Une méthode biologique semi-automatisée et reproductible pour quantifier le dépôt de calcium in vitro

Notre méthode permet de mesurer la propension à la calcification des échantillons de patients à l’aide de cellules musculaires lisses vasculaires humaines. Cela aidera à propulser la recherche sur les troubles de calcification vasculaire, en aidant au développement de nouvelles thérapies. Cette technique utilise une détection par fluorescence, ce qui augmente la sensibilité et permet de mesurer les échantillons au fil du temps, réduisant ainsi le besoin de réplications et augmentant la robustesse.

Pour commencer, la culture de cellules musculaires lisses vasculaires humaines sur des flacons de culture cellulaire non enrobés à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Divisez les cellules en atteignant 70 à 90% de confluence. Pour fractionner, lavez les HVSMC deux fois avec du PBS.

Ajouter la trypsine et incuber pendant 2 à 5 minutes à 37 degrés Celsius. Inhiber la réaction de trypsine en ajoutant un milieu contenant du sérum. Centrifuger les cellules pendant 4 minutes à 350 RCF et remettre la pastille en suspension dans un milieu d’entretien.

Après avoir préparé les cellules pour une scission comme démontré, comptez et ensemencez les cellules dans une plaque de 48 puits pour commencer l’expérience de calcification. Après une incubation nocturne à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone à 5%, laver doucement les cellules deux fois avec du PBS, en aspirant soigneusement tout le PBS restant après le deuxième lavage. Ajouter doucement le milieu de calcification et incuber davantage à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

Vérifiez quotidiennement avec un microscope optique jusqu’à ce que la calcification se produise. Pour détecter la calcification par imagerie, ouvrez le logiciel et sélectionnez Protocoles et Créer nouveau. Sélectionnez Procédure et cliquez sur Définir la température.

Réglez la température sur 37 degrés Celsius et le dégradé sur 1 degré Celsius dans la fenêtre contextuelle, puis cliquez sur OK. Sélectionnez le type d’assiette de votre choix dans le menu déroulant. Ajoutez l’étape d’imagerie en cliquant sur Image. Sélectionnez l’imageur inversé et cliquez sur OK. Ajoutez trois canaux d’imagerie et réglez-les sur DAPI, RFP et Bright Field.

Cochez la case Montage et définissez le nombre et l’emplacement souhaités des images. Modifiez le chevauchement pour représenter une meilleure couverture de chaque puits. Sélectionnez les puits à imager.

Une nouvelle fenêtre s’ouvrira où les puits d’intérêt pourront être sélectionnés. Cliquez sur Options de mise au point pour définir le mode de mise au point. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.

Définissez chaque canal individuellement. Généralement, les puits sont auto-focalisés sur le canal DAPI. Réglez tous les autres canaux sur Hauteur focale fixe à partir du premier canal et définissez en cliquant sur OK. Fermez la fenêtre.

Démarrez les étapes de préréglage de la réduction des données en cliquant sur Réduction des données et sélectionnez Prétraitement d’image. Acceptez les paramètres par défaut en sélectionnant OK. Configurez une étape pour compter les cellules en sélectionnant Analyse cellulaire. Sélectionnez TsF DAPI Images dans le menu déroulant des canaux.

Définissez d’autres détails après l’exécution de l’imagerie. Préparez l’analyse du signal RFP en sélectionnant Statistiques dans l’étape Étiquette de la fenêtre contextuelle et sélectionnez TsF RFP comme canal d’entrée. Cochez les cases Valeur supérieure et Valeur inférieure.

Cochez la case Surface totale dans la liste inférieure. Sélectionnez Aucun dans la colonne Effet de couleur. Dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Personnalisé et cochez la case Arrière-plan.

Appuyez sur OK. Pour une lecture équitable, normalisez le signal RFP par cellule en appuyant sur Rapport sur le côté gauche. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Quantification de la DP Surface totale. Pour Data Input 1 dans le menu déroulant et sélectionnez Cell Count as Data Input 2.

Enfin, sélectionnez un nouveau nom d’ensemble de données et appuyez deux fois sur OK. Sélectionnez Effet de couleur comme illustré précédemment, puis cliquez OK.In le coin supérieur gauche, sélectionnez Fichier et enregistrez le fichier en tant que type de fichier de protocole. Enregistrez les observations pour chaque point temporel suivant la première instance de calcification.

Appuyez sur Lire maintenant dans le logiciel de démarrage et cliquez sur Protocole existant. Sélectionnez le protocole créé à l’étape précédente. Le programme vous invitera à enregistrer l’expérience.

