Name: İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Keşfedin apikal-dış enteroid modeli kullanarak nekrotizan enterokolit için oral terapötik test yöntemlerini. Bu teknik, intestinal inflamasyonu in vitro ortamda çalışmak ve epitelyal bütünlüğü değerlendirmek için araştırmacılara önemli avantajlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. HC, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden P20GM134973 hibesi ile desteklenmektedir. KB, Çocuk Hastanesi Vakfı (CHF) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı (PHF) hibesi ile desteklenmektedir. OUHSC'deki Moleküler Biyoloji ve Sitometri Araştırmaları Laboratuvarı'na, konfokal görüntüleme sağlayan Çekirdek Tesis'in kullanımı için teşekkür ederiz.

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ayrı bir çalışma için ötenaziyi takiben preterm insan olmayan primattan (NHP,% 90 gebelik, zeytin babunu, Papio anubis) ince bağırsak kolaylık örnekleri elde edildi (Protokol # 101523-16-039-I).
1. Apikal-out enteroid NEC-in-a-dish modelinin kurulması
<ol><li>Medya ve enteroid tedavilerin hazırlanması NOT: Standart aseptik tekniğe uygun olarak hazırlandıktan sonra, ortam 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.<ol><li>50 mL insan organoid büyüme ortamını 50 mL organoid takviyesi ile karıştırarak antibiyotiksiz ortam (AFM) hazırlayın (bkz. 9.900 μL PBS'ye 100 μL 0,5 M EDTA ekleyerek 5 mM etilendiamintetraasetik asit/1x fosfat tamponlu salin (EDTA/PBS) hazırlayın.</li>
		<li>Chill Dulbecco'nun modifiye kartalın orta / besin jambonunun karışımı F12 + 15 mM HEPES Tamponu (DMEM / F12) 2-8 ° C'de.</li>
		<li>1 mL 1x PBS'de 100 μg TNF-α tozunu askıya alarak TNF α stok çözeltisi hazırlayın. TNF-α stokunu çözücü olarak AFM kullanarak 20 ng / mL ve 50 ng / mL konsantrasyonlarına kadar seyreltin. 1 mL 1x PBS'de 2 mg LPS'yi askıya alarak LPS stok çözeltisi hazırlayın. Çözücü olarak AFM kullanarak stok LPS'yi 100 μg / mL ve 200 μg / mL'ye kadar seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>3D enteroidlerin polaritesini tersine çevirme NOT: Aşağıdaki prosedür, tek bir 24 delikli düz tabanlı doku kültürü plakasının iki adet 24 delikli ultra düşük ataşman doku kültürü plakasına çevrilmesi için tasarlanmıştır. Doku kültürü plakaları kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtılmalıdır. Bazolateral çıkışlı 3D enteroidlerin türetilmesi, daha önce birçok grup35,36 tarafından tanımlandığı gibi, ortam için hafif değişikliklerle (yukarıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır) elde edilmiştir. Genel enteroid türetme prosedürü insanlarınkinden farklı değildir. Kısacası, eksize edilen doku yıkanır, küçük parçalar halinde kesilir ve hücre bozulma tamponunda inkübe edilir. Hücre çözeltisi daha sonra 70 μM'lik bir hücre süzgecinden geçirilir ve bu da yüksek yoğunlukta kaplanmış kriptlerle sonuçlanır.<ol><li>Ortamları, 24 delikli bir 3D bazolateral-çıkış enteroidi plakasının her bir kuyucuğundan aspire edin.</li>
		<li>24 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 500 μL 5 mM buz gibi soğuk EDTA/PBS ekleyin ve minimum 5x-6x p200 pipetle yukarı ve aşağı pipet yaparak bazal membran ekstraktını/ECM kubbesini nazikçe mekanik olarak bozun.</li>
		<li>Dört kuyucuğun içeriğini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve konik tüpe 8 mL buz gibi soğuk EDTA / PBS ekleyin. Kalan 20 kuyuyu da aynı şekilde aktarın.</li>
		<li>15 mL konik tüpleri dönen bir platformda 1 saat boyunca 4 °C'de veya 330 rpm'de çalkalayıcıda inkübe edin. 1 saatlik inkübasyondan sonra, konik tüpleri 300 x g'de 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı her tüpten çıkarın ve atın.</li>
		<li>Hücre peletlerini 5 mL DMEM / F12 ile birleştirin ve yıkayın ve hücre süspansiyonunu iki 15 mL konik tüpe dağıtın.</li>
		<li>4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yaparak hücreleri pelet edin. Süpernatantı çıkarın ve her tüpe 12 mL AFM ekleyerek hücre peletlerinin yeniden askıya alınmasını sağlayın.</li>
		<li>İki adet 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna enteroid süspansiyonun 500 μL'lik pipeti.</li>
		<li>Plakaları 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 2-5 gün boyunca veya enteroidler polariteyi tersine çevirene kadar inkübe edin.</li>
		<li>Enteroid reversal'ı kontrol etmek için, önce doğrulayıcı immünofloresan boyamayı ve ortalama tersine çevirme süresini (~ 3 gün) belirleyin, ardından temel bir ışık mikroskobu görselleştirmesi kullanarak polarite tersine çevirmesini onaylayın. Apikal-out enteroidleri görünüşte çok hücreseldir, bazolateral çıkış enteroidleri ise genellikle büyük bir merkezi lümen veya tomurcuklanma varlığı ile baskındır (bakınız Ek Şekil 1). NOT: Prosedür standartlaştırıldıktan sonra, apikal-out'a dönüşüm oranı tipik olarak% 95'i aşıyor. Apikal-çıkış enteroidlerinin kullanımı bir terminal deneyi olarak tasarlanmıştır, ancak apikal çıkış enteroidlerini az sayıda bazolateral çıkış enteroidine geçirmek teorik olarak mümkündür.</li>
