Name: Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez le traçage de lignée cellulaire par fluorescence dans le cerveau de souris adulte. Cette méthode permet d'analyser l'activation, la prolifération et la migration des cellules souches in vivo.

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<p class="jove_content">Les auteurs tiennent à remercier la Dre Diana Carlone (Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) et le Dr Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) pour des conseils utilisant des animaux mTert-rtTA.</p>

<p class="jove_content">Les auteurs n’ont rien à divulguer.</p>

<p class="jove_content">Une méthode pour la création, l’utilisation et l’analyse d’une triple lignée transgénique traçant la lignée de souris marquant les cellules souches dans le cerveau de la souris adulte <em>in vivo</em> est décrite. Lorsqu’il est combiné avec l’immunocoloration ou la clairance cérébrale, l’identification et la caractérisation des cellules fluorescentes tracées à travers le cerveau peuvent être réalisées. Cette technique offre la capacité de comprendre le potentiel plastique/régénératif/remodelant des cellules souches marqu...

<table><tbody><tr><td>Diluant d’anticorps</td><td>Agilent</td><td>S080983-2</td><td></td></tr><tr><td>Solution de récupération d’antigène</td><td>Agilent</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A2311</td><td>Utilisation à 1:500-1:000</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td><td>Le Laboratoire Jackson</td><td>JAX :006234</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>Le Laboratoire Jackson</td><td>JAX :007676</td><td></td></tr><tr><td>Solution de blocage (IHC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille émoussée</td><td>BSTEAN</td><td>X0012SYHIV</td><td></td></tr><tr><td>Bloc cérébral coronal</td><td>Braintree</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Housse</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D564</td><td></td></tr><tr><td>Éther dibenzylique</td><td>Millipore Sigma</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl Sulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline Hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Héparine Sel de sodium de la muqueuse porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Biologie moléculaire Fixateur tissulaire</td><td>Amresco</td><td>H120</td><td>Ce produit a depuis été abandonné, mais peut être remplacé par Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Westward</td><td>0143-95095-10</td><td>Ce produit nécessite une licence DEA pour le stockage et l’utilisation.</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Bloc Milipore</td><td>Millipore</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage</td><td>Millipore Sigma</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Température de coupe optimale Solution</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS Solution (10X)</td><td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>Bloc cérébral sagittal</td><td>Braintree</td><td>RBM-2000S</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td>S8004-5264</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Soudan (Typogen) Noir</td><td>Millipore Sigma</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>186562</tr><tr><td>Cartouche de tissu</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Millipore Sigma</td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td>sc-362950Rx</td><td></td></tr></tbody></table>

traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

<p class="jove_content" fo:break-after="page">Une lignée de souris traçant la transcriptase inverse de la télomérase (Tert) a été développée pour étudier le comportement et le devenir des cellules souches tissulaires adultes, en croisant le système « Tet-On » oTet-Cre souris avec un nouveau transgène de transactivateur de tétracycline inverse (rtTA) lié au promoteur Tert, dont nous avons démontré qu’il marque une nouvelle population de cellules souches cérébrales adultes. Ici, l’administration du dérivé de la tétracycline doxycycline à des souris mTert-rtTA::oTet-Cre marquera de manière indélébile une population de cellules qui expriment un fragment de 4,4 kb de la région promotrice du gène Tert. Lorsqu’elles sont combinées avec le rapporteur Rosa-mTmG, les souris mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG exprimeront le tdTomato membranaire (mTomato) jusqu’à ce que le traitement à la doxycycline induise le remplacement de l’expression de mTomato par l’EGFP membranaire (mGFP) dans les cellules qui expriment également Tert. Par conséquent, lorsque ces souris traçant la lignée triple transgénique reçoivent de la doxycycline (la période de « pouls » pendant laquelle les cellules exprimant le TERT sont marquées), ces cellules deviendront des cellules mGFP+ marquées de manière indélébile, qui peuvent être suivies pendant n’importe quelle période souhaitable après l’élimination de la doxycycline (la période de « chasse »), même si l’expression de Tert est ensuite perdue. Les cerveaux sont ensuite fixés par perfusion et traités pour l’immunofluorescence et d’autres applications en aval afin d’interpréter les changements dans l’activation des cellules souches, la prolifération, l’engagement de la lignée, la migration vers diverses niches cérébrales et la différenciation vers les types de cellules matures. Grâce à ce système, n’importe quelle souris rtTA peut être accouplée à oTet-Cre et à un rapporteur Rosa pour mener des expériences de traçage de lignée « pulse-chase » inductibles à la doxycycline à l’aide de marqueurs de cellules souches.</p>

<p class="jove_content">Bien que le signal fluorescent résultant d’un système Tet-On avec un rapporteur fluorescent varie en fonction du promoteur d’intérêt et du ou des fluorophores utilisés, nous décrirons comment les résultats ont été analysés avec les animaux mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. L’analyse des cerveaux adultes après une chasse au pouls a abouti à des cellules membranaires exprimant la GFP dans diverses niches anatomiques. La différence d’intensité fluorescente entre les différents types de cellules doit être notée. Une variable ...

<p class="jove_content">La capacité de marquer de façon permanente les cellules souches et leur descendance avec un fluorophore à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et / ou de la différenciation <em>in vivo</em>. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipotence.</p>

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

<p>Le marquage des cellules souches et de leur descendance à l’aide d’une lignée transgénique inductible traçant la lignée de souris permet une analyse spatiale et temporelle de l’activation, de la prolifération, de la migration et/ou de la différenciation des cellules souches adultes dans le cerveau in vivo. Le traçage de la lignée peut révéler de nouvelles informations sur l’engagement de la lignée, la réponse aux interventions et la multipuissance. Les avantages des approches de traçage de lignée transgénique comprennent la spécificité du traçage d’une lignée cellulaire particulière, l’expression indélébile de la protéine fluorescente indépendamment du renouvellement ou de la différenciation cellulaire, la faible toxicité de la doxycyline, l’activation conditionnelle et la facilité d’utilisation avec des tests en aval courants sur les tissus traces de lignée, y compris l’immunocoloration et l’immunofluorescence.</p><p>En raison de la vaste implication de la plasticité et des cellules dans le cerveau adulte, la caractérisation et l’analyse des cellules souches adultes aideront à informer sur l’étude des maladies neurodégénératives, des impacts métaboliques sur la plasticité cérébrale, du v</p>

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Coloration par immunofluorescence pour la visualisation de cellules souches neurales proliférées dans des sections de cerveau de souris

Source : Gómez-Villafuertes, R., et. al., imagerie en direct suivie d’un suivi de cellule unique pour surveiller la biologie cellulaire et la progression de la lignée de plusieurs populations neuronales. J. Vis. Exp. (2017) &lt;p style='line-height :1.79999999999999998 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'&gt;La vidéo démontre le processus de préparation, d’imagerie et de suivi des cellules souches neurales adultes en temps réel pour étudier les cellules souches cellulaires...

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Découvrez le traçage de lignée cellulaire par fluorescence dans le cerveau de souris adulte. Cette méthode permet d'analyser l'activation, la prolifération et la migration des cellules souches in vivo.

Traçage de la lignée des cellules souches inductibles marquées par fluorescence dans le cerveau de souris adulte

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