Name: Modifications précises de CRISPR-Cas9 dans les cœurs de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Découvrez une méthode CRISPR-Cas9 pour l'édition précise de gènes dans les embryons de poisson zèbre Danio rerio. Ce protocole permet de modéliser le syndrome du QT long et d'évaluer les phénotypes cardiaques.

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Cette recherche a été financée par une subvention de projet des Instituts de recherche en santé du Canada (C.T.T.) et des subventions à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (C.T.T.).

<ol><li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+methods+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Genome editing methods in animal models.</a> Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+genome+editing+technology+in+animal+disease+modeling+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).</li>
<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+fish%2C+big+data%3A+Zebrafish+as+a+model+for+cardiovascular+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease.</a> Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).</li>
<li>Kegel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+using+zebrafish+to+identify+new+genes+involved+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Oligodendrocytes%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination.</a> Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>González-Rosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+cardiac+disease%3A+From+fortuitous+mutants+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine.</a> Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).</li>
<li>Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+editing+of+the+Zebrafish+genome+made+simple+and+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient.</a> Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).</li>
<li>Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+CRISPR%2FCas9-based+knock-in+approaches+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish.</a> Methods. 121-122, 77-85 (2017).</li>
<li>Armstrong, G. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+directed+knockin+of+point+mutations+in+the+zebrafish+tardbp+and+fus+genes+in+ALS+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 11 (3), 0150188(2016).</li>
<li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+modification+by+a+long+ssDNA+template+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish.</a> BMC Genomics. 21 (1), 67(2020).</li>
<li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+zebrafish+models+for+inherited+disorders+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429(2021).</li>
<li>Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+zebrafish+knock-in+reporter+lines+in+the+nefma+gene+by+Cas9-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination.</a> Genesis. 58 (1), 23340(2020).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).</li>
<li>Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock-in+tagging+in+zebrafish+facilitated+by+insertion+into+non-coding+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions.</a> Development. 148 (19), (2021).</li>
<li>Prykhozhij, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+knock-in+of+point+mutations+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Boel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+homology-directed+repair+by+ssODNs+in+zebrafish+induces+complex+mutational+patterns+resulting+from+genomic+integration+of+repair-template+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Tessadori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+CRISPR%2FCas9-based+nucleotide+editing+in+zebrafish+to+model+human+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+generating+somatic+point+mutations+with+germline+transmission+in+the+zebrafish+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).</li>
<li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels. 10 (2), 101-110 (2016).</li>
<li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart%3F+An+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+3.+E.15%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+1%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+KCNH2+gene+mutations+of+type+2+long+QT+syndrome+in+larval+zebrafish+using+microscopy+and+electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography.</a> Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).</li>
<li>Dhillon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+embryonic+and+larval+ECG+measurement+in+zebrafish+for+quantifying+the+effect+of+QT+prolonging+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs.</a> PLoS One. 8 (4), 60552(2013).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+cardiac+conduction+phenotypes+in+developing+zebrafish+larvae%3A+Implications+to+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity.</a> Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).</li>
<li>Hurst, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+optimization+of+tools+for+embryonic+electrocardiograph+recording+for+heart+dysfunction+in+zebrafish%22">Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish</a>. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).</li>
<li>Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+express+an+orthologue+of+HERG+and+are+sensitive+toward+a+range+of+QT-prolonging+drugs+inducing+severe+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).</li>
<li>MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%3A+In+vivo+screening+in+the+zebrafish+to+overcome+complexity+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’ingénierie de modifications génétiques précises à l’aide de CRISPR-Cas9 est remise en question par la faible efficacité des mécanismes HDR et leur détection efficace. Ici, une approche de remplacement d’exons à deux ARNg basée sur CRISPR-Cas9 est décrite qui produit des modifications précises chez le poisson zèbre avec une détection visuelle directe des modifications positives. L’efficacité de cette approche est démontrée en générant des modifications précises dans le gène zkcnh6a . Cet article montre comment ...