	</ol></li>
	<li>Apikal-out NEC-in-a-dish NOT: Enteroidler polariteyi tersine çevirdikten sonra, kültürleri sonraki deneylerde hızlı bir şekilde kullanın, çünkü apikal konformasyondaki uzun ömürleri 3-4 günden fazla doğrulanmamıştır. Aşağıdaki NEC-in-a-dish modeli için, enteroidler 24 saat boyunca tedavi edildi, daha sonra hemen sonra toplandı ve aşağı akış deneyleri için korundu.<ol><li>Enteroidler en az% 95 verimlilikle polariteyi görsel olarak tersine çevirdikten sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve 24 kuyucuklu bir plakanın sekiz kuyuğunu 15 mL konik bir tüpe toplayın. Apikal çıkış enteroidleri süspansiyonda olduğundan, enteroid/ortam çözeltisini pipetlemeniz yeterlidir. 15 mL tüpü 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
		<li>Hücreler peletlendikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini, 1x PBS'nin (kontrol) istenen hacmiyle (eklenen en yüksek işlem hacmine uymak için burada 10 μL) karıştırılmış 4 mL AFM'de yeniden askıya alın.</li>
		<li>Pipet, 500 μL enteroid/PBS/AFM süspansiyonunu 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasının sekiz deliğine yerleştirir ve plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5 CO2'de inkübe eder.</li>
		<li>1.3.1.-1.3.3 adımlarını yineleyin. normokside TNF-α (20 ng/mL ve 50 ng/mL) ve LPS (100 μg/mL ve 200 μg/mL) tedavileri için. Tüm hipoksi tedavileri için, Adım 1.3.1.-1.3.3.'ü tekrarlayın, ancak plakayı 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 ve% 1O2'de ayrı bir inkübatöre yerleştirin. NOT: Adım 1.3.4. Adım 1.3.1.-1.3.3 ile aynı anda yapılabilir, ancak netlik için, yukarıdaki prosedür karmaşıklığı azaltmak için tedavi ile ayrılmıştır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. İmmünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi
<ol><li>Boyama çözeltilerinin hazırlanması<ol><li>7 μL Triton X-100'ü 1x PBS'de 7 mL'lik son hacme karıştırarak %0,1 Triton X-100 hazırlayın. 30 mL'lik son hacme 30 μL Tween-20 ila 1x PBS ekleyerek PBST'yi (PBS-Ara) hazırlayın.</li>
		<li>6.3 mL PBST'ye 700 μL NDS ekleyerek %10 normal eşek serumu (NDS)/PBST hazırlayın. PBST'ye 7 mL'lik son hacme 70 μL NDS ekleyerek %1 NDS/PBST hazırlayın. NOT: Burada eşek serumu sekonder antikor konakçısı ile korelasyon için kullanıldı. Bununla birlikte, bloke edici serum türleri, spesifik olmayan bağlanmayı düzgün bir şekilde bloke etmek için ikincil antikor türleriyle eşleşmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Boyama (1. Gün)<ol><li>24 delikli bir plakanın dört kuyucuğunun içeriğini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İstenilen tüm kuyucuklar / tedaviler için, her tedavi ayrı bir tüpte olacak şekilde tekrarlayın. Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Enteroidler peletlendikten sonra, süpernatanı çıkarın.</li>
		<li>Hücre peletlerini oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 300 μL% 4 formaldehit fiksatif olarak yeniden askıya alın. 30 dakika sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve peleti 500 μL steril, RT 1x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve% 0.1 Triton X-100'ün 500 μL'sini ekleyin ve RT'de 1 saat bekletin.</li>
		<li>1 saat sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 500 μL 1x PBS ile yıkayın ve tüpleri 2-8 ° C'de 15 dakika boyunca 200 rpm'de bir rotatör veya çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bunu toplam 4 kat tekrarlayın.</li>
		<li>Tüpleri 300 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 500 μL %10 NDS/PBST ekleyin ve RT'de 45 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, 24 delikli bir plakanın sekiz kuyucuğu için 20 μL rekombinant anti-villin antikoru, 10 μL E-kadherin antikoru ve 1970 μL % 1 NDS / PBST'yi birleştirerek birincil antikor çözeltileri hazırlayın.</li>
		<li>45 dakikalık inkübasyondan sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı çıkarın ve 250 μL birincil antikor çözeltisi ile değiştirin. Tüpleri gece boyunca 2-8 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Boyama (2. Gün)<ol><li>Tüpleri 300 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Peletin boyutuna bağlı olarak her tüpe 250-500 μL PBST ekleyin ve 2-8 ° C'de 1 saat boyunca 200 rpm'de rotatör veya çalkalayıcıya yerleştirin. PBST yıkamasını 4x tekrarlayın.</li>
