Name: Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Découvrez une méthode validée pour la livraison intracérébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l'intestin chez des souris en mouvement libre. Cette technique précise permet d'étudier les interactions de l'axe intestin-cerveau.

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Nous remercions le personnel du Centre des animaux de laboratoire de l’Université nationale Cheng Kung (NCKU) pour avoir pris soin des animaux. Ce travail a été soutenu par la bourse du Fonds d’éducation du professeur Kun-Yen Huang de la Fondation médicale CHENG-HSING à C.-W.L.; les fonds du Ministère de la science et de la technologie (MOST) à Taïwan : (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) à T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) à W.-L.W.; et le projet de germination de l’enseignement supérieur, du Ministère de l’éducation au siège de l’avancement universitaire à NCKU à W.-L.W.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.

Les métabolites dérivés de l’intestin ont été associés à des maladies à médiation cérébrale sans mécanisme très précis, en partie à cause de leurs multiples sites de liaison dans le corps 6,12,24. Des rapports antérieurs indiquaient que les AGCC pouvaient servir de ligands pour les récepteurs couplés aux protéines G, les régulateurs épigénétiques et les sources de production d’énergie à plusieurs endroits dans le corps<sup class...

Le tractus gastro-intestinal humain abrite divers micro-organismes ayant un impact sur l’hôte 1,2,3. Ces bactéries intestinales peuvent sécréter des métabolites dérivés de l’intestin lors de leur utilisation des composants alimentaires consommés par l’hôte 4,5. Fait intéressant, les métabolites intestinaux non métabolisés à la périphérie peuvent être transportés vers d’autres organes par la circulation6. Il convient de noter que ces métabolites sécrétés peuvent servir de médiateurs pour l’axe intestin-cerveau, défini comme la communication bidirectionnelle entre le système nerveux central et l’intestin7. Des études antérieures ont montré que les métabolites dérivés de l’intestin peuvent moduler le comportement complexe et les émotions chez les animaux 8,9,10,11.
Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites produits par le microbiote intestinal lors de la fermentation des fibres alimentaires et des glucides non digestibles6. L’acétate, le propionate et le butyrate sont les AGCC les plus abondants dans l’intestin12. Les AGCC servent de source d’énergie pour les cellules du tractus gastro-intestinal. Les AGCC non métabolisés dans l’intestin peuvent être transportés vers le cerveau par la veine porte, modulant ainsi le cerveau et le comportement 6,12. Des études antérieures ont suggéré que les AGCC pourraient jouer un rôle essentiel dans les troubles neuropsychiatriques 6,12. Par exemple, l’injection intrapéritonéale de butyrate chez des souris BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modèle animal de trouble du spectre autistique (TSA), a sauvé leurs déficits sociaux13. Les rats traités aux antibiotiques recevant le microbiote de sujets dépressifs ont montré une augmentation des comportements anxieux et des AGCC fécaux14. Sur le plan clinique, des altérations des taux d’AGCC fécaux ont été observées chez les personnes atteintes de TSA par rapport aux témoins en développement typique15,16. Les personnes souffrant de dépression ont des taux d’AGCC fécaux inférieurs à ceux des sujets sains17,18. Ces études suggèrent que les AGCC peuvent modifier le comportement des animaux et des humains par diverses voies.
Les métabolites microbiens exercent divers effets sur de multiples sites dans le corps, affectant la physiologie et les comportements de l’hôte 4,19, y compris le tractus gastro-intestinal, le nerf vague et le nerf sympathique. Il est difficile de déterminer le rôle précis des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau lors de l’administration des métabolites par des voies périphériques. Cet article présente un protocole vidéo pour étudier les effets des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau d’une souris en mouvement libre (Figure 1). Nous avons montré que les AGCC pouvaient être administrés de manière aiguë par la canule guide pendant les tests comportementaux. Le type, le volume et le débit de perfusion des métabolites peuvent être modifiés en fonction de l’objectif. Le site de canulation peut être ajusté pour explorer l’impact des métabolites intestinaux dans une région spécifique du cerveau. Notre objectif est de fournir aux scientifiques une méthode pour explorer l’impact potentiel des métabolites microbiens dérivés de l’intestin sur le cerveau et le comportement.