Fabrication de volets vasculaires artificiels à l’aide de technologies d’impression 3D

Notre protocole permet aux chercheurs de générer des réseaux de vaisseaux hiérarchiques au sein d’un lambeau entièrement conçu et implantable, ce qui a ouvert la voie à de nouvelles études sur le comportement des vaisseaux sanguins sous intégration in vivo. Cette technique combinait la polyvalence de deux technologies d’impression 3D pour créer et assembler des vaisseaux à l’échelle micro et méso qui peuvent être directement anastomisés avec des vaisseaux hôtes en microchirurgie. Les lambeaux vascularisés entièrement conçus peuvent être utilisés pour traiter les gros défauts tissulaires ainsi que pour fournir une plate-forme pour étudier le développement et l’intégration des tissus.

Les méthodes proposées peuvent être étendues pour étudier l’incorporation de cellules spécifiques aux tissus, ainsi que pour évaluer l’utilisation de différents matériaux de bioencre et de support. Commencez par remplir le moule BVOH avec 30 microlitres de la solution de polymère. Centrifugez le moule à 100 fois g pendant 2 minutes et complétez le moule avec 20 microlitres supplémentaires de la solution de polymère pour assurer un remplissage complet.

Congelez les moules remplis à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour vous assurer que toute la solution de polymère gèle. Retirez le solvant des moules en les lyophilisant pendant la nuit. Pour enlever le matériau de moule sacrificiel, transférez les moules après le processus de lyophilisation dans un bain-marie désionisé de 5 litres sous une agitation douce.

Remplacez l’eau dans le bain lorsqu’il fait nuageux. Lorsque tout le BVOH se dissout, séchez les échafaudages à l’air libre et stockez-les dans une chambre à vide jusqu’à utilisation. Transférer environ 4 millilitres du matériau de support préparé et compacté dans chaque puits d’une plaque de 12 puits à l’aide d’une pipette volumétrique.

Tapotez la plaque du puits sur une surface dure pour forcer le matériau de support à se répandre uniformément dans le puits. Préparer une suspension contenant 2 millions de HAMEC-ZsGreen et 6 millions de cellules souches de pulpe dentaire dans 10 millilitres de milieu cellulaire endothélial. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 fois g pendant 4 minutes pour obtenir une pastille cellulaire, puis aspirer le milieu surnageant et remettre la pastille cellulaire dans 1 millilitre de bioencre rhCollMA pour obtenir une bioencre avec une concentration cellulaire totale de 8 millions de cellules pour 1 millilitre de bioencre.

Placez une aiguille de 0,22 millimètre de diamètre interne sur une cartouche d’impression orange de 3 millilitres et placez la cartouche dans un tube conique de 50 millilitres. Transférer 1 millilitre du mélange cellules-bioencre dans la cartouche d’impression en la remplissant par le haut à l’aide d’une pipette à déplacement positif pour réduire les bulles. Installez la cartouche d’impression dans l’outil approprié au niveau de la bioimprimante.

Esquissez un motif 2D d’un carré de 4 millimètres contenant un canal circulaire de 2 millimètres de diamètre en son centre. Extruder l’esquisse de 4 millimètres pour obtenir un cube de 4 millimètres avec un canal central. Exportez cet objet en tant que fichier STL.

Importez un modèle STL de plaque à 12 puits dans l’onglet de modélisation solide du logiciel de découpage de la bioimprimante et placez-le dans la zone désignée du lit d’impression virtuel. Importez le fichier STL de la forme du cube dans l’onglet de modélisation solide du logiciel de découpage de la bioimprimante. Cochez la case Utiliser le segment externe, puis configurez le segment sous la section des propriétés de l’objet.

Dans la fenêtre contextuelle, choisissez un motif rectiligne pour le motif de remplissage et tapez 30% dans la densité de remplissage, cliquez sur Accepter. Cliquez sur le cube et déplacez-le à l’aide de la souris pour placer une copie de la forme du cube dans chaque puits virtuel souhaité. Cliquez sur le bouton Ajouter un matériau dans l’onglet Matériaux du logiciel de tranchage de la bioimprimante pour créer de nouveaux paramètres de matériau pour rhCollMA bioink.