		<li>% 50 gliserol için 52 μL Cy3 eşek anti-tavşan IgG (H + L) ve 5142.8 μL% 1 NDS / PBST'ye 5.2 μL eşek anti-fare floresan yeşil 488 sekonder antikor ekleyerek ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Son PBST yıkama ve santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı tüplerden çıkarın. Her tüpe 200 μL ikincil antikor çözeltisi dağıtın ve gece boyunca karanlıkta 2-8 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lekeli apikal-out enteroidlerinin montajı (Gün 1)<ol><li>Mavi nükleer boya içeren gliserol bazlı mountantı 1 saat boyunca RT'ye getirin.</li>
		<li>Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantın 100 μL'sini çıkarın ve kalan ~ 100 μL süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 0,5 mL tüplere aktarın.</li>
		<li>Hücreleri peletlemek için tüpleri 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL uzak kırmızı nükleik asit boyasında yeniden askıya alın. RT'deki tüpleri 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Hücreleri peletlemek için tüpleri 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın. İkinci bir yıkama için tekrarlayın.</li>
		<li>Tüpleri, hücreleri peletlemek ve süpernatanın 70 μL'sini çıkarmak için 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. PBS'nin kalan hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın ve içeriği etiketli bir kapak kapağına (24 mm x 60 mm) aktarın.</li>
		<li>75 μL montaj maddesini doğrudan numunenin üzerine uygulayın ve pipet ucu olan kabarcıkları çıkarın. Kapakların karanlıkta RT'de gece boyunca (18-24 saat) iyileşmesine izin verin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lekeli apikal-out enteroidlerinin montajı (Gün 2)<ol><li>Gece boyunca kürlendikten sonra, kapak kapaklarına ince bir gliserol tabakası (~ 15 μL) uygulayın. Kapak kaymasını cam kızağa monte edin ve yavaşça yerine bastırın. Kapak kapağı ile slayt arasındaki kabarcıkları kaldırmak için dokunun.</li>
		<li>Konfokal mikroskopla 20x büyütmede görüntülemeden önce, kapak kaymasının karanlıkta en az 2 saat boyunca RT'ye ayarlanmasına izin verin. Çeşitli konfokal edinim yöntemleri kullanılarak enteroidlerin mikroskobik olarak görselleştirilmesi için, Lallemant ve ark.37'ye bakınız.</li>
	</ol></li>
	<li>İmmünofloresan nicelleştirme NOT: Bu yöntem, ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak arka plan sinyalini kaldırarak düzeltilmiş toplam floresansı belirler.<ol><li>ImageJ'de konfokal görüntüleri açın ve ilgilenilen bölge (ROI) aracıyla istediğiniz alanı ana hatlarıyla belirtin.</li>
		<li>Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya giderek kullanıcı tanımlı parametreleri ayarlayın. Ayarlar sekmesinin altında Alan > Entegre Yoğunluk > Ortalama Gri Değer'i seçin.</li>
		<li>Analiz > Ölçü'ye gidin. Ölçümleri içeren bir açılır pencere görünecektir. Bu ölçümleri kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.</li>
		<li>Arka plan sinyalini çıkarmak için, görüntünün floresan olmayan küçük bir alanını seçin. Bu bölge için > Ölçüyü Analiz Et'e gidin. Ölçümleri içeren bir açılır pencere görünecektir. Çıktıyı kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.</li>
		<li>Seçilen hücrenin alanını, arka plan okumalarının ortalama floresansı ile çarpın ve düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) hesaplamak için toplamı entegre yoğunluktan çıkarın. Bir elektronik tablodaki veya istatistiksel yazılım paketindeki kayıtları tutarken ilgilendiğiniz tüm resimler için yukarıdaki adımları tekrarlayın (bkz.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Apikal çıkış NEC-in-a-dish hücre canlılığı
<ol><li>Enteroid tedavileri<ol><li>Adım 1'de olduğu gibi 24 saat boyunca apikal-out NEC-in-a-dish modelini oluşturun.</li>
		<li>Hücre canlılığı testi reaktifini 4 ° C'de gece boyunca çözün. Tahlil gününde, reaktifi kullanımdan 30 dakika önce RT'ye getirin. Karıştırmak için reaktifi ters çevirin.</li>
		<li>Testi yapmadan önce, her bir kuyucuktan 100 μL ortam çıkarın ve kalan 400 μL'yi bırakın.</li>
		<li>RT'deki bir plaka çalkalayıcıdaki içeriği, hücre lizisini indüklemek için 200 rpm'de 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın. Sallamayı takiben, plakayı RT'de 25 dakika daha inkübe edin.</li>
		<li>25 dakikalık inkübasyondan sonra, pipetleme yoluyla bir kuyucuğun içeriğini karıştırın ve 800 μL'nin 200 μL'sini 96 delikli, opak, polistiren, şeffaf tabanlı bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Kalan 600 μL için tekrarlayın ve kuyu başına dört teknik kopya oluşturun. 24 delikli plakanın her bir kuyucuğunun kalan içeriğini bu şekilde 96 delikli bir plakaya aktarın.</li>
		<li>Lüminesans yapabilen bir plaka okuyucu kullanarak, 0,25 ms entegrasyonda değerleri kaydedin ve tedaviler arasındaki göreceli değerleri karşılaştırın. Alternatif olarak, tedavi lüminesansını adenozin trifosfat (ATP) standardıyla karşılaştırın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur ve çıkar çatışmaları yoktur.

