Name: Dosage de ladhésion et linvasion Agar chez S. cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Apprenez le dosage de l'adhésion et de l'invasion sur agar chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode qualitative permet d'évaluer les phénotypes invasifs et la différenciation pseudohyphale des levures.

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Nous tenons à remercier Lisa Schneper et Katrin Duevel pour leurs idées dans le développement de ce dosage.

<ol><li> Mettez 200ul de cultures de plus en plus d&#39;intérêt sur les plaques supports synthétiques avec les conditions de famine requis (SC avec 2% de glucose par rapport SC avec 0,2% de glucose, par exemple) Si la densité des cultures sont trop différentes les unes des autres, d&#39;ajuster le nombre de cellules par culture 200ul de sorte que chaque goutte a à peu près la même quantité de cellules. </li><li> Assurez-vous de tenir des registres de qui tombent sur les plaques est où la culture. </li><li> Gardez le couvercle de la plaque entrouverte et laisser soit à température ambiante ou à 30 ° C jusqu&#39;à ce que des gouttes sont à sec. </li><li> Sceau plaques avec du parafilm et pellicule plastique (facultatif) et laisser à 30 ° C pendant 3-7 jours. </li><li> Document de la croissance des cellules sur des plaques (par balayage, de prendre une photo numérique, etc) </li><li> Laver les cellules hors de la surface de la gélose avec de l&#39;eau à haute pression (de préférence de l&#39;eau DI) pendant environ une minute en prenant soin de ne pas lever agar et le changement d&#39;orientation. </li><li> Débarrassez-vous de l&#39;excès d&#39;eau en tapant plaques sur du papier absorbant et les laisser ouvertes pour sécher. </li><li> Une fois les plaques sont sèches documents d&#39;adhérence sur chaque assiette (par numérisation ou de prendre des photos numériques) </li><li> Cellules avec un doigt ganté, frottez doucement hors forment la surface de l&#39;agar sous l&#39;eau courante pendant environ une minute. </li><li> Sécher les plaques comme avant. </li><li> Si vous utilisez un champ de dissection, retirer l&#39;aiguille avant de placer les plaques sur la plateforme de microscopie. </li><li> L&#39;invasion de documents avec un grossissement de 10x ou 40x. Assurez-vous de se concentrer sur la partie du milieu de chaque cercle, les bords seront trop de monde pour voir les morphologies des cellules individuelles. Les bords peuvent indiquer le niveau de croissance filamenteuse et peuvent être documentées pour référence future. Numérisation ou de prendre une photo numérique de toute la plaque peut également être utile. </li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+in+the+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology+International%22%5BJournal%5D)">Biofilms in the food industry.</a> Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).</li>
<li>Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+structure+and+biomass+in+developing+drinking+water+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms.</a> Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).</li>
<li>Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biofilm+enhanced+miniature+microbial+fuel+cell+using+Shewanella+oneidensis+DSP10+and+oxygen+reduction+cathodes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes.</a> Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).</li>
<li>Kim, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+structure%2C+compartmentalization+and+activity+in+a+microbial+fuel+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell.</a> J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).</li>
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<li>Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+implications+in+bioremediation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: implications in bioremediation.</a> Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).</li>
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<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Reynolds, T. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bakers%27+yeast%2C+a+model+for+fungal+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation.</a> Science. 291, 878-881 (2001).</li>
<li>Verstrepen, K. J., Klis, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flocculation%2C+adhesion+and+biofilm+formation+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts.</a> Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).</li>
<li>Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+the+yeast+pheromone+response+pathway+required+for+filamentous+growth+of+diploids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids.</a> Science. 262, 1741-1744 (1993).</li>
<li>Madhani, H. D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+filamentous+differentiation+and+virulence+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The control of filamentous differentiation and virulence in fungi.</a> Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).</li>
<li>Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+Ras2p-controlled+mitogen-activated+protein+kinase+and+cAMP+pathways+during+invasive+growth+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).</li>
<li>Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras2+signals+via+the+Cdc42%2FSte20%2Fmitogen-activated+protein+kinase+module+to+induce+filamentous+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).</li>
<li>Pan, X., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-dependent+protein+kinase+regulates+pseudohyphal+differentiation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).</li>
<li>Roberts, R. L., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+a+single+MAP+kinase+cascade+in+Saccharomyces+cerevisiae+mediate+two+developmental+programs+in+the+same+cell+type%3A+mating+and+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth.</a> Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).</li>
<li>Robertson, L. S., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+yeast+A+kinases+have+specific+signaling+functions+in+pseudohyphal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).</li>
<li>Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mat+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+requires+nutrient+and+pH+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients.</a> Eukaryot Cell. , (2007).</li>
</ol>

Les cellules de levure modes d&#39;affichage différents de différenciation en fonction de la disponibilité des nutriments et des conditions environnementales, y compris la formation de spores dans des conditions de famine et le stress, la filamentation sous diverses contraintes en éléments nutritifs, et de floculation. Levures différentes, y compris S. cerevisiae et C. albicans, peuvent également être trouvés dans les biofilms formés par un ensemble diversifié de micro-organismes. Bien qu&#39;il y ait une certaine corrélation avec la filame...