Cela peut être fait à ce stade ou plus tard manuellement en cliquant sur le bouton Enregistrer en haut à gauche. Une fenêtre pop-up vous demandera d’attendre que le système chauffe. Allumez le contrôleur de gaz de dioxyde de carbone et réglez-le sur 5%Une fois que le système a atteint la température réglée, une invite apparaîtra pour insérer une plaque et lire.

Appuyez sur Annuler. Transportez la plaque de l’incubateur à l’imageur dans une boîte sûre pour éviter les bris et les déversements et est conforme aux réglementations locales en matière de biosécurité pour le transport de cellules vivantes en cas d’accident. Placez la plaque dans le lecteur de plaques.

Cliquez sur Procédure. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Étape de création d’image prédéfinie. Ajustez d’abord la mise au point et l’exposition sur le canal DAPI.

Décochez la case Exposition automatique sur tous les canaux, puis cliquez sur l’icône du microscope en regard du canal DAPI. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Sélectionnez le puits pour diriger la mise au point.

Si un signal est déjà visible, cliquez d’abord sur Autofocus, puis sur Auto Exposure. Sinon, augmentez d’abord l’exposition et répétez l’autofocus et l’exposition automatique. L’exposition peut être ajustée manuellement en sélectionnant le menu déroulant Exposition.

Vérifiez les paramètres sur plusieurs puits, puis enregistrez les paramètres. Ajustez l’exposition de la même manière pour tous les canaux. Pour le canal RFP, assurez-vous de commencer par un puits avec une calcification moyenne à élevée.

Fermez la fenêtre de procédure et sélectionnez le bouton vert Lire maintenant dans la barre des tâches supérieure. Enregistrez l’expérience comme indiqué par le logiciel. Répétez ce processus pour chaque point temporel.

Pendant que le système lit la plaque, toutes les images sont automatiquement traitées en arrière-plan. Ajustez les paramètres de nombre de cellules en sélectionnant les images DAPI TsF à afficher. Sélectionnez le puits de votre choix en double-cliquant.

Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Sélectionnez l’une des images. Sélectionnez l’onglet Analyse dans la fenêtre contextuelle.

Sélectionnez Nombre de cellules d’analyse cellulaire et cliquez sur OK. Désélectionnez les canaux RFP et Champ lumineux. Cochez la case Mettre en surbrillance les objets. Cliquez sur Options pour ouvrir le menu.

Ajustez le seuil de taille et d’intensité pour inclure tous les noyaux, mais excluez les débris, puis cliquez sur OK. Cliquez sur Appliquer les modifications en bas à gauche pour appliquer les paramètres à toutes les images. De même, sélectionnez une image bien fin avec une quantité moyenne à élevée de calcification. Pour régler au mieux le rapport signal/bruit, cliquez sur l’onglet Analyse dans le menu Tâche.

Sélectionnez Statistiques d’image. Désélectionnez le canal DAPI et Champ clair. Cliquez sur Options pour ouvrir le menu.

Cochez la case Valeurs aberrantes de seuil. Pour définir la valeur de seuil non subjective du signal au-dessus de l’arrière-plan, sélectionnez l’outil Ligne dans la barre des tâches. Une fenêtre apparaîtra.

Tracez une ligne à travers une zone de signal tout en incluant une zone de l’arrière-plan. Ajustez les valeurs supérieures et inférieures des seuils. Ne comptez le signal au-dessus de l’arrière-plan et excluez s’il y a des débris ou des artefacts.

Cliquez sur OK et appliquez les modifications pour transférer les paramètres vers tous les autres puits. Confirmer que le seuil est sélectionné avec précision dans les autres puits. Une fois le nombre de cellules et les seuils d’appel d’offres définis, exportez les données.

Cliquez sur le bouton Excel en regard du menu déroulant pour exporter les données directement dans une feuille de calcul. Différents stades de calcification allant de bas à haut ont été détectés et analysés. La calcification a été repérée sous forme de taches noires à l’aide de la microscopie optique, qui ont été utiles pour l’évaluation primaire et la détermination du moment de commencer l’imagerie.

Pour améliorer le rapport signal/bruit, les images RFP traitées ont été analysées pour quantifier la calcification. Les données ont été obtenues en comparant deux conditions ou plus au même moment. Les données ont été normalisées au nombre de cellules en tant que zone de calcification par cellule.

Les données ont également été présentées sous la forme d’une série chronologique montrant la même condition à divers moments. Il est important que les résultats après la réduction et l’analyse des données reflètent toujours ce que l’on peut voir avant la transformation de l’image et le seuil.