Name: Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Découvrez une méthode de mesure en temps réel de la croissance musculaire squelettique chez le poisson-zèbre vivant. Cette technique offre une précision spatiale et temporelle élevée pour étudier la régulation du développement musculaire.

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Les auteurs sont profondément redevables aux efforts des membres du laboratoire Hughes, les Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin et Vladimir Snetkov pour le développement des protocoles décrits, et à Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau et Peter Currie pour le partage de plasmides ou de lignées de poissons-zèbres. SMH est un scientifique du Conseil de recherches médicales (CRM) avec la subvention de programme G1001029, MR/N021231/1 et MR/W001381/1. MA a été titulaire d’une bourse de doctorat du programme de formation doctorale MRC du King’s College de Londres. Ce travail a bénéficié de l’apport trigonométrique de David M. Robinson, érudit, mentor et ami.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nous rapportons ici une méthode pour une estimation précise et efficace du volume musculaire des larves de poisson-zèbre vivants à des stades ou dans des variantes génétiques dans lesquels la pigmentation n’est pas un obstacle majeur à l’imagerie et lorsque l’anesthésie transitoire et / ou l’immobilisation est bien tolérée. Alors que nous avons utilisé la microscopie confocale à balayage laser, les approches décrites sont applicables à la microscopie confocale à disque rotatif ou à feuille de lumière et à toute autre mét...

La croissance tissulaire régulée, comprenant l’augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et / ou de la taille des cellules (hypertrophie), est un facteur crucial dans le développement, la régénération et l’adaptation écologique et évolutive. Malgré d’énormes progrès dans la compréhension génétique moléculaire de la biologie cellulaire et du développement au cours des dernières décennies, la compréhension mécaniste de la régulation de la taille des tissus et des organes en est encore à ses balbutiements. L’une des raisons de cette lacune dans les connaissances est la difficulté de quantifier la croissance tissulaire dans les organismes vivants avec la précision spatiale et temporelle nécessaire.
Divers aspects de la croissance d’organismes entiers peuvent être mesurés à plusieurs reprises au fil du temps, révélant des courbes de croissance pour chaque individu 1,2,3,4,5. Des méthodes de balayage de plus en plus sophistiquées, telles que l’absorptiométrie à rayons X (DXA), la tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), permettent de suivre la croissance d’organes entiers et d’autres régions du corps (par exemple, les muscles squelettiques identifiés individuellement) chez des individus isolés, humains et modèles 6,7,8,9,10 . Cependant, ces méthodes n’ont pas encore la résolution de révéler des cellules individuelles et donc les liens entre les comportements cellulaires et la croissance au niveau des tissus ont été difficiles à discerner. Pour établir de tels liens, les études traditionnelles se sont souvent appuyées sur des cohortes d’animaux individuels similaires, dont quelques-uns sont sacrifiés à des moments successifs, puis analysés en détail cytologique. De telles approches nécessitent de faire la moyenne des changements observés entre des groupes d’individus (de préférence similaires, mais néanmoins variables) et souffrent donc d’un manque de résolution temporelle et spatiale, ce qui rend difficile la recherche d’événements corrélés au niveau cellulaire suggérant une cause et un effet.
Des études sur des organismes modèles d’invertébrés, initialement chez C. elegans et D. melanogaster, ont contourné ces problèmes en développant la microscopie optique pour atteindre une résolution cellulaire et mesurer avec précision la croissance au fil du temps chez des individus individuels. De telles études ont révélé des comportements de lignée cellulaire étonnamment invariants dans la croissance de ces petits organismes modèles 11,12,13,14,15,16,17. Cependant, de nombreux animaux, y compris tous les vertébrés, ont des lignées cellulaires indéterminées et contrôlent la croissance des tissus par de mystérieux processus de rétroaction qui servent à transformer le programme de croissance codé génétiquement en un organisme fonctionnel tridimensionnel avec tous ses tissus constitutifs et organes de taille appropriée. Pour comprendre ces processus de croissance complexes, il est souhaitable d’imager des tissus ou des organes entiers au fil du temps chez des individus uniques qui peuvent être manipulés expérimentalement par des interventions génétiques, pharmacologiques ou autres au moment de leur choix et dont l’effet est analysé par la suite.
Chaque muscle squelettique des vertébrés a une taille, une forme et une fonction définies, et des interactions bien caractérisées avec les tissus adjacents, tels que les os, les tendons et les nerfs. Certains muscles sont petits, se trouvent juste sous la peau et sont donc de bons candidats pour les études d’imagerie à haute résolution. Comme la plupart des organes, chaque muscle se développe tout au long de la vie embryonnaire, postnatale et juvénile, avant d’atteindre une taille adulte stable. Le muscle, cependant, a également une capacité unique à changer de taille au cours de la vie adulte, en fonction de l’utilisation et de la nutrition18, et cette propriété a un impact majeur sur la forme physique de l’organisme, la performance sportive et la vie autonome. La perte de masse musculaire et de fonction chez les personnes âgées, la sarcopénie, est un problème de plus en plus préoccupant pour les sociétés confrontées à une population vieillissante 19,20,21.
Nous et d’autres nous sommes concentrés sur la croissance de blocs définis de tissu musculaire squelettique dans le corps segmenté des larves de poisson zèbre, en tant que système apparemment fermé contenant plusieurs centaines de cellules dans lequel la croissance, l’entretien et la réparation des tissus peuvent être observés et manipulés 22,23,24,25,26. Bien que certains travaux quantitatifs aient déjà été rapportés 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, aucune méthode détaillée et validée de mesure de la croissance musculaire dans les détails cellulaires chez les organismes vertébrés individuels au fil du temps n’est disponible. Ici, un protocole efficace sur la façon d’effectuer de telles mesures répétées est décrit, ainsi que la validation, et un exemple de son utilisation pour analyser les changements dans la croissance hypertrophique et hyperplasique en réponse à une activité électrique altérée est fourni.

