Name: Synthèse microfluidique de blocs de construction de microgel pour échafaudage de particules microporeuses recuites (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez la synthèse microfluidique de microgels monodispersés pour échafaudages microporeux en médecine régénérative. Cette méthode permet un contrôle précis de la porosité et améliore l'intégration tissulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier Joe de Rutte et le laboratoire Di Carlo de l’Université de Californie à Los Angeles pour leur aide dans la conception originale du dispositif microfluidique à partir duquel le dispositif signalé a été développé, ainsi que pour leurs premiers conseils dans la fabrication et le dépannage des dispositifs PDMS. Les schémas de figures ont été créés avec Biorender.com.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ce protocole décrit les méthodes de synthèse et de caractérisation des microgels, qui servent de blocs de construction pour les échafaudages de particules microporeuses recuites (MAP). Ce protocole utilise une approche microfluidique à haut débit pour générer de grands volumes de microgels uniformes, ce qui ne peut être réalisé avec d’autres méthodes telles que la microfluidiquefocalisant l’écoulement 1,4,7,9 (monodispéristie élevée, faible rendement), l’émulsion discontinue 6,10 et l’électropulvérisation 5,12 (faible monodispersité, rendement élevé). Avec les méthodes décrites ici, les microgels monodispersés peuvent être fabriqués pour être utilisés dans les échafaudages MAP qui peuvent être utilisés pour une variété d’applications de médecine régénérative (par exemple, l’administration de cellules, la cicatrisation des plaies).
Une étape critique de ce protocole est la création des dispositifs microfluidiques PDMS. Si les dispositifs ne sont pas fabriqués correctement, cela pourrait avoir des effets négatifs en aval sur la formation de microgel et la monodispersité. Il est important de prévenir l’introduction d’artefacts (c.-à-d. bulles, poussière) dans le PDMS avant qu’il ne durcisse, car cela pourrait obstruer les canaux et avoir un impact significatif sur la formation de microgel. Pour atténuer cela autant que possible, il faut utiliser du ruban adhésif pour enlever la poussière, stocker les appareils dans un récipient sans poussière et travailler dans une hotte sans poussière, si possible. Il est également recommandé de stocker les appareils à 60 °C pour obtenir les meilleurs résultats avec le traitement de surface.
Lors du versement des dispositifs PDMS, il est important de maintenir une épaisseur uniforme qui est à peu près égale ou inférieure à la longueur du poinçon de biopsie. Si l’appareil est trop épais, le poinçon de biopsie ne pourra pas pénétrer complètement. Il est également crucial de ne pas déchirer les entrées/sorties de l’appareil PDMS lors du poinçonnage avec le poinçon de biopsie et/ou de l’insertion de la tubulure. Une déchirure dans le dispositif PDMS provoquera une fuite des entrées / sorties, ce qui peut entraîner la perte de la solution précurseur du gel. S’il y a une fuite dans un périphérique PDMS, la meilleure solution est de le remplacer par un nouveau périphérique le plus rapidement possible.
Lors du traitement plasmatique de l’appareil, l’utilisation d’oxygène pur et de traitement au plasma pendant 30 s a produit les meilleurs résultats pour l’adhérence du PDMS à la lame de verre. Si l’appareil ne se lie pas correctement (c.-à-d. que le PDMS peut toujours être soulevé de la lame de verre après le traitement plasma), il faut vérifier que le traitement du plasma fonctionne correctement et que l’appareil et les lames ont été soigneusement nettoyés. Il est également important d’utiliser le traitement de surface silane approprié et, pour de meilleurs résultats, les dispositifs PDMS doivent être traités en surface directement avant utilisation. D’autres méthodes de traitement de surface, telles que le dépôt chimique en phase vapeur, pourraient également être utilisées.
Une autre étape cruciale consiste à utiliser correctement les dispositifs microfluidiques PDMS pour la formation de microgel. Il est recommandé d’utiliser un rapport de débit d’au moins 2:1 (ce protocole utilise un débit d’huile de 6 mL/h et un débit aqueux de 3 mL/h), mais cela peut être réglé pour atteindre la taille de microgel souhaitée. Le pH de la solution précurseur de microgel est également une mesure importante à optimiser pour éviter le colmatage de l’appareil. La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) accélère la formation de thiolate dans la chimie d’addition de type Michael, et les concentrations de PBS utilisées dans ce protocole donnent les meilleurs résultats pour la gélification de microgel dans les dispositifs microfluidiques. Une fois les pompes à seringue démarrées, il peut y avoir des bulles dans les canaux microfluidiques, mais cela devrait s’équilibrer après quelques minutes. Il est recommandé de surveiller la formation de microgel avec un microscope. Si le flux ne ressemble pas à celui de cette vidéo et/ou s’il y a quelques canaux produisant de grosses particules, cela est probablement dû à des problèmes avec l’étape de traitement de surface. La meilleure solution est de remplacer l’appareil par un appareil fraîchement traité en surface.
Si les microgels semblent fusionner, cela peut être dû à une concentration insuffisante de fluorosurfactant. La solution recommandée est d’augmenter le % en poids du tensioactif dans la phase huileuse. Cependant, une limite à l’utilisation de concentrations élevées de tensioactif est qu’il peut être plus difficile à éliminer pendant l’étape de purification. Il est recommandé d’utiliser des appareils microfluidiques une seule fois, mais les dispositifs peuvent être réutilisés s’ils sont rincés avec de l’huile Novec immédiatement après utilisation pour éliminer toute solution aqueuse qui pourrait se geler dans le dispositif et obstruer les canaux. Alors qu’un dispositif microfluidique peut produire un volume de microgels à haut débit (mL/h), ce taux de production peut être mis à l’échelle en utilisant plusieurs dispositifs microfluidiques en parallèle.
L’étape de recuit de l’assemblage de l’échafaudage MAP repose sur l’utilisation d’un photoinitiateur activé par la lumière de polymérisation radicalaire, et le photoinitiateur peut être sélectionné en fonction de l’application souhaitée. Par exemple, le photoinitiateur LAP a des temps de recuit rapides (<30 s) lors de l’utilisation de la lumière UV à ondes longues, ce qui a un impact minimal sur la viabilité cellulaire in vitro14. Cependant, cette longueur d’onde est fortement absorbée par le tissu16 et peut ne pas avoir une efficacité de recuit aussi élevée in vivo qu’in vitro.
L’éosine Y est un autre photoinitiateur activé par les longueurs d’onde visibles (505 nm) et a une pénétration plus profonde dans les tissus, ce qui améliore la capacité de l’échafaudage MAP à être recuit sous les tissus. Cependant, les longs temps d’exposition à la lumière nécessaires au recuit Eosin Y peuvent prolonger l’exposition cellulaire aux radicaux libres et avoir un impact sur la viabilité cellulaire in vitro14. L’utilisation de ces méthodes pour la génération à haut débit de blocs de construction de microgel hautement uniformes accélérera la recherche axée sur les échafaudages MAP et fera progresser les connaissances dans le domaine des matériaux poreux injectables pour la médecine régénérative.