İntestinal epitel kriptlerinden türetilen enteroid modellerin son zamanlarda geliştirilmesi, nekrotizan enterokolit patogenezinin inceleneceği fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro dokuya izin vermektedir. Bağırsak epitelinin tüm majör farklılaşmış hücre tiplerini içermesine rağmen, 3D enteroidler hala birkaç önemli sınırlamaya tabidir. Konvansiyonel, bazolateral çıkışlı enteroidler, bileşimi ve yoğunluğu doku kültürü ortamında normal difüzyonu sınırlayabilen 3D ECM hidrojel kubbelerinde askıya alınır<sup c...

Preterm bebeklerin %10'una varan oranda ince bağırsağın ciddi inflamatuar bir hastalığı olan nekrotizan enterokolit (NEK), genellikle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir 1,2. Cerrahi müdahale gerektiren çok düşük doğum ağırlıklı (<1500 g) bebeklerde %50'ye yaklaşan mortalite oranları nadir değildir3. NEC'nin kesin etiyolojisi şu anda anlaşılamamış olsa da, formül besleme gibi risk faktörlerinin, hastalığın gelişiminde dysbiosis, olgunlaşmamış bir bağırsak epiteli ve işlevsiz bir bağırsak bariyeri gibi fizyolojik anomalilerle birleştiği düşünülmektedir 2,4. Önemli çabalara rağmen, son on yılda NEC'nin önlenmesi veya tedavisinde çok az ilerleme kaydedilmiştir5. NEC ve ilişkili intestinal epitel bariyer disfonksiyonunu incelemek için yeni bir in vitro yöntem, hastalığın patogenezinin anlaşılmasını ilerletmek için gereklidir, çünkü hayvan modellerinden elde edilen bulgular şimdiye kadar yatak başına kötü bir şekilde çevrilmiştir6.
NEC sırasında oyundaki mekanizmaları araştırmak için bir dizi in vitro model kullanılmıştır. İnsan bağırsak epitel hücre hattı Caco-2, NEC 7,8'in in vitro modellerinde en yaygın kullanılanlar arasındadır. Kako-2 hücreleri, ince bağırsağın fırça sınırındaki morfolojik özelliklerini taklit eder, ancak bir hücre hattı olarak, yüksek oranda çevrilebilir bir model için gerekli olan mukus üreten kadeh hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli in vivo hücre tiplerine farklılaşmaz. HT-29-MTX, insan kolon adenokarsinom hücreleri, karışık bir enterosit ve kadeh hücresi fenotipi içerir, ancak yine de bağırsak epiteli9'un kript bazlı hücre tiplerinden yoksundur. IEC-6 ve IEC-18, olgunlaşmamış ileal kript benzeri bir morfolojiye sahip transforme edilmemiş hücre çizgileridir, ancak insan dokusundan türetilmezler ve translasyonel kapasitelerini sınırlarlar. FH'lar 74-Int ve H4 bağırsak hücre hatları insan fetal dokusundan türetilir ve sıkı kavşaklar veya polarize tek katmanlı10,11 oluşturmaz ve bu nedenle NEC'ye duyarlı en prematüre bebeklerle karşılaştırıldığında bile olgunlaşmamıştır. Tipik olarak, NEC in vitro modeller, NEC12'de bağırsak iltihabını başlatan majör bir reseptör olan toll-like reseptör 4'ü (TLR4) indüklemek için lipopolisakkarit (LPS) tedavilerini kullanır. Reaktif oksijen türleri (ROS) tedavisi yoluyla, tipik olarak hidrojen peroksit yoluyla aracılık edilen hasar, genellikle NEC benzeri oksidatif hasarı ve apoptozu indüklemek için kullanılır13,14. İntestinal inflamasyonun ana itici gücü olarak, inflamatuar TLR4 sinyallemesinin bir aşağı akış bileşeni olan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), in vivo patogenezi taklit etmek için bu in vitro modellerde yaygın olarak kullanılmaktadır15.
İndüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilen organoidler, kompleks in vivo mimarisini ve türetildikleri dokunun hücre tipi kompozisyonunu özetleme yetenekleri nedeniyle bağırsağın in vitro bir modeli olarak popülerlik kazanmıştır16,17. İlgili bir in vitro sistem olan enteroidler, iPSC türevi organoidlerden daha kolay kurulan ve bakımı yapılan rezeke edilmiş bağırsak kriptlerinden türetilen organoidlerdir. Enteroidler tipik olarak bazolateral hücre yüzeyi ile sınırlı deneysel erişime sahip üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste (ECM) yetiştirilir. Apikal yüzeye olan bu engelin üstesinden gelmek için mikroenjeksiyon18,19 gibi yöntemler geliştirilmiştir, ancak lümen içinde dökülmüş hücresel enkaz ve mukus birikmesi, mikroenjeksiyonu hem teknik olarak zor hem de tutarsız hale getirmektedir. Özel robotik mikroenjeksiyon platformlarına yaygın olarak erişilemediğinden20, teknik yetenek ve genel teknikteki laboratuvardan laboratuvara değişkenlik, mikroenjeksiyon protokolleri ile üstesinden gelinmesi gereken önemli değişkenler haline gelmektedir. Ayrışmış 3D enteroidlerden türetilen ve hala bağırsak epitelinin tüm ana hücre tiplerini içeren iki boyutlu (2D) monokatmanlar, apikal yüzeye erişime izin verir, ancak geleneksel olarak mezenkimal miyofibroblastların besleyici tabakası olmadan sürdürülmesi zor olmuştur21. Hücre kültürü geçirgen destekleri, altta yatan miyofibroblastlar kullanılmadan enteroid monokatmanların hem apikal hem de bazolateral taraflarına erişmek için kullanılabilirken, bu ekler konfokal mikroskopi gibi modalitelerle kullanılmadan önce eksizyon ve membranın monte edilmesini gerektirir, bu da geleneksel mikroskopi yöntemlerini kullanırken daha teknik olarak zorlu ve zor bir işlemle sonuçlanır22. NEC, geleneksel 3D enteroidler 23,24,25 ve geçirgen destekler 26,27 kullanılarak in vitro olarak modellenmiştir ve bağırsak iltihabı son zamanlarda çip üzerinde bağırsak modelleri28,29 ile çoğaltılmıştır. Mikroakışkanları içeren çip üzerinde bağırsak modelleri, şimdiye kadar, en gelişmiş ve çevrilebilir modeller olsa da, bu teknoloji pahalı, karmaşık ve çoğu araştırmacı için erişilemez30.