<table><tbody><tr><td>Adhésif, Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Aspirateur d’aérosol&nbsp ;</td><td>-</td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-Agarose</td><td></td></tr><tr><td>, basse température de gélification</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Une fois fondu, conserver à 37oC dans un chauffe-moteur pour rester sous forme liquide pour une utilisation répétée.</td></tr><tr><td>Chauffe-moteur</td><td>Cole-Parmer</td><td>SBH130-BODIPY</td><td></td></tr> <tr><td>FL C5-céramide</td><td>Thermo Scientific</td><td>D3521</td><td>À diluer dans de l’eau de poisson et à utiliser à 5 &micro ; M pour l’incubation pendant la nuit.</td></tr><tr><td>Pinces et fils de crocodile</td><td>-</td><td>-</td><td>-Fiji</td></tr><tr><td>/imageJ</td><td>National Institutes of Health, NIH</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Milieu de poisson, Eau de poisson</td><td>-</td><td>-</td><td>Eau du système de circulation recueillie de l’installation de poisson.</td></tr><tr><td>Milieu de poisson, milieu E3</td><td></td> <td>-</td> <td>E3 est décrit dans The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2 et 0,33 mM de MgSO4 dans de l’eau distillée).</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Leica</td><td>Leica MZ16F</td><td>Un microscope à fluorescence d’autres types devrait également convenir.</td></tr><tr><td>Aiguille de verre</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100-6</td><td>À polir au feu pour éviter d’endommager les embryons lors de la manipulation.</td></tr><tr><td>Stimulateur d’herbe</td><td>Instruments d’herbe</td><td>S88</td><td>Les stimulateurs d’autres types devraient également convenir.</td></tr><tr><td>Kimwipes, Essuie-glaces à tâche délicate</td><td>Kimberly-Clark Microscope à</td> balayage <td>13258179-laser</td><td></td></tr> <tr><td>professionnel (LSM)&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880</td><td>LSM d’autres types devraient également convenir.</td></tr><tr><td>Nunc Cell-Culture Treated, plaque à 6 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> <td>140675-Objective</td></tr><tr><td>, immersion dans l’eau 20&times ;/1.0W</td> Pipette <td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pasteur, graduée 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-0100-Pasteur</td><td></td></tr> <tr><td>Pipette, Micro Fine Tip 1 mL</td><td>Starlab Group</td><td>E1414-1100-Boîte</td><td></td></tr> <tr><td>de Pétri, 60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td>-</td></tr><tr><td>Plasmide, CMV-Céruléen</td><td>Christina L. Hammond (Université de Bristol)</td><td></td><td>Plasmide pCS2+_cerulean_kanR injecté à 25-75 pg au stade unicellulaire.&nbsp ; Référence : Bussman J, et Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. DOI : 10.1242/dev.068080.</td></tr><tr><td>Plasmide, pCS-mCherry-CAAX</td><td>Henry Roehl (Université de Sheffield)</td><td>-</td><td>Pour la transcription in vitro à l’aide du promoteur SP6 (des plasmides contenant d’autres marqueurs de marquage membranaire peuvent être utilisés) ; ARNm coiffé synthétisé à injecter à 100-200 pg au stade unicellulaire.</td></tr><tr><td>Contrôleur d’impulsions&nbsp ;</td><td>Hoefer Scientific Instruments</td><td>PC750-Fer</td><td></td></tr> <tr><td>à souder</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222 ; à dissoudre dans l’eau de poisson et à utiliser à 0,6 mM.</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pince d’horloger, n° 5-</td><td></td><td></td><td>--</td></tr><tr><td>Fil, platine</td><td>Goodfellow</td><td>PT005142/12</td> de <td>0,40 mm de diamètre ; une alternative coûteuse à l’argent.</td></tr><tr><td>Le fil de fer Silver</td><td>Acros Organics</td><td>317730010</td><td>0,25 mm de diamètre (une gamme de diamètres, c’est-à-dire de 0,25 à 0,5 mm, a été testée, ce qui a donné des résultats similaires).</td></tr><tr><td>Poisson-zèbre, myog :H2B-mRFP</td><td>David M. Langenau (Massachusetts General Hospital ; Harvard Stem Cell Institute)-</td><td></td><td>ZFIN nom officiel : Tg(myog :Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.&nbsp ; http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2&nbsp ; Référence : Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yord&aacute ; n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imagerie de l’hétérogénéité des cellules tumorales après transplantation cellulaire chez un poisson-zèbre immunodéficient optiquement clair. Nat Commun. 21 janvier 2016;7:10358. DOI : 10.1038/ncomms10358.</td></tr><tr><td>Poisson-zèbre, &alpha ;-actin :mCherry-CAAX</td><td>Peter D. Currrie (ARMI, Monash University)</td><td>-</td><td>ZFIN nom officiel : Tg(actc1b :mCherry-CAAX), pc22Tg.&nbsp ; http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation : Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, et Currie. Perte de Tropomodulin4 chez le poisson zèbre mutant tr&auml ; GE provoque la formation de bâtonnets cytoplasmiques et une faiblesse musculaire rappelant la myopathie à némaline. Dis Model Mech. 2014 déc. ; 7(12):1407-15. DOI : 10.1242/dmm.017376.</td></tr><tr><td>Poisson-zèbre, &beta ;-actin :HRAS-EGFP</td><td>-</td><td>-</td><td>ZFIN nom officiel : Tg(Ola.Actb :Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2&nbsp ; Citation : Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I et Kimelman D. Visualisation de la morphogenèse dans les embryons de poisson-zèbre transgénique à l’aide du colorant d’ester méthylique BODIPY TR comme contre-coloration vitale pour la GFP. Dev Dyn. février 2005 ; 232(2):359-68. DOI : 10.1002/dvdy.20252.</td></tr><tr><td>Logiciel ZEN</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