La plateforme d’échafaudage MAP est un biomatériau injectable composé entièrement de microparticules d’hydrogel (microgels) qui fournissent une microporosité à l’échelle cellulaire lorsqu’elles sont réticulées, ce qui permet une migration cellulaire indépendante de la dégradation et une intégration tissulaire en vrac1. En raison de sa capacité à s’intégrer rapidement au tissu hôte et de son immunogénicité intrinsèquement faible, la plateforme d’échafaudage MAP a démontré son applicabilité préclinique à une grande variété de thérapies de médecine régénérative 2,3,4,5,6,7,8,9,10, y compris l’accélération de la cicatrisation des plaies cutanées 1,3 ,11, revascularisation de la cavité cérébrale7, administration de cellules souches mésenchymateuses2 et gonflement des tissus pour traiter l’insuffisance glottique6. Il a également été démontré que la MAP transmet des effets anti-inflammatoires au tissu hôte par le recrutement de macrophages M23 et peut même être réglée pour favoriser une réponse immunitaire Th2 « réparation tissulaire »8. Ces propriétés favorables de la plateforme d’échafaudage MAP lui permettent d’être étendue à un large éventail d’applications cliniques.
Les méthodes précédemment publiées pour générer des microgels pour la formation d’échafaudages MAP comprenaient la microfluidique à gouttelettesfocalisant l’écoulement 1,4,7,9, l’électropulvérisation 5,12 et la filature aérienne avec émulsion discontinue 6,10. La méthode microfluidique par gouttelettes peut produire des particules à forte monodispersité, mais utilise des débits très lents qui produisent de faibles rendements de particules (μL/h). Alternativement, les méthodes d’électropulvérisation et d’émulsion discontinue peuvent produire un volume élevé de particules, mais avec une polydispersité élevée des particules. Ce protocole utilise une méthode microfluidique à haut débit pour produire des microgels avec une population monodispersée, basée sur les travaux de de Rutte et al13. Cette méthode utilise des techniques de lithographie douce pour fabriquer un dispositif microfluidique polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir d’un photomasque, qui est ensuite collé à une lame de verre. La conception du dispositif repose sur une émulsification par étapes pour générer un volume élevé de particules de microgel (mL/h). La monodispersité qui peut être obtenue avec cette méthode offre un contrôle supérieur de la porosité par rapport à d’autres techniques, car les microgels monodispersés peuvent former des échafaudages avec des tailles de pores plus uniformes2.
Les méthodes de synthèse et de caractérisation des microgels individuels qui peuvent servir de blocs de construction pour les échafaudages MAP sont décrites dans ce manuscrit, en particulier en termes de création de microgels constitués d’un squelette PEG avec un groupe maléimide (MAL), qui participe facilement à l’addition efficace de type Michael avec des réticulateurs fonctionnalisés au thiol pour la gélification de microgel. Pour découpler la gélification microgel du recuit d’échafaudage MAP, ce manuscrit décrit également comment synthétiser un macromère de recuit personnalisé publié à14 reprises, MethMAL, qui est un macromère PEG hétérofonctionnel méthacrylamide / maléimide à 4 bras. Les groupes fonctionnels méthacrylamide participent facilement à la photopolymérisation radicalaire (pour le recuit sur microgel), tout en restant relativement inertes aux conditions qui favorisent l’addition de type Michael pour les groupes fonctionnels MAL.
De plus, ce manuscrit décrit les protocoles de création de dispositifs microfluidiques PDMS, de détermination de la cinétique de gélification des microgels et de caractérisation de la taille du microgel. La dernière partie du manuscrit détaille le recuit d’échafaudage MAP, c’est-à-dire lorsque les microgels sont transférés in situ dans un échafaudage en vrac par une étape de réticulation secondaire, photo-initiée, qui lie de manière covalente les surfaces des microgels ensemble. Il est important de noter qu’il existe d’autres méthodes de recuit qui peuvent être mises en œuvre dans les systèmes d’échafaudage MAP qui ne reposent pas sur des produits chimiques à base de lumière, telles que le recuit à médiation enzymatique, comme décrit précédemment1. Dans l’ensemble, ces méthodes peuvent être utilisées directement ou avec différentes chimies de formulation d’hydrogel (par exemple, à base d’acide hyaluronique) pour générer des échafaudages MAP pour n’importe quelle application.