Apikal-out enteroid tekniklerindeki son gelişmeler, in vitro epitel31,32,33'ün yapısal bütünlüğüne zarar verme riski olmadan 3D enteroidlerin apikal yüzeyine daha kolay erişim sağlamıştır. Apikal-out enteroidler, in vivo bağırsak epitelinin hücre tipi kompozisyonunu ve bariyer fonksiyonunu paylaşır, ancak tipik 3D enteroidlerin aksine, bu hücrelerin apikal yüzeyleri kültür ortamına bakar ve besin emilimi, mikrobiyal enfeksiyon ve luminal sekresyon hakkında fizyolojik olarak daha ilgili çalışmalara izin verir31. Apikal-dışarı enteroidlerin ek bir avantajı, deneysel ajanları enteroidlere homojen olarak dağıtma yeteneğidir. Mikroenjeksiyonda olduğu gibi enteroid boyutuna göre değişen tedavi hacimleri gerekli değildir ve bu enteroidleri süspansiyon kültüründe tutma yeteneği, deneysel ajan difüzyonu32 üzerindeki herhangi bir ECM girişimini ortadan kaldırır.
Nekrotizan enterokolit, çoklu intestinal epitel hücre tiplerini ve çeşitli çevresel ve patofizyolojik faktörleri içeren multifaktöriyel bir hastalıktır34. Bağırsak enteroidlerinin çeşitli hücre bileşimi, NEC gibi karmaşık bir hastalığın modellenmesinde monokültürlere göre açık bir gelişmedir. İlginç bir şekilde, in vitro monokültürlerde hasarı indüklemek için tek bir enflamatuar maruziyet genellikle yeterli olsa da, enteroidler, fare modelleri23'te olduğu gibi, NEC benzeri hasarı indüklemek için en az iki enflamatuar bileşen gerektirmektedir6. Burada, hipoksi (NEC6'nın önemli bir klinik özelliği) ve LPS veya TNF-α ile kombinasyon halinde apikal-out enteroidleri kullanarak, NEC benzeri inflamasyona epitel yanıtlarını incelemek ve potansiyel olarak terapötik hedefleri tanımlamak için geliştirilmiş ve fizyolojik olarak daha alakalı bir in vitro model olarak apikal-out NEC-in-a-dish modelini sunuyoruz. İnce bağırsak 3D enteroidlerinin polaritesini tersine çevirmek için bir protokolün yanı sıra epitel bariyeri bozulmasını ve bileşke protein ekspresyon değişikliklerini tanımlamak için bir immünofloresan boyama protokolü tanımladık. Son olarak, çift vuruşlu, apikal çıkışlı NEC-in-a-dish modelimizin etkisini belirlemek için basit bir enteroid canlılık testi daha da gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konik tüp</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılığı Testi</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra Düşük Eklenti 24 Kuyulu Mikroplakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı 24 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-Tavşan IgG Antikoru, Cy3 konjuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium/Nutrient Jambon Karışımı F-12 (DMEM-F12) 15 mM HEPES tamponu ile</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>E-kaderin antikoru (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi %4, tamponlu, pH 6.9</td><td>Milipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Büyüme Ortamı (İnsan)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 Konfokal Mikroskop</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkaritler Escherichia coli O111: B4, jel filtrasyon kromatografisi ile saflaştırıldı</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Kuyulu, Nunclon Delta ile İşlenmiş, Düz Tabanlı Mikroplaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Fosfat Tamponlu Salin), 1x [-] kalsiyum, magnezyum, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr>NucBlue <td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td> <td>ile Uzun Cam Antifade Mountant</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Anti-Villin antikoru [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TNF-&alfa; protein 100 & mikro; g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Çok Modlu Mikroplaka</td><td>Okuyucu Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Serisi II Su Ceketli Tri-Gaz İnkübatör, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 İyodür (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tüpler, 0,5 mL, düz kapaklı</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vitro nekrotizan enterokolitin apikal-out enteroid modeli