Un certain nombre de méthodes peuvent être utilisées pour visualiser des cellules individuelles dans tout le corps de poissons-zèbres embryonnaires, larvaires ou juvéniles vivants. Nous montrons que les poissons vivants avec des membranes plasmiques marquées par fluorescence peuvent être scannés dans un microscope confocal à balayage laser afin de déterminer le volume de tissu musculaire et le nombre de fibres musculaires présentes. Des approches efficaces pour la mesure du nombre et de la taille des cellules chez les animaux vivants au fil du temps sont décrites et validées par rapport à des méthodes de segmentation plus ardues. Des méthodes sont décrites qui permettent le contrôle de l’activité électrique musculaire, et donc contractile. La perte de contractile des muscles squelettiques a considérablement réduit la croissance musculaire. Chez les larves, un protocole est décrit qui permet la réintroduction d’une activité contractile évoquée électriquement. Les méthodes décrites minimisent l’effet de la variabilité interindividuelle et permettront d’analyser l’effet des stimuli électriques, génétiques, médicamenteux ou environnementaux sur une variété de paramètres de croissance cellulaire et physiologique dans le contexte de l’organisme vivant. Un suivi à long terme des effets mesurés d’une intervention définie en début de vie sur les individus peut ensuite être effectué.

Une mesure rapide et précise du volume du somite Une méthode de préparation des échantillons, d’acquisition de données et d’analyse volumétrique qui permet de mesurer rapidement la croissance musculaire chez les larves de poisson zèbre est décrite. La taille des muscles peut être mesurée chez les animaux vivants à l’aide de poissons marqués sur leurs membranes plasmiques avec une GFP ciblée par membrane (β-actine: HRAS-EGFP) ou mCherry (α-actine: mCherry-CAAX). Les larves ont été ane...

La clarté optique est un avantage majeur pour le travail biologique et physiologique cellulaire chez le poisson zèbre. Des méthodes robustes de mesure de la croissance cellulaire chez des animaux individuels sont décrites qui permettent de mieux comprendre comment la croissance des muscles squelettiques et des tissus voisins est intégrée à la croissance du corps entier.