<table><tbody><tr><td>Chlorhydrate de 2-aminoéthanethiol</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>pour la synthèse méthmal MW : 113,61 Da</td></tr><tr><td>Rotor à plaques de 35 mm</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>Géométrie pour viscosimètre HAAKE</td></tr><tr><td>4 bras PEG-Maleimide (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>Pour solution de précurseur de microgel</td></tr> 4 <tr><td>bras PEG-Maleimide (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>Pour la synthèse MethMal Poids moléculaire spécifique à chaque lot</td></tr><tr><td>Seringue BD avec embouts Luer-Lok</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Seringues en plastique jetables</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td>Diamètre 1,5 mm</td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>Pour la synthèse MethMal</td></tr><tr><td>Lumière LED collimatée Source</td><td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Boîte de culture (15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-diméthoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-méthyl-morpholinium chlorure)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>151882</td><td>For MethMal Synthesis MW : 276.72 Da</td></tr><tr><td>Fluorosurfactant</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>5 pour cent en poids de 008- Flurosurfactant en HFE7500</td></tr><tr><td>FreeZone Triad Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7400000 Series</td><td>For MethMal Synthesis Lyophilizer</td></tr><tr><td>Lames en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Lames en verre ordinaire, non revêtues</td></tr><tr><td>HAAKE Viscosimètre Rheowin</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>version 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 Seringue à double griffe Pompe</td><td>Kd Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilote LED</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>Lithium phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>Photoinitiateur</td></tr><tr><td>Acide méthacrylique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>pour la synthèse MethMal MW : 86,09 Da Densité : 1,015g/mL</td></tr><tr><td>Dispositif microfluidique SU8-Si master wafer</td><td>FlowJem</td><td>N/A</td><td>Sur mesure, avec silanisation</td></tr><tr><td>MMP-2 réticulant dégradable</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Séquence : Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>Aiguilles (25 G, biseautées)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Longueur : 15,88 mm Calibre : 0,5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>Huile fluorée</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td></td></tr><tr><td>Compressed Peek tubing</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>Diamètre extérieur de 1/32 po ; Diamètre intérieur de 0,02 po ; Longueur 10'</td></tr><tr><td>PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Pour le traitement de surface</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>Dilué à 1x dans de l’eau ultrapure, pH = 7,4</td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD peptide adhésif cellulaire</td><td>WatsonBio Sciences</td><td></td><td>Séquence : Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin software</td><td>HAAKE&nbsp ;</td><td></td><td>Logiciel compatible avec le viscosimètre HAAKE</td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td><td>Taille : #10</td></tr><tr><td>Manche de scalpel</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>Taille : #3</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>Pour MethMal Synthesis MW : 58.44</td></tr><tr><td>Da Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>DOW Chemical</td><td>2065622</td><td>Base et agent de durcissement</td></tr><tr><td>Triéthylamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td>Pour MethMal Synthesis MW : 101,19 Da Densité : 0,73 g/mL</td></tr><tr><td>Tube Tygon</td><td>Plastiques Saint Gobain Performance</td><td>AAD04103</td><td>ID : 0,51 mm OD : 1,52 mm</td></tr><tr><td>Spectromètre Varian Inova 500</td><td>RMN</td><td></td><td> Situé dans l’installation de résonance magnétique biomoléculaire UVA</td></tr></tbody></table>

