques de 50 millilitres pendant la nuit à l’abri de la lumière. Le lendemain, remplacez 50% CUBIC-L par 10 millilitres de 100% CUBIC-L et incuber pendant six jours à 37 degrés Celsius, tout en gardant le tube à plat sur l’incubateur vibreur. À la fin de cette période d’incubation, les tissus devraient être presque complètement transparents.Lavez les organes transparents deux fois avec du PBS pendant deux heures à 37 degrés Celsius, en secouant doucement. À chaque lavage, transférez les tissus dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour retirer le Triton X-100. Pour la coloration de l’ADN, diluer le colorant d’acide nucléique disponible dans le commerce dans cinq millilitres de tampon de coloration à 1:2, 500.Ensuite, immergez le tissu dans un tube conique de 15 millilitres contenant une solution de colorant nucléaire et incuber à 37 degrés Celsius, avec une rotation douce pendant cinq jours en position debout. Lavez le mouchoir trois fois avec 15 millilitres de tampon de lavage anticoloration nucléaire 3D pendant deux heures à température ambiante, en secouant doucement. Calculez la quantité requise d’anticorps primaires et secondaires.Mélanger les anticorps primaires et secondaires dans un tube ambré de deux millilitres et incuber à 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Pour l’échange de tampon, mélanger 7,5 millilitres de tampon d’immunomarquage 3D HV1 avec 7,5 millilitres d’eau bidistillée. Immerger l’échantillon de tissu dans le tampon et incuber pendant 1,5 heure à 32 degrés Celsius, en agitant doucement dans un tube conique de 15 millilitres en position horizontale.Prélever l’échantillon de tissu dans le milieu d’échange tampon et l’immerger dans la solution de coloration des anticorps. Incuber les tissus individuellement pendant une semaine à 32 degrés Celsius, en secouant doucement les tubes en position debout loin de la lumière. Déplacez les échantillons de tissus à quatre degrés Celsius et incuber en position debout.Après avoir refroidi le tampon d’immunomarquage 3D HV1 à quatre degrés Celsius, laver l’échantillon avec 15 millilitres de tampon deux fois à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes, chacun en secouant doucement en position horizontale. Diluer le formol à 1% dans le tampon de lavage immunostatique HV1 3D et immerger l’échantillon dans huit millilitres de la solution pendant 24 heures à quatre degrés Celsius, en agitant doucement. Maintenant, incuber l’échantillon dans une solution fraîche de formol à 1% pendant une heure à 37 degrés Celsius et laver dans 15 millilitres de PBS pendant deux heures à 25 degrés Celsius.Immerger les organes transparents dans un tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de solution CUBIC-R+ diluée à 50% d’eau à température ambiante, en agitant doucement. Remplacez-le par cinq millilitres 100% CUBIC-R+ et incuber en secouant doucement pendant deux jours. Sécher les tissus à l’aide de Kimwipes, puis transférez-les dans cinq millilitres de solution de montage dans une plaque de culture à six puits et incuberez-les à température ambiante.Collez les tissus au porte-échantillon du microscope à l’aide de gel super glue. Plongez les échantillons dans la cuvette de quartz au microscope remplie de 120 millilitres de solution de montage. Imagez-les transversalement à leur axe longitudinal et adhérez au cœur, avec l’apex et l’aorte alignés horizontalement.Le cœur infecté par Trypanosoma cruzi reconstruit en 3D présentait une proportion plus élevée de cellules infectées dans l’oreillette que les ventricules. Les parasites dormants peuvent être identifiés dans le cœur, comme illustré dans les encarts agrandis en 3D. Des lymphocytes T exprimant ZsGreen1, ainsi que des cellules infectées par Trypanosoma cruzi, ont été visualisés dans le muscle squelettique d’une souris rapporteur CD8 infectée par Trypanosoma cruzi.Les zooms 3D d’une image reconstruite en 3D ont permis d’identifier des lymphocytes T dans la région d’une cellule infectée. L’interface des lymphocytes T dans les cellules infectées par l’hôte a été visualisée par microscopie confocale. Au cœur d’une souris immunodéficiente, des cellules hôtes infectées par deux souches différentes de Trypanosoma cruzi ont été détectées, et le découpage à travers les tissus a montré des cellules infectées par des parasites abondants dans les oreillettes cardiaques à différentes profondeurs tissulaires.L’immunodétection du système vasculaire dans le cœur infecté et dégagé par Trypanosoma cruzi révèle le système vasculaire complexe du cœur. Des cellules infectées par des parasites ont pu être observées dans les oreillettes cardiaques. La coloration nucléaire du muscle squelettique a montré une accumulation de noyaux dans les zones où il y avait peu ou des parasites tdTomato indétectables.La stimulation des marqueurs de la tomate et de la GFP avec des anticorps contre la RFP et la GFP, et l’ensemble du muscle squelettique dégagé a entraîné une forte fluorescence. Les points critiques sont donc le temps d’incubation dans le tampon CUBIC, le temps de dilution et d’incubation dans le colorant ADN, le temps d’incubation dans les anticorps et le temps d’incubation dans la solution d’appariement d’indice réfracté. L’utilisation de colorations supplémentaires, avec un colorant d’anticorps spécifiques et une réaction rapide, pourrait augmenter considérablement le potentiel de cette technique, permettant la détection de plusieurs cellules, processus et structures dans des organes intacts.Nous avons maintenant une façon meilleure et plus complète d’explorer les cellules immunitaires responsables de tuer les parasites, les tissus où les parasites persistent de manière chronique et la distribution des médicaments spécifiques dans les tissus.

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