Les stratégies d’édition de gènes basées sur CRISPR dans des modèles animaux permettent l’étude des maladies génétiquement héréditaires, du développement et de la toxicologie au niveau de l’organisme entier 1,2,3. Le poisson zèbre fournit un modèle puissant qui est plus proche de l’homme dans de nombreux aspects physiologiques que les modèles cellulaires murins ou dérivés de l’homme4. Un large éventail d’outils et de stratégies génétiques ont été utilisés chez le poisson zèbre pour le dépistage génétique avant5 et inverse6. La cartographie génétique complète et l’annotation chez le poisson-zèbre ont facilité les approches d’édition de gènes en tant que technique principale pour concevoir des knockouts de gènes ciblés (KO) et des knock-ins précis (KI)7.
Malgré cela, la génération de modifications précises du KI chez le poisson zèbre est limitée par le faible rendement et la difficulté d’une détection précise. Bien que les nucléases effectrices de type facteur de transcription (TALEN) aient été utilisées avec succès et optimisées pour les KI8, CRISPR fournit une stratégie d’édition de gènes améliorée avec un ciblage plus simple de l’ARNg. De nombreuses études ont utilisé CRISPR pour générer des KI précis chez le poisson-zèbre 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, bien que ces modifications générées par la réparation dirigée par homologie (HDR) médiée par CRISPR aient tendance à être inefficaces avec un faible succès intrinsèque Taux nécessitant le génotypage comme dépistage primaire 9,10,14,21. Cela démontre la nécessité d’un système KI CRISPR efficace chez le poisson zèbre, ainsi que d’un système fiable à haut débit pour détecter les modifications précises.
L’objectif de cette étude était de décrire une plate-forme pour générer un gène cardiaque précis KI dans les cœurs de poisson zèbre avec une détection simple et à haut débit des modifications réussies. Une approche de remplacement d’exons à deux ARNg basée sur CRISPR-Cas9 est décrite, qui est basée sur une approche TALEN8. Cette approche implique l’excision de la séquence cible à l’aide de guides à deux ARNg et son remplacement par une séquence modèle exogène contenant le KI d’intérêt ainsi qu’un gène rapporteur intronique génétiquement codé (Figure 1). L’intégration d’un rapporteur fluorescent génétiquement codé dans la séquence intronique du gène cible permet la détection efficace des modifications positives. Une plateforme de phénotypage est ensuite décrite pour évaluer la fonction électrique cardiaque chez les larves de poisson zèbre pour la caractérisation non invasive des variantes génétiques associées au LQTS héréditaire, un trouble électrique cardiaque qui prédispose les individus à la mort cardiaque subite.
Ces approches amélioreront l’accès et l’utilisation des modifications du gène KI du poisson zèbre pour modéliser les maladies héréditaires et aborder des questions biologiques et physiologiques, telles que la cartographie des profils d’expression génique et la régulation du développement. Étant donné que les cœurs de poisson-zèbre correspondent mieux aux caractéristiques électrophysiologiques cardiaques humaines que les modèles murins, ils peuvent être particulièrement attrayants en tant que système génétiquement traitable pour la modélisation des maladies cardiaques 7,22,23.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infrastructure</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>Institut</td><td></td><td></td>européen de bioinformatique</tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>Open Source (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Plaque</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm Boîte de Petri VWR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 Caméra</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel EZNA Kit de</td> transcription <td>Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7</td><td>Incubateur Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000</td><td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra Kit de transcription</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000 Spectrophotomètre</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Kit de purification</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinjecteur</td><td>Harvard Appareil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Alimentation de base</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Stéroscope</td><td>Zeiss</td> Wide Mini Sub Cell GT Système d’électrophorèse <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Zebrafish Boîtier Système</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthèse de gènes</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Séquençage</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta ; Cellules compétentes</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR Tampon</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Mélange de nucléotides</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI Endonuclease avec tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI Endonuclease avec tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 Plasmide (XL1 Bleu gélose bactérienne stab)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI Endonuclease avec tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII Endonuclease avec tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 Plasmide (XL1 Bleu Gélose bactérienne stab)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaïne)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 Plasmide (DH5&alpha ; poignardage de gélose bactérienne)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI Endonuclease w/ buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalI Endonuclease w/ buffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase avec tampon</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Tampon</td><td>Sigma</td> Tris Chlorhydrate Sigma <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI Endonuclease avec tampon</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td>Fournisseur</td> de <td>composants</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de recuit (pH 7,5-8,0)</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 Média (pH 7,2)</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM Tampon d’injection MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>(pH 7,5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

modifications précises de crispr-cas9 dans les cœurs de poisson zèbre

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Les courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR) dans des modèles animaux permettent une manipulation génétique précise pour l’étude des phénomènes physiologiques. Le poisson zèbre a été utilisé comme modèle génétique efficace pour étudier de nombreuses questions liées aux maladies héréditaires, au développement et à la toxicologie au niveau de l’organe entier et de l’organisme. En raison du génome du poisson zèbre bien annoté et cartographié, de nombreux outils d’édition de gènes ont été développés. Cependant, l’efficacité de la génération et la facilité de détection des modifications précises à l’aide de CRISPR sont un facteur limitant. Décrit ici est une approche knock-in basée sur CRISPR-Cas9 avec la détection simple de modifications précises dans un gène responsable de la repolarisation cardiaque et associé au trouble électrique, le syndrome du QT long (LQTS). Cette approche à deux ARN à guide unique (ARNg) excise et remplace la séquence cible et relie un gène rapporteur génétiquement codé. L’utilité de cette approche est démontrée en décrivant des mesures phénotypiques non invasives de la fonction électrique cardiaque chez des larves de poisson-zèbre de type sauvage et génétiquement modifiées. Cette approche permet l’étude efficace des variantes associées à la maladie dans un organisme entier. De plus, cette stratégie offre des possibilités d’insertion de séquences exogènes de choix, telles que des gènes rapporteurs, des orthologues ou des éditeurs de gènes.