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Nekrotizan enterokolit (NEC), preterm bebekleri etkileyen, intestinal inflamasyon ve nekroz ile karakterize yıkıcı bir hastalıktır. Enteroidler son zamanlarda gastrointestinal patolojileri modellemek için umut verici bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, enteroid manipülasyon için şu anda kullanılan yöntemler ya epitelin apikal yüzeyine (üç boyutlu [3D]) erişimden yoksundur ya da zaman alıcı ve kaynak yoğundur (iki boyutlu [2D] tek katmanlılar). Bu yöntemler genellikle modelin fizyolojik olarak çevrilebilir hale gelmesi için mikroenjeksiyon gibi ek adımlar gerektirir. Burada, enteroid polariteyi tersine çevirerek in vitro NEC'yi incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve ucuz bir protokol tarif ediyoruz, bu da apikal yüzeyin dışa bakmasıyla sonuçlanıyor (apikal-dışarı). Norkoksi veya hipoksik koşullar altında tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) veya lipopolisakkarite (LPS) maruziyetini takiben enteroid bariyer bütünlüğünü ve bileşke protein ekspresyonunu incelemek için bir immünofloresan boyama protokolü de sağlanmaktadır. Normoksik veya hipoksik LPS veya TNF-α maruz kalan 3D apikal-out enteroidlerin 24 saat boyunca yaşayabilirliği de değerlendirilmektedir. LPS veya TNF-α maruz kalan enteroidler, hipoksi ile kombinasyon halinde, epitel mimarisinin bozulması, aderans birleşim proteini ekspresyonunun kaybı ve hücre canlılığında bir azalma sergiledi. Bu protokol, NEC tedavileri için potansiyel epitel hedeflerini belirlemek ve terapötiklere erken bağırsak yanıtını incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve uygun maliyetli bir platform sunan yeni bir apikal-out-out-NEC-in-a-dish modelini tanımlamaktadır.