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofène A2 :D41</td><td>Pfizer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-lapin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)</td><td>Millipore</td><td>AB153-I</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à vide pour flacon, 500 mL, 0.22 &mu ; m, PES, Stérile</td><td>NEST</td><td>121921LA01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>ACSF : 0,14 g/L</td></tr><tr><td>Gommage à la chlorhexidine 2 %</td> <td>Phoenix</td><td>NDC 57319-611-09</td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorhexidine</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-599-09</td><td></td></tr><tr><td>Mannequin professionnel</td><td>RWD Life Science</td><td>62004</td><td>Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm</td></tr><tr><td>Canule de guidage commerciale</td><td>RWD Life Science</td><td>62104</td><td>Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Injecteur professionnel</td><td>RWD Life Science</td><td>62204</td><td>Single_OD 0,21 mm-33G/ S’accouple avec M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>ACSF : 0,61 g/L</td></tr><tr><td>Acrylique dentaire</td><td>HYGENIC</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vis de fixation</td><td>RWD Life Science</td><td>62521</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Fluoroshield avec DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Seringues à insuline</td><td>BBraun</td><td>XG-LBB-9151133S-1BX</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp ;</td><td>Panion & BF biotech</td><td>DG-4900-250D</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>ACSF : 0,19 g/L</td></tr> de <tr><td>kétoprofène&nbsp ;</td><td>Swiss Pharmaceutical</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaïne&nbsp ;</td><td>AstraZeneca</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>ACSF : 0.19 g/L</td></tr><tr><td>Lamelles de microscope</td><td>MARIENFELD</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4951PLUS-001E</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale légère, blanche NF</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MA-6358-04</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>ACSF : 7,46 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>ACSF : 0,18 g/L</td></tr><tr><td>de NaHCO3 ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>ACSF : 1,76 g/L</td></tr><tr><td>d’adhésif cyanoacrylate n-butyle (colle pour tissus)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>3M Vetbond</td></tr><tr><td>Neural tracer&nbsp ;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-358883</td><td>FluoroGold</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène</td><td>RWD Life Science</td><td>62329</td><td>OD 1.50, I.D 0.50 mm et OD 1.09, I.D 0.38 mm</td></tr><tr><td>Puralube Vet (œil) Pommade Dechra</td><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td>12920060</tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>AGCC Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>: 13,5 mM</td></tr><tr><td>d’azoture de sodium.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Butyrate de sodium&nbsp ;</td><td>AGCC Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>: 8 mM</td></tr><tr><td>de propionate de sodium.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1880</td><td>SCFAs : 5.18 mM</td></tr><tr><td>Canule de guidage en acier inoxydable</td><td>Chun Ta entreprise en acier inoxydable CO., LTD.</td><td>n/a</td><td>Diamètre extérieur 0,63 mm ; Fournisseur local</td></tr><tr><td>Injecteur en acier inoxydable</td><td>Chun Ta entreprise en acier inoxydable CO., LTD.</td><td>n/a</td><td>OD 0,3 mm ; le mannequin est fabriqué à partir d’un injecteur ; vendeur local</td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td>KG94548R</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Support de canule</td><td>RWD Life Science</td><td>B485-68217</td><td></td></tr><tr><td>Caméra de plafond</td><td>FOSCAM</td><td>R2</td><td></td></tr><tr><td>Instruments stéréotaxiques numériques</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>INNOVIEW</td><td>SEM-HT/TW</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur à billes de verre</td><td>RWD Life Science</td><td>RS1501</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Stoelting</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Leica&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>Micro pince à dissection</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5136</td><td>dentelée, légère courbure ; Extra délicat ; Largeur de pointe de 0,5 mm ; Longueur de 4 po&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micro Ciseaux de dissection</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5918</td><td>4.5" Angled Sharp</td></tr><tr><td>Contrôleur de micro-injection</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>MICRO2T</td><td>SMARTouch Controller</td></tr><tr><td>Pompe à seringue de micro-injection</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>UMP3T-1</td><td>UltraMicroPump3&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Seringue d’un microlitre</td><td>Hamilton</td><td>80014</td><td>10 & micro ; L</td></tr><tr><td>Fibre optique Lumière froide avec double étape de fibre</td><td></td><td>LGY-150</td><td>Fournisseur local</td></tr><tr><td>Tondeuse pour animaux de compagnie</td><td>WAHL</td><td>09962-2018</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur pour Isoflurane</td><td>Étape</td><td>AS-01</td><td>Vendeur local</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal behavior video logiciel de suivi</td><td>Noldus</td><td>EthoVision</td><td>Version : 15.0.1416</td></tr><tr><td>Logiciel Leica Application Suite X</td><td>Leica</td><td>LASX</td><td>Version : 3.7.2.22383</td></tr></tbody></table>

livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

L’impact du microbiote intestinal et de ses métabolites sur la physiologie et le comportement de l’hôte a été largement étudié au cours de cette décennie. De nombreuses études ont révélé que les métabolites dérivés du microbiote intestinal modulent les fonctions physiologiques à médiation cérébrale par des voies complexes intestin-cerveau chez l’hôte. Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites dérivés de bactéries produits lors de la fermentation des fibres alimentaires par le microbiome intestinal. Les AGCC sécrétés par l’intestin peuvent agir sur plusieurs sites à la périphérie, affectant les réponses immunitaires, endocriniennes et neuronales en raison de la vaste distribution des récepteurs des AGCC. Par conséquent, il est difficile de différencier les effets centraux et périphériques des AGCC par administration orale et intrapéritonéale d’AGCC. Cet article présente une méthode vidéo pour interroger le rôle fonctionnel des AGCC dans le cerveau via une canule guide chez des souris en mouvement libre. La quantité et le type d’AGCC dans le cerveau peuvent être ajustés en contrôlant le volume et le débit de perfusion. Cette méthode peut fournir aux scientifiques un moyen d’apprécier le rôle des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau.

La souris a reçu des AGCC 1 semaine après la récupération de l’implantation de la canule guide pour évaluer l’activité locomotrice dans une nouvelle cage. La souris a été placée dans une nouvelle cage et perfusée avec 2 100 nL d’AGCC ou d’ACSF dans les 5 premières minutes (taux d’administration de 7 nL/s) dans le cerveau par la canule guide commerciale implantée dans le ventricule latéral du cerveau. L’activité locomotrice dans une nouvelle cage a été enregistrée pendant 30 minutes supplémentaires après la perfusion. Auc...

Les métabolites microbiens dérivés de l’intestin ont des effets multiformes conduisant à un comportement complexe chez les animaux. Notre objectif est de fournir une méthode étape par étape pour délimiter les effets des métabolites microbiens dérivés de l’intestin dans le cerveau via une administration intrarébroventriculaire via une canule guide.

Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre

The impact of gut microbiota and their metabolites on host physiology and behavior has been extensively investigated in this decade. Numerous studies have ...