synthèse microfluidique de blocs de construction de microgel pour échafaudage de particules microporeuses recuites

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

La plate-forme d’échafaudage à particules microporeuses recuites (MAP) est une sous-classe d’hydrogels granulaires. Il est composé d’une boue injectable de microgels qui peut former un échafaudage structurellement stable avec une porosité à l’échelle cellulaire in situ après une étape secondaire de réticulation chimique à base de lumière (c.-à-d. recuit). L’échafaudage MAP a montré du succès dans une variété d’applications de médecine régénérative, y compris la cicatrisation des plaies cutanées, l’augmentation des cordes vocales et l’administration de cellules souches. Cet article décrit les méthodes de synthèse et de caractérisation des microgels de poly(éthylène glycol) (PEG) comme éléments constitutifs pour former un échafaudage MAP. Ces méthodes comprennent la synthèse d’un macromère de recuit personnalisé (MethMAL), la détermination de la cinétique de gélification des précurseurs de microgel, la fabrication de dispositifs microfluidiques, la génération microfluidique de microgels, la purification de microgel et la caractérisation de base des échafaudages, y compris le dimensionnement des microgels et le recuit d’échafaudage. Plus précisément, les méthodes microfluidiques à haut débit décrites ici peuvent produire de grands volumes de microgels qui peuvent être utilisés pour générer des échafaudages MAP pour toute application souhaitée, en particulier dans le domaine de la médecine régénérative.