Nekrotizan enterokolit bağlamında bile, bağırsak iltihabını modellemek için enteroidlerin kullanımı artık yaygındır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, enteroidlerin apikal yüzeyine erişimden yoksundur, oral terapötikler olarak nihai kullanım için amaçlanan bileşiklerin fizyolojik alaka düzeyini reddeder veya enteroid türevi tek katmanlarda olduğu gibi teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. NEC'nin akım in vitro enteroid modellerinin faydasını arttırmak için, enteroidlerin polaritesini tersine ...

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Bu protokol, ilk apikal-out in-a-dish modelini tanımlar ve oral uygulama için amaçlanan potansiyel terapötiklerin in vitro modellemesini kurarken bazal lateral out enteroid in-a-dish modellerine göre kritik bir gelişmedir. Bu yöntem, enteroidlerin apikal yüzeyine erişim sağlar. Bileşikler hücre ortamına eklenebilir ve bileşikler in vivo oldukları gibi apikal olarak alınır.Potansiyel oral terapötikleri test etmek için in vitro bir bağırsak iltihabı sistemi kurmak isteyen araştırmacılar bu tekniği özellikle yararlı bulabilirler. Farklı yaş ve türlerden elde edilen dokular daha fazla standardizasyon gerektirebilir. Bu nedenle hastalarda polarite kurulurken ters dönme süreleri gerekebilir.3D enteroidlerin polaritesini tersine çevirmek için, yerleşik 3D bazolateral enteroidlerin 24 kuyucuklu plakasının her bir kuyucuğundan ortamı aspire edin. 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 500 mikrolitre beş milimolar buz soğuk, EDTA veya PBS ekleyin ve bir P 200 pipetle beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek bazal membran ekstraktını veya hücre dışı matris kubbesini yavaşça mekanik olarak bozun. Dört kuyucuğun içeriğini 15 mililitrelik kronik bir tüpe aktarın.Daha sonra tüpe sekiz mililitre buz gibi soğuk EDTA kesme PBS ekleyin. Kalan 20 kuyuyu da aynı şekilde aktarın. Tüpleri dönen bir platformda bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin veya 330 RPM'de çalkalayın.Kuluçkadan sonra tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı her tüpten atın. Peletleri beş mililitre DMEM F12 ile birleştirin ve yıkayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve hücre peletlerinin yeniden askıya alınmasını sağlamak için tüpe 12 mililitre antibiyotiksiz ortam eklemeden önce süpernatantı çıkarın.Pippet 500 mikrolitre enteroid süspansiyon, 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna yerleştirilir. Plakayı iki ila beş gün boyunca veya enteroidler polariteyi tersine çevirene kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Çekimser kaldığınız ilk günde, 24 kuyucuklu bir plakanın dört kuyucuğunun içeriğini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.İstenilen tüm kuyucuklar için ayrı bir tüpte her işlemle tekrarlayın. Tüpleri santrifüj edin ve peleti oda sıcaklığında aldehit fiksatifinden %4'lük 300 mikrolitre içinde yeniden askıya alın. 30 dakika sonra peletleri 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.Tüplere 500 mikrolitre% 0.1 Triton X 100 ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, tüpleri iki ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca 200 RPM'de bir rotatör veya çalkalayıcı üzerine yerleştirin.Son inkübasyondan sonra, PBS T'ye 500 mikrolitre% 10 NDS ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Ertesi gün, peletin boyutuna bağlı olarak tüplere 250 ila 500 mikrolitre PBS T ekleyin ve bunları iki ila sekiz santigrat derecede bir saat boyunca 200 RPM'de rotatöre veya çalkalayıcıya yerleştirin.İkincil antikor çözeltisinden 200 mikrolitre ekleyin ve tüpleri karanlıkta iki ila sekiz santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri döndürerek ve 100 mikrolitre süpernatan çıkararak lekeli apikal enteroidleri monte etmeye devam edin. Kalan 100 mikrolitre süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 500 mikrolitrelik tüplere aktarın.Tüpleri 20 saniye boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 100 mikrolitre oda sıcaklığında çok kırmızı nükleik asit lekesinde yeniden askıya alın. 20 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri santrifüj edin ve peletleri 100 mikrolitre PBS içinde yeniden askıya alın.İkinci yıkama ve santrifüjlemeden sonra 70 mikrolitre süpernatantı çıkarın ve peletleri kalan PBS hacminde yeniden askıya alın. Ardından hücre süspansiyonunu etiketli 24 x 60 milimetrelik bir kapak kapağına aktarın. 75 mikrolitre montaj aparatını doğrudan numunenin üzerine uygulayın ve pipet ucuyla kabarcıkları çıkarın.Karanlıkta gece boyunca kürlendikten sonra, kapak fişlerine ince bir gliserol tabakası uygulayın, ardından kapak kapaklarını cam slaytın üzerine monte edin ve yavaşça yerine bastırın. Kapak kayması ile slayt arasındaki kabarcıkları gidermek için dokunun. Enteroidleri konfokal mikroskopla 20 kat büyütmede görüntülemeden önce kapak kaymasının karanlıkta iki saat oda sıcaklığında ayarlanmasına izin verin.Enteroid tedaviler için, metin makalesinde açıklandığı gibi 24 saat boyunca bir çanak modelinde apikal bir nekrotizan enterokolit oluşturun. Tahlili yapmadan önce, kalan 400 mikrolitreyi bırakarak her kuyudan 100 mikrolitre ortam çıkarın. Her bir kuyucuğa 400 mikrolitre hücre canlılığı testi reaktifi ekleyin.Hücre lizisini indüklemek için içeriği 200 RPM'de beş dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıda kuvvetlice karıştırın. Daha sonra, 200 mikrolitreyi 96 kuyu berraklığında tabanlı bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Kalan 600 mikrolitre için tekrarlayın ve kuyu başına dört teknik kopya oluşturun.Lüminesans yapabilen bir plaka okuyucu kullanarak, 0,25 milisaniye entegrasyonunda değerleri kaydedin ve tedaviler arasındaki göreceli değerleri karşılaştırın. Kontrolün temsili immünofloresan boyaması, çekirdeklerin lümene doğru apikal dışarı lokalizasyonunu ve epitelin dış kenarında kötü adamın tespitini doğruladı. Kontrol ile karşılaştırıldığında, lipo polisakkarit, tümör nekroz alfa veya hipoksiye maruz kalmak, tek başına brüt hücre morfolojisi E-kadherin veya kötü adam lokalizasyonunda veya floresan yoğunluğunda açık değişikliklere neden olmamıştır.Hipoksi ile birlikte lipo polisakkarit veya tümör nekrozu alfa ile tedavi, epitel mimarisini bozdu ve ECA işitme kaybı ve kötü adam boyama ile ortaya çıkan aderans kavşağı ve fırça sınır protein ekspresyonunda önemli bir kayıp gösterdi. Apikal çıkış hücresi canlılığı normoksik veya hipoksik koşullar altında belirlendi. Kontrol lipo polisakkarit veya tümör nekrozu alfa ile karşılaştırıldığında normoksik koşullar altında enteroidlerin hücre canlılığını önemli ölçüde etkilemedi.Bununla birlikte, lipo polisakkarit veya tümör nekroz alfasında, hipoksi ile kombinasyon halinde, tek başına hipoksiye kıyasla canlılıkta önemli azalmalar gözlenmiştir. Apikal dışarı çanak içi modeli kurarken. EDTA'yı hücre süspansiyonunda buz gibi soğuk tutmayı unutmayın.Bu, polaritenin tersine çevrilmesini artıracak ve tüm ECM'nin uygun şekilde sıvılaştırılmasını ve çıkarılmasını sağlayacaktır. QPCR, RNA-seq, batı lekelenmesi veya bariyer geçirgenliğinin fonksiyonel değerlendirmeleri gibi diğer aşağı akış uygulamaları, hipokside inflamatuar sinyalleşmeye yanıtı karakterize etmek için daha fazla yapılabilir.