Choisissez les paramètres de matériau pour l’impression. Pour la pression, type 2 psi, et pour la vitesse type 20 millimètres par seconde dans les cases correspondantes. Affectez les valeurs de largeur de ligne et de hauteur de ligne à 0,24 millimètre et la valeur d’accélération à 400 millimètres par seconde carrée.

Dans l’onglet Modélisation solide, cliquez sur l’objet cube, puis cliquez sur le matériau rhCollMA dans la section matériau pour l’affecter à la forme du cube. Dans l’onglet bioassemblage, cliquez sur le bouton Envoyer le travail d’impression pour envoyer le travail d’impression à la bioimprimante. Chargez la cartouche d’impression chargée avec la bioencre cellulaire dans l’outil de distribution pneumatique ambiante de 3 millilitres de la bioimprimante à base d’extrusion 3D.

Cliquez sur le bouton Refroidir sous l’onglet Contrôler le chauffage ou le refroidissement sur l’écran de l’interface de la bioimprimante pour régler la température du lit d’impression à 4 degrés Celsius. Chargez la plaque avec le bain de support sur le lit de l’imprimante. Dans l’onglet Imprimer de l’écran de l’interface de la bioimprimante, cliquez sur le travail d’impression, puis cliquez sur Démarrer, puis sur GO pour commencer le travail d’impression.

Après l’impression, exposez la plaque du puits à une source lumineuse de 405 nanomètres avec une intensité de 3 milliwatts par centimètre carré pendant 30 secondes pour initier la réticulation de la bioencre rhCollMA. Après la réticulation, incuber la plaque du puits à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes jusqu’à ce que tout le bain de support fonde. Aspirer doucement le bain de soutien liquéfié et le remplacer par le milieu cellulaire endothélial.

Incuber les constructions à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Immédiatement après le retrait du matériau de support du réseau microvasculaire bioimprimé, placez un échafaudage vasculaire PLLA:PLGA recouvert de fibronectine à côté de la structure bioimprimée. Insérez l’échafaudage vasculaire dans le canal principal de la structure bioimprimée.

Incuber les constructions assemblées à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux jours. Préparer une suspension cellulaire de cellules endothéliales microvasculaires humaines exprimant tdTomato à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre. Placez une gouttelette de 20 microlitres de cette suspension cellulaire sur une surface hydrophobe.

Placez doucement les échafaudages vasculaires sur le dessus de la gouttelette de manière à ce que la lumière de l’échafaudage à une extrémité entre en contact avec la gouttelette cellulaire. Aspirer la gouttelette de l’extrémité opposée de l’échafaudage en remplissant sa lumière avec la suspension cellulaire. Placez l’échafaudage assis dans un tube de microcentrifugation et placez-le dans un rotateur à l’intérieur d’un incubateur humidifié pendant 60 minutes.

Enfin, transférez l’échafaudage dans une plaque de 12 puits et ajoutez 2 millilitres de milieu cellulaire endothélial. La vue latérale d’un volet d’ingénierie représentatif imagé quatre jours après la muqueuse endothéliale de l’échafaudage vasculaire est montrée ici. La microvascularisation bio-imprimée est représentée en vert, tandis que la muqueuse endothéliale est représentée en rouge.

L’image représentative montre les anastomoses entre le système vasculaire bioimprimé et la muqueuse endothéliale. L’immunocoloration de l’actine, des noyaux et des cellules endothéliales du muscle lisse après sept jours d’incubation est montrée ici. L’image représentative montre des anastomoses terminées du volet artificiel avec l’artère fémorale d’un rat avant le retrait de la pince et après le retrait de la pince.

Cette technique peut être utilisée pour étudier la maturation et l’intégration de la vascularisation imprimée en 3D in vivo et surveiller la perfusion de l’implant dans le membre postérieur afin d’établir le potentiel et la sécurité de son utilisation pour traiter les défauts tissulaires.