Le but de ce protocole est de décrire toutes les étapes nécessaires à la synthèse des blocs de construction de microgel à utiliser dans un échafaudage MAP. Le macromère de recuit MethMAL est très sélectif et efficace et est compatible avec plusieurs squelettes polymères14. Il est important qu’au moins 67 % à 75 % du maléimide PEG de 20 kDa soit modifié avec des groupes fonctionnels méthacrylamide pour assurer une efficacité de recuit élevée. Le pourcentage de modification peut être déterminé plus facilement en analysant les pics de spectres 1 H-RMN, comme le montre la figure 1. La cinétique de gélification, déterminée par un viscosimètre, est une mesure importante à prendre en compte pour chaque formulation de gel. Ce protocole utilise une solution de précurseur de gel constituée d’un squelette PEG avec un groupe MAL, qui réagit efficacement avec des agents de réticulation fonctionnalisés au thiol pour la gélification de microgel. Cependant, de nombreuses chimies d’hydrogel peuvent être utilisées pour fabriquer des microgels via la méthode microfluidique à haut débit décrite ici. Le délai d’apparition de la gélification donnera un aperçu de la durée de la génération de microgel microfluidique. Il est recommandé de choisir un gel précurseur pH qui peut initier la gélification entre 30 min (Figure 2) et 2 h.
Si le temps de gélification est trop rapide, la solution de précurseur du gel commencera à polymériser dans le dispositif microfluidique et obstruera les canaux. De plus, il est important de noter que la modification des concentrations de ligands thiolés (p. ex. RGD) peut avoir des répercussions sur la formation du réseau pendant la gélification et peut devoir être prise en compte en ajustant la formulation. Les étapes de fabrication du dispositif microfluidique peuvent être fastidieuses, mais les résultats représentatifs d’un dispositif collé avec succès sont présentés à la figure 3. Ce protocole utilise un dispositif microfluidique à émulsification par étapes parallélisé à haut débit qui a été adapté d’une conception de de Rutte et al.13, et la fabrication de plaquettes de silicium a été sous-traitée à une société de technologie microfluidique. Cependant, les étapes décrites dans ce protocole peuvent être utilisées avec n’importe quelle conception de dispositif gravée sur un photomasque de plaquette de silicium SU-8. Il est important de noter que la taille des pas des canaux sur le photomasque doit être optimisée lors de la fabrication du dispositif, car elle aura un impact sur la taille des particules de microgel.
Les débits pour la génération microfluidique de microgels doivent être optimisés pour chaque formulation de gel en fonction de facteurs tels que le temps de gélification, la taille de particules souhaitée et la conception du dispositif microfluidique. Si vous utilisez le dispositif à haut débit, les débits de la phase aqueuse peuvent atteindre 5 mL/h. La figure 4B montre la configuration des dispositifs à haut débit utilisés dans ce protocole. Si le dispositif fonctionne correctement, la formation de microgel doit ressembler à celle illustrée à la figure 4D. Avant purification, les microgels seront opaques. Après avoir terminé les différents lavages à l’huile, au PBS et à l’hexane, le gel doit ressembler à l’image représentative de la figure 5. En cas d’incorporation d’un fluorophore dans les microgels, le produit purifié peut avoir une légère teinte colorée mais doit toujours être proche de la translucidité. Après purification et gonflement, les microgels doivent être de taille très uniforme et avoir une DJP comprise entre 1,00 et 1,05, comme le montre la figure 6. Divers photoinitiateurs peuvent être utilisés pour le photorecuit des échafaudages MAP. Si l’on utilise une alternative à LAP, décrite ici, il faut déterminer la cinétique de recuit comme décrit précédemment14. En outre, diverses sources lumineuses peuvent être utilisées pour le photorecuit, à condition que la source lumineuse corresponde au photoinitiateur. Il faut s’assurer de calibrer et de focaliser la source lumineuse. Le temps de recuit et l’intensité lumineuse peuvent devoir être optimisés en fonction de la formulation du gel et de la concentration du photoinitiateur. La méthode de recuit décrite dans ce protocole peut être utilisée pour des études in vitro et in vivo. Après recuit, les microgels formeront un échafaudage poreux qui pourra être visualisé par microscopie à deux photons (Figure 7B-C).

Ce protocole décrit un ensemble de méthodes de synthèse des blocs de construction de microgel pour les échafaudages de particules microporeuses recuites, qui peuvent être utilisés pour une variété d’applications de médecine régénérative.