in-vitro-apical-out-enteroid-model-of-necrotizing-enterocolitis

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, lipopolisakkarit tedavisinin neden olduğu insan kaynaklı bir neonatal enteroid modelinde nekrotizan enterokolit hastalığının gelişimini göstermektedir. Bu model bağırsak patofizyolojisini incelemeye yardımcı olur.

İnsan Epitelyal Enteroid Modelinde Nekrotizan Enterokolit İndüksiyonu

Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Nekrotizan enterokolit (NEC), prematüre bebeklerde, özellikle çok düşük doğum ağırlıklı bebeklerde, yüksek mortalite ve belirsiz patogenez ile sıklıkla ortaya çıkan en şiddetli gastrointestinal (GI) hastalıktır. NEC'in nedeni inflamatuar immün düzenleyici sistem anormallikleri ile ilgili olabilir. Bir NEC hayvan modeli, NEC hastalığı bağışıklık araştırmaları için vazgeçilmez bir araçtır. NEC hayvan modelleri genellikle C57BL /6J yenidoğan fareleri kullanır; BALB/c yenidoğan fareleri nadiren...

Nekrotizan Enterokolit'in Yenidoğan BALB/c Fare Modeli

Bu protokol, insan dışı primat ileumundan izole edilen üç boyutlu (3B) enteroidlerden türetilen iki boyutlu (2B) tek katmanlı tabakalar üzerinde bir çizik yara testi oluşturmak ve gerçekleştirmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Hyaluronik Asit 35 kDa'nın Enteroid Kaynaklı Tek Katmanlı Erken İnce Bağırsak Hasarı ve İyileşmesinin In Vitro Modeline Etkisi

Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.

Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi

Escherichia coli, doğum sırasında bakterileri yutan yenidoğanlarda sepsise neden olur. E. coli'nin enterik yoldan kan dolaşımına seyahat etme kabiliyetinde yer alan süreç tam olarak anlaşılamamıştır. Bu in vitro model, E. coli suşlarının bağırsak epitel hücrelerinden geçme yeteneğini değerlendirir.

Yenidoğan Escherichia coli Bakteriyemi İzolasyonlarının İntestinal Transsitozunun Değerlendirilmesi

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Bu protokol, nekrotizan enterokolitin (NEC) yenidoğan fare modelini ve ardından yenidoğan murin ince bağırsağından lamina propria bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu özetlemektedir.

İmmün Hücre Profili Oluşturma için Nekrotizan Enterokolit ve Lamina Propria İzolasyonunun Yenidoğan Fare Modeli

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Keşfedin apikal-dış enteroid modeli kullanarak nekrotizan enterokolit için oral terapötik test yöntemlerini. Bu teknik, intestinal inflamasyonu in vitro ortamda çalışmak ve epitelyal bütünlüğü değerlendirmek için araştırmacılara önemli avantajlar sunar.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Daha fazla video keşfet