<table><tbody><tr><td>Moticam 350</td><td>Caméra</td><td>Motic</td><td>discontinué (nouveau modèle : Moticam 352)</td><td>Une caméra relativement peu coûteuse qui se fixe aux oculaires des microscopes et permet de capturer des images numériques sur PC ou Mac.</td></tr></tbody></table>

dosage de l&#39;adhésion et l&#39;invasion agar chez s. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Les levures sont trouvés dans des biofilms naturels, où de nombreux microorganismes colonisent les surfaces. Dans les milieux artificiels, tels que les surfaces des objets artificiels, les biofilms peuvent réduire la productivité industrielle, détruire les structures, et menacent la vie humaine. 1-3 sur l&#39;autre côté, en exploitant la puissance des biofilms peuvent aider à nettoyer l&#39;environnement et générer de l&#39;énergie durable. 4-8 La capacité de S. cerevisiae à coloniser les surfaces et de participer à des biofilms complexes a été largement ignorée jusqu&#39;à ce que la redécouverte de la différenciation des programmes déclenchés par diverses voies de signalisation et les signaux environnementaux dans cet organisme. 9, 10 L&#39;intérêt continue en utilisant S. cerevisiae comme organisme modèle pour comprendre l&#39;interaction et de convergence des voies de signalisation, tels que le Ras-PKA, Kss1 MAPK et Hog1 voies osmolarité, rapidement placé S. cerevisiae dans la jonction du biofilm biologie et la recherche de transduction du signal. 11-20 à cette fin, la différenciation des cellules de levure en longues adhésif, filaments pseudohyphal est devenu une lecture commode pour l&#39;activation des voies de transduction du signal lors de différents changements de l&#39;environnement. Toutefois, la filamentation est un ensemble complexe de phénotypes, ce qui rend dosant pour elle comme si elle était un phénotype simples trompeuse. Dans la dernière décennie, plusieurs tests ont été adoptées avec succès des études de biofilm bactérien à la recherche de levures, telles que la formation des dosages MAT pour mesurer la propagation des colonies sur agar mou et coloration au cristal violet à mesurer quantitativement l&#39;adhérence à la surface cellulaire. 12, 21 Cependant, il ya eu une certaine confusion dans les analyses développées pour évaluer qualitativement les phénotypes adhésif et envahissante de la levure dans l&#39;agar. Ici, nous présentons une méthode simple et fiable pour évaluer la qualité adhésive et envahissantes de souches de levure faciles à comprendre des mesures pour isoler l&#39;évaluation de l&#39;adhérence de l&#39;évaluation d&#39;invasion. Notre méthode, adoptée par les études précédentes, 10, 16 implique des cellules en croissance dans des milieux liquides et le placage sur le traitement différencié des conditions de nutriments pour la croissance des grandes taches, que nous avons ensuite laver à l&#39;eau pour évaluer l&#39;adhérence des cellules et frottez complètement hors de la surface de la gélose pour évaluer l&#39;invasion dans l&#39;agar-agar. Nous éliminons le besoin de stries sur gélose cellules, ce qui affecte l&#39;invasion des cellules dans la gélose. En général, nous avons observé que les souches haploïdes qui envahissent agar sont toujours adhésif, mais pas toutes les souches adhésive peut envahir gélose. Notre approche peut être utilisée en conjonction avec d&#39;autres dosages soigneusement disséquer les étapes de différenciation et les exigences de la transduction du signal de la levure, la différenciation, le quorum sensing et la formation de biofilm.

Nous décrivons un test qualitatif pour l&#39;adhésion de la levure et l&#39;invasion d&#39;agar comme une mesure de la différenciation invasive et pseudohyphal. Ce test simple peut être utilisé pour évaluer le phénotype invasif de divers mutants ainsi que les indices des effets environnementaux et les voies de signalisation sur la différenciation des levures.

Dosage de l&#39;adhésion et l&#39;invasion Agar chez S. cerevisiae

Les levures sont présentes dans les biofilms naturels, où de nombreux micro-organismes colonisent les surfaces. Dans des environnements artificiels, tels que les surfaces d'objets fabriqués par l'homme, ...