Synthèse microfluidique de blocs de construction de microgel pour échafaudage de particules microporeuses recuites

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

La fabrication à haut débit de blocs de construction en microgel monodispersé pour les échafaudages de particules microporeuses recuites permet un meilleur contrôle de la porosité de l’échafaudage. Cela peut avoir un impact sur la taille des pores et les résultats ultérieurs de l’intégration tissulaire. Ce protocole utilise une approche microfluidique à haut débit pour générer de grands volumes de microgels monodispersés, ce qui ne peut pas être obtenu avec d’autres méthodes telles que la microfluidique focalisant l’écoulement, l’émulsion discontinue et l’électropulvérisation.Les microgels générés peuvent être transformés en échafaudages de particules microporeux recuits, ce qui est avantageux pour les applications de médecine régénérative en raison de la porosité à l’échelle cellulaire qui permet une croissance rapide des tissus. Commencez par préparer une lame de verre par dispositif microfluidique PDMS. Utilisez du ruban adhésif, de l’air filtré ou des lavages à l’alcool isopropylique pour enlever la poussière de la lame.Placez une lame de verre dans une lame de conception de dispositif PDMS l’une à côté de l’autre sur un couvercle de plaque de 96 puits et placez-la dans un nettoyeur plasma. Fermez la porte et la vanne de débit d’air et allumez la pompe à vide. Laissez-le fonctionner pendant au moins 30 secondes, puis éteignez-le.Connectez le tube de gaz du réservoir d’oxygène à la vanne de débit d’air. Laissez la chambre à plasma se remplir d’oxygène pendant 30 secondes, puis éteignez l’oxygène et fermez la vanne de débit d’air. Allumez la pompe à vide et réglez le niveau de fréquence radio sur élevé.Attendez que la chambre prenne une couleur rose violet et laissez passer 30 secondes. Lorsque la minuterie se déclenche, éteignez le plasma et passez l’aspirateur, puis ouvrez lentement la vanne de débit d’air pour libérer le vide. Retirez le plateau du nettoyeur plasma.Retournez doucement le périphérique PDMS sur la lame de verre pour les coller. Au fur et à mesure que la liaison se produit, observez la légère différence dans la transparence du PDMS. Pour de meilleurs résultats, conservez les appareils collés à 60 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient immédiatement avant utilisation.Préparez le traitement de surface en diluant les PCPP et l’huile Novec et utilisez un millilitre pour trois à quatre appareils. Transférer le volume dans une seringue d’un millilitre et fixer une aiguille de calibre 25. Coupez un morceau de tube Tygon de 10 à 12 centimètres par appareil.Coupez un morceau de tube en PEEK d’environ un pouce de longueur. Insérez quelques millimètres du tube en PEEK à l’extrémité du tube Tygon pour empêcher l’aiguille de percer les entrées du tube Tygon. Retirez les appareils de la chambre chauffée et insérez l’extrémité non PEEK du tube Tygon dans le trou d’entrée aqueux.Insérez l’aiguille de la seringue de traitement de surface dans le tube en PEEK et couvrez le trou de sortie de la chambre d’huile. Injectez le traitement lentement et assurez-vous qu’il remplit l’appareil sans bulles. Attendez que les chambres aqueuses se remplissent en premier, suivies des canaux plus petits, puis de la chambre à huile.Retirez le tube Tygon de l’appareil. Une fois l’appareil rempli, laissez-le reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Remplissez une seringue de cinq millilitres avec de l’huile seulement et fixez une aiguille de calibre 25.Aspirez le traitement de surface hors de l’appareil par les entrées et les sorties. Insérez le tube Tygon dans l’entrée aqueuse. Insérez la seringue avec de l’huile dans le tube en PEEK et rincez chaque dispositif avec de l’huile.Aspirez l’huile hors de l’appareil. Répétez le rinçage de l’huile deux fois et retirez le tube Tygon. Insérez l’extrémité non PEEK du tube Tygon dans les entrées des dispositifs microfluidiques.Insérez le morceau restant de tube Tygon sans tube en PEEK à l’extrémité dans la sortie du dispositif microfluidique. Ajoutez au moins trois millilitres d’huile à une seringue en plastique de cinq millilitres et fixez-la à une aiguille de calibre 25. Insérez délicatement l’aiguille dans le tube en PEEK de l’une des entrées Tygon.Rincez doucement le tube et l’appareil avec de l’huile. Recueillir l’huile de la sortie dans un