Mesure en temps réel et répétée de la croissance musculaire squelettique chez un poisson-zèbre vivant soumis à une activité électrique altérée

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Notre protocole nous permet d’étudier comment les tissus, tels que les muscles squelettiques, régulent leur taille, ce qui reste une question clé en biologie cellulaire et du développement avec d’importantes implications physiologiques et médicales. Le principal avantage de notre technique est que la croissance cellulaire peut être observée et mesurée chez des animaux vivants in vivo avec un haut degré de précision spatiale et temporelle. Les progrès dans la compréhension de base de la croissance musculaire précoce peuvent mettre en évidence les origines développementales des problèmes musculaires précoces et conduire à la découverte de Novo Therapeutics pour protéger contre la perte musculaire chez les personnes âgées et les patients souffrant de troubles de la fonte musculaire.Préparez 1% de LMA dans un tube de 1,5 millilitre et conservez-le dans un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius pour une utilisation répétée. Choisissez les poissons à monter et anesthésiez temporairement chaque poisson. Pour éviter les chocs thermiques, retirez la partie aliquote LMA du bloc thermique et laissez-la refroidir juste au-dessus.Prenez une boîte de Petri de 60 millilitres qui a été recouverte d’

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre l’enregistrement des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre paralysée en positionnant une micropipette près du ganglion de la ligne latérale et en formant un joint lâche pour la capture du signal. La solution extracellulaire maintient la viabilité neuronale pendant ce processus.

Surveillance des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre immobilisée

Une méthode simple pour enregistrer les potentiels de champ extracellulaires dans le cerveau antérieur larvaire du poisson zèbre est décrite. La méthode fournit une...

Prosencéphale enregistrement électrophysiologique des larves dans le poisson-zèbre

Poisson zèbre sont d'un nouveau système pour la modélisation de maladies humaines du muscle squelettique. Nous décrivons une méthode rapide et efficace pour isoler les fibres musculaires des muscles squelettiques de poisson zèbre embryonnaire et larvaire. Cette méthode produit une préparation de haute densité myofiber approprié pour l'étude de la morphologie unique de fibres de muscle squelettique, la localisation subcellulaire des protéines, et la physiologie des muscles.

Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

mesures de force peuvent être utilisés pour démontrer les changements de la fonction musculaire en raison du développement, les blessures, la maladie, le traitement ou la toxicité chimique. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour mesurer la force lors d'une contraction maximale du poisson zèbre muscles du tronc larvaire.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Le poisson-zèbre est maintenant un outil établi et puissant pour modéliser les dystrophies musculaires, les myopathies congénitales et les maladies neuromusculaires associées. La biréfringence et le comportement d’évasion évoqué par le toucher sont deux tests non invasifs courants utilisés pour déterminer le degré de désorganisation musculaire et de déficience locomotrice des embryons de poisson-zèbre au cours du développement précoce.

Analyse des défauts musculaires squelettiques chez les larves de poisson-zèbre par biréfringence et tests de réponse d’échappement par évocation tactile

Ce document décrit comment un poisson zèbre adulte peut être immobilisé, intubé, et utilisé pour des expériences électrophysiologiques in vivo pour permettre des enregistrements et de la manipulation de l'activité neuronale chez un animal intact.

Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d&#39;Intact poisson zèbre adulte

Les poissons-zèbres sont un excellent modèle pour étudier la fonction musculaire et les maladies. Au début de l’embryogenèse, le poisson-zèbre commence à contracter régulièrement ses muscles, produisant un comportement de nage rythmé, qui est modifié lorsque le muscle est perturbé. Nous décrivons ici un test de réponse et de locomotion évoquée par le toucher pour examiner les performances de natation comme mesure de la fonction musculaire.

Utilisation de la réponse tactile évoqué et Locomotion essais pour évaluer la performance de la fonction musculaire et en Zebrafish

Les protocoles décrits ici permettent d’étudier les propriétés électriques des cellules excitables dans les conditions physiologiques les moins invasives en utilisant des embryons de poisson-zèbre dans un système in vivo associés à un indicateur de tension génétiquement codé (GEVI) basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) exprimé sélectivement dans le type de cellule d’intérêt.

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

La jonction neuromusculaire larvaire du poisson-zèbre est un modèle intéressant pour l’étude de la physiologie synaptique. Il se prête à de nombreuses techniques expérimentales, notamment l’électrophysiologie et l’imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole d’imagerie de la transmission synaptique à l’aide d’une sonde à base de pHluorin sous un microscope à épifluorescence vertical.

Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Découvrez une méthode de mesure en temps réel de la croissance musculaire squelettique chez le poisson-zèbre vivant. Cette technique offre une précision spatiale et temporelle élevée pour étudier la régulation du développement musculaire.

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