Prélevez 200 microlitres de votre culture d'intérêt et fixez simplement un objectif. Je peux généralement placer jusqu'à six échantillons sur une plaque par mois si je le souhaite, puis je laisse ouvert et je laisse sécher. Et ce sont deux plaques.L'un d'entre eux présente des moisissures, mais cela ne pose pas de problème car cela n'affecte pas notre expérience. Et l'un d'eux est en milieu complet, l'autre en milieu à faible teneur en glucose. Nous allons donc examiner l'adhérence et l'invasion pour voir s'il existe une différence.Alors, retirez simplement la boîte de cette manière. Et vous pouvez voir des colonies se développer. Je vais rincer.On peut observer des bulles sous la tarière, et cela est dû au fait que de l'eau s'est infiltrée sous la tarière, ce qui est normal, mais simplement pour que la tarière ne glisse pas hors de la plaque. Je dirais donc que, même si certaines cellules se sont détachées, ces deux souches sont adhésives. Les cellules adhèrent à d'autres cellules, qui elles-mêmes adhèrent peut-être à l'agar.Sinon, un grand nombre de cellules se seraient détachées, ce qui n'a pas été le cas. Maintenant que nous avons documenté l'adhésion, nous allons documenter l'envahissement. Je vais frotter délicatement les cellules à la surface, autant qu'elles se détachent.Je n'exerce aucune pression, mais j'essaie de retirer tout ce qui peut venir de l'autre surface. Et vous verrez, vous sentirez votre doigt buter là où se trouve l'élément en question. J'essaie, j'essaie de le sécher. Peut-on voir la différence ici ?Vous ne pouvez pas, ce qui est une bonne chose car il s'agit d'une plaque complète et qu'elles ne manquent donc de rien. Et ceci est une plaque à faible teneur en glucose et elles sont en carence de glucose. Vous observez alors une différence.C'est donc un bon témoin.

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Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure pour l'expression des effecteurs bactériens de type III chez la levure et l'identification des effecteurs induits phénotypes inhibition de la croissance. Ces phénotypes peuvent ensuite être exploités pour élucider les fonctions effectrices et cibles.

Identification des phénotypes inhibition de la croissance induite par l&#39;expression de bactéries de type III Effectors dans la levure

Un protocole général pour l'étude de l'invasion des cellules hôtes par une bactérie pathogène, en se concentrant...

L&#39;invasion des cellules humaines par une bactérie pathogène

Ce protocole est un test simple adhésion bactérienne consistant à compter le nombre de colonies bactériennes formant des unités qui sont collées sur des cellules cultivées. Le test est robuste, indépendante de l'adhésine étudié, et de nombreuses variations sont utilisés dans la plupart des laboratoires travaillant sur la pathogenèse bactérienne.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

Cette vidéo illustre l’initiation de la formation de biofilms polymicrobiens sur des cellules infectées par des virus par des bactéries et des champignons. L’infection par le virus de l’herpès simplex empêche l’attachement bactérien aux cellules, empêchant la co-localisation bactérienne-fongique. En revanche, les cellules non infectées présentent une co-localisation bactérienne-fongique et l’initiation de la formation d’un biofilm.

Un test pour déterminer l’initiation d’un biofilm polymicrobien sur des cellules infectées par le virus

Nous présentons ici une méthode rentable pour définir les interactions chimico-génétiques chez les levures bourgeonnantes. L’approche s’appuie sur des techniques fondamentales de biologie moléculaire de la levure et est bien adaptée à l’interrogation mécaniste de petites et moyennes collections de produits chimiques et d’autres environnements de milieux.

Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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Criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae

Cette étude démontre l’utilité et la facilité de la mesure d’extension quantitative de membrane cellulaire et sa corrélation avec la capacité adhésive des cellules. Comme un exemple représentatif, nous montrons ici que Dickkopf-protéine 3 (DKK3) favorise la formation de lobopodia accrue et l’adhérence cellulaire dans le corticosurrénalome cellules in vitro.

Caractérisation des Extensions de la Membrane cellulaire et d’étudier leur rôle dans le Cancer Cell Adhesion dynamique

Les phénotypes de croissance de levure sont précisément mesurés par l’imagerie time-lapse très parallèle des cellules immobilisées se développent dans les microcolonies. Simultanément, la tolérance au stress, l’expression des protéines et la localisation des protéines peuvent être surveillées, générant des ensembles de données intégrés pour étudier comment les différences environnementales et génétiques, ainsi que l’hétérogénéité de l’expression génique entre les cellules isogéniques, modulent...

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Ici, nous présentons un protocole pour l’examen de l’infection orale à Candida chez les patients atteints du syndrome de Sjögren primitif, qui peut être utilisé pour un traitement rapide et, par la suite, pour éviter les complications associées.

Examen de l&#39;infection orale à Candida chez les patients atteints du syndrome de Sjögren primitif

Apprenez le dosage de l'adhésion et de l'invasion sur agar chez Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode qualitative permet d'évaluer les phénotypes invasifs et la différenciation pseudohyphale des levures.

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