tube conique. Répétez le rinçage de l’huile sur l’autre entrée Tygon.Réglez les pompes à seringue sur les débits souhaités. Connectez la seringue contenant le surfactant à l’entrée d’huile à l’aide d’une aiguille de calibre 25 et distribuez doucement suffisamment d’huile pour amorcer le tube et le canal d’huile du dispositif microfluidique. Une fois l’appareil et les entrées d’huile configurés, ajoutez 0,5 millilitre d’huile à une nouvelle seringue de cinq millilitres qui contiendra le précurseur du gel.Utilisez cette petite quantité d’huile pour aider à rincer la solution précurseur à travers le dispositif microfluidique. Dans un tube conique, combiner 1,5 millilitre de la solution de squelette PEG et 1,5 millilitre de la solution de réticulation. Vortex pendant 30 secondes et transférer rapidement la solution de précurseur de gel combiné dans la seringue de cinq millilitres.Connectez la seringue avec la solution de précurseur du gel à l’entrée aqueuse à l’aide d’une aiguille de calibre 25. Distribuer doucement suffisamment de solution pour amorcer le tube et le canal aqueux. Fixez les seringues sur les pompes à seringue et appuyez sur Run.Recherchez les particules de taille uniforme dans les canaux. Recueillir les microgels de la sortie dans un tube conique. Une fois la gélification terminée, utilisez une pipette pour retirer soigneusement la phase huileuse du fond du tube.Déposez-le dans un conteneur à déchets approprié pour les déchets fluorés. Ajouter plus d’huile dans le tube de collecte de microgel. Mélanger en retournant doucement le tube de collecte.Laissez le tube de collecte reposer pendant cinq minutes pour permettre aux phases de se séparer. Recherchez la phase huileuse en bas et la phase microgel aqueuse en haut. Répétez les lavages à l’huile au moins deux fois plus.Ajouter plus d’huile avec le gel comme démontré précédemment, puis ajouter PBS au gel. Retourner pour mélanger plusieurs fois. Pour séparer les couches, centrifuger le tube à 2 000 RCF pendant environ 30 secondes.Recherchez la phase huileuse au fond du tube, le gel au milieu et le PBS sur le dessus. Retirez la phase huileuse à l’aide d’une pipette et jetez-la dans un conteneur à déchets. Répétez l’huile et le PBS lavage deux fois.Recherchez le gel pour passer d’opaque à clair avant le lavage final. Retirez toute l’huile. Ne retirez pas le PBS du tube conique.Dans une hotte chimique, utilisez une pipette en verre pour ajouter des hexanes au tube à un volume égal à celui du PBS. Vortex le tube conique pendant 30 secondes ou jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Centrifuger à 4, 696 RCF pendant cinq minutes.Après la séparation, recherchez les hexanes dans la couche supérieure, le PBS au milieu et le gel en bas. Retirez la couche d’hexane et jetez-la dans un récipient pour déchets organiques. Aspirez le PBS.Répétez l’hexane dans les lavages PBS au moins deux fois ou jusqu’à ce que le gel apparaisse presque translucide. Lavez le gel avec du PBS une fois de plus pour éliminer tout résidu d’hexane restant. Centrifuger à 4, 696 RCF pendant cinq minutes et aspirer la couche PBS.Environ 67 à 75 % du maléimide PEG de 20 kilodaltons a été modifié avec des groupes fonctionnels méthacrylamide pour assurer une efficacité de recuit élevée. Le pourcentage de modification a été déterminé en analysant les pics de spectres RMN 1H. Le début de la gélification a donné un aperçu de la durée de la génération de microgel microfluidique.Il est recommandé de choisir un pH précurseur de gel qui peut initier la gélification entre 30 minutes et deux heures. Après purification et gonflement, les microgels avaient une taille uniforme et un indice de polydispersité compris entre 1,00 et 1,02 défini comme une population monodispersée. Après recuit, les microgels ont formé un échafaudage poreux visualisé par microscopie à deux photons.Le collage correct du dispositif PDMS à la lame de verre et le traitement de surface correct de l’appareil sont cruciaux pour obtenir les meilleures performances microfluidiques du dispositif. Cette technique permet de produire rapidement des blocs de construction de microgel uniformes pour former des échafaudages cartographiques qui peuvent être utilisés pour une variété d’applications régénératives in vivo, y compris la cicatrisation des plaies.

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JoVE Journal

Bioengineering

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