Les métabolites libérés par le microbiote intestinal produisent des effets complexes sur l’hôte. Ce protocole présente une méthode pour interroger le rôle des métabolites intestinaux dans le cerveau et le comportement de la souris. Cette technique fournit une méthode précise, méticuleuse et validée pour délivrer des métabolites intestinaux dans un cerveau chez des souris en mouvement libre.Nous fournissons une méthodologie complète et physiologique meilleure pour mieux comprendre la recherche sur l’axe intestin-cerveau. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique et fixez les incisives de la souris sur la barre d’incisives dans le support d’incisive stéréotaxique. Couvrez le nez avec le masque à cône nasal.Évaluez ensuite la nociception de la souris via le réflexe de pincement supérieur, et assurez-vous d’un rythme respiratoire constant avant d’inciser le site chirurgical. Une fois la fourrure coupée sur la tête enlevée par le ruban adhésif, injectez par voie sous-cutanée l’analgésique kétoprofène pour soulager la douleur et appliquez une pommade pour les yeux. Ensuite, fixez la tête en insérant la barre d’oreille pointue dans le conduit auditif.Serrez la pince nasale sur le porte-incisive et appuyez doucement sur la tête pour vous assurer que la tête est fixée. Utilisez 3 gommages alternés d’écouvillon de chlorhexidine pour désinfecter le cuir chevelu. Maintenant, utilisez le scalpel disséquant pour faire une incision de moins d’un centimètre dans le cuir chevelu de manière postérieure antérieure.Après avoir ouvert l’incision, essuyez le crâne avec un coton-tige tenu par une pince à microdissection. Sur la base des coordonnées stéréotaxiques, identifier et étiqueter la position du ventricule latéral droit telle que décrite dans le manuscrit. Ensuite, percez un trou dans le crâne sur le site étiqueté à l’aide d’une perceuse stéréotaxique, puis percez deux à quatre trous supplémentaires dans le crâne.Essuyez le crâne avec un coton-tige en lidocaïne et montez 2 à 4 vis en acier inoxydable sur les trous. Placez la canule de guidage commercial sur le support de canule stéréotaxique et désinfectez avec le stérilisateur à vitesse de verre à 150 degrés Celsius. Ensuite, déplacez le porte-canule stéréotaxique vers le trou percé pour le ventricule latéral et insérez lentement la canule de guidage commerciale dans le trou jusqu’à ce que la profondeur souhaitée soit atteinte.Appliquez maintenant 10 microlitres d’adhésif cyanoacrylate de n-butyle pour fixer la canule de guidage commerciale dans le trou percé et attendez 3 à 4 minutes. Libérez doucement la canule de guidage commercial du porte-canule stéréotaxique et appliquez de l’acrylique dentaire sur le cuir chevelu incisé pour fixer la canule de guidage commercial et attendez au moins 5 minutes. Implantez le mannequin commercial dans la canule de guidage commercial.Ensuite, placez la souris dans une nouvelle cage avec un coussin chauffant en dessous pour récupérer de l’anesthésie et observez continuellement jusqu’à ce que la souris se réveille complètement. Montez la seringue de microlitre, contenant 10 microlitres d’eau distillée, sur la pompe de micro-injection. À l’aide d’une seringue à insuline, remplissez le tube en polyéthylène avec de l’eau distillée et connectez la seringue de microlitre au tube en polyéthylène suspendu.Allumez le contrôleur de micro-injection et appuyez sur Afficher tous les canaux pour accéder à l’écran de commande. Ensuite, appuyez sur configuration et définissez l’objectif de volume sur 9 800 nanolitres avec un débit de 100 nanolitres par seconde. Appuyez ensuite sur la direction pour passer en mode d’infusion et appuyez sur Run pour infuser 9 800 nanolitres d’eau distillée à partir du tube en polyéthylène connecté à la seringue de microlitre.Maintenant, placez l’injecteur dans un flacon contenant l’huile minérale, appuyez sur la configuration et réglez l’objectif de volume à 3 000 nanolitres avec un débit de 100 nanolitres par seconde. Pour retirer 3 000 nanolitres d’huile minérale, appuyez sur la direction pour passer en mode de retrait, puis appuyez sur run. Démontez le tube en polyéthylène de l’aiguille de la seringue de microlitre.Pour cracher 3 000 nanolitres d’eau distillée de l’aiguille de la seringue de microlitre, appuyez sur la direction pour passer en mode d’infusion et appuyez sur l’exécution. Réinsérez ensuite la seringue de microlitre dans le tube en polyéthylène. Placez l’injecteur dans un flacon contenant des AGCC.Appuyez sur la configuration et définissez l’objectif de volume à 9 500 nanolitres avec un débit de 100 nanolitres par seconde. Retirez 9 500 nanolitres d’AGCC en appuyant sur la direction pour passer en mode de retrait et appuyez sur Run. Étiqueter la phase d’AGCC d’huile pour valider si les AGCC sont perfusés avec succès.Appuyez sur la configuration et définissez l’objectif de volume souhaité avec un débit de 7 nanolitres par seconde. Appuyez sur la direction pour passer en mode infuse. Appuyez sur la pression pour infuser la seringue de microlitre vers l’avant jusqu’à ce que le liquide sorte à l’extrémité avant de l’injecteur commercial avant d’insérer l’injecteur dans la canule pour l’injection d’AGCC.Après avoir anesthésié la souris, insérez l’injecteur commercial dans la canule de guidage commercial. Une fois que la souris est récupérée de l’anesthésie, placez-la dans une nouvelle cage et laissez-la explorer pendant 35 minutes librement. Infuser les AGCC en utilisant un débit de 7 nanolitres par seconde pour un volume cible de 2 100 nanolitres dans les 5 premières minutes.Appuyez ensuite sur direction en mode infuse et appuyez sur exécuter. Après les tests comportementaux, retirez l’injecteur commercial de la canule de guidage commercial. Infuser 2 100 nanolitres du traceur neutre avec un débit de 7 nanolitres par seconde pour vérifier le site de perfusion.Imagez le signal fluorescent dans le site de perfusion à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les souris infusées d’ACSF et d’AGCC ont voyagé dans une nouvelle cage pendant un total de 35 minutes. Aucune différence n’a été observée dans l’activité locomotrice dans la nouvelle cage entre la perfusion d’AGCC et l’ACSF.Le colorant fluorescent a été détecté dans le ventricule latéral et les régions environnantes du cerveau de la souris lorsqu’il a été perfusé avec une canule guide commerciale. De même, la perfusion à travers la canule guide en acier inoxydable conduit à la détection de signaux dans le ventricule latéral et les régions environnantes du cerveau de la souris. La combinaison de cette procédure avec des technologies neuronales basées sur des circuits permettra aux scientifiques de mieux comprendre le contrôle du cerveau basé sur les circuits et le comportement apporté par les métabolites intestinaux.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer le rôle du microbiote et des métabolites dans l’axe complexe du cerveau intestinal.

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Découvrez une méthode validée pour la livraison intracérébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l'intestin chez des souris en mouvement libre. Cette technique précise permet d'étudier les interactions de l'axe intestin-cerveau.

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