L’utilisation réussie de cette approche CRISPR de remplacement d’exon à deux ARNG est mise en évidence par l’introduction et la détection simple d’une modification précise pour concevoir la variante associée au LQTS, R56Q, dans le gène zkcnh6a chez le poisson zèbre. La figure 6 montre 3 larves dpf représentatives injectées au stade embryon unicellulaire avec des composants CRISPR comme décrit ci-dessus. La figure 6A montre la présence de l’expression du...

Ce protocole décrit une approche visant à faciliter des modifications précises dans les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un pipeline de phénotypage est présenté pour démontrer l’applicabilité de ces techniques à modéliser une variante génétique associée au syndrome du QT long.

Modifications précises de CRISPR-Cas9 dans les cœurs de poisson zèbre

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Notre protocole fournit un pipeline pour une intégration précise et une détection visuelle simple des modifications CRISPR, ainsi qu’un exemple de phénotypage post-édition. Le principal avantage de cette approche est la facilité de détection des modifications CRISPR, permettant une identification efficace et simplifiée des modifications réussies. Cette approche permet de générer et de caractériser simplement des variantes associées à la maladie chez le poisson zèbre.Ici, nous examinons le syndrome du QT long. Des études de suivi sur les thérapies pharmaceutiques sont alors réalisables à explorer. Commencez par concevoir deux guides d’ARNg pour exciser la séquence du site cible en identifiant l’orthologue du poisson zèbre pour le gène d’intérêt.Utilisez Ensembl pour localiser le site cible dans la séquence génétique d’intérêt, y compris la séquence flanquante de deux kilobases utilisée pour fabriquer le modèle. Utilisez un logiciel de conception tel que CRISPOR et sélectionnez les espèces de Danio rerio et l’enzyme Cas. Pour l’approche à deux sgRNA, choisissez un sgRNA avant l’exon cible et un second sgRNA dans l’intron immédiatement en aval.Assurez-vous que les sgRNA sélectionnés ont une spécificité élevée et une faible liaison hors cible prévue. Utilisez les classements CRISPOR pour identifier les guides avec une liaison hors cible minimale. Identifiez maintenant les sites hors cible potentiels les plus probables pour le génotypage de séquençage de Sanger basé sur la PCR.Après avoir sélectionné les deux sgRNA, obtenir le complément inverse pour chacun, deux oligos complémentaires qui précèdent la mutation et deux oligos complémentaires en aval de la mutation. Ajouter des sites de restriction compatibles sur chaque oligo pour incorporer le guide dans le plasmide de votre choix. Pour l’intégration des séquences guides sélectionnées dans le plasmide DR274, créez un porte-à-faux à l’aide d’un site de restriction BSA1 à cinq nombres premiers et concevez les sites de reconnaissance BSA1 aux cinq extrémités principales des guides.Ensuite, concevez le modèle exogène pour le HDR chez le poisson zèbre en choisissant deux fragments de séquence qui flanqueront le gène rapporteur YFP veineux M logé dans le plasmide PKHR5. Divisez le modèle en deux segments pour l’insérer de chaque côté du gène rapporteur YFP veineux M. Assurez-vous que le site divisé est dans un intron pour éviter de couper la séquence de codage.Incorporer toutes les modifications requises mentionnées dans le manuscrit pour faciliter le clonage dans le plasmide PKHR5. Injecter les embryons au stade unicellulaire environ 40 minutes après la fécondation. Après trois jours de fécondation, anesthésiez la larve de poisson zèbre en la transférant dans une boîte de Petri de 25 millimètres contenant 0,3% MS222 jusqu’à ce qu’elle perde son réflexe d’auto-redressement.Une fois anesthésiée, transférer la larve dans le puits d’une plaque de 24 puits. À l’aide d’un microscope capable de détecter la GFP ou la YFP, dépister la fluorescence du gène rapporteur dans les yeux de la larve. Après avoir capturé les images de la larve, documenter la présence ou l’absence de l’expression du gène rapporteur.Pour confirmer l’exactitude et la précision de l’édition du gène HDR, effectuer le génotypage en anesthésiant d’abord la larve trois jours après la fécondation, comme démontré précédemment, et en isolant l’ADN génomique du clip de queue à l’aide de la méthode du hotshot. Ajouter le clip de queue excisé à 15 microlitres d’hydroxyde de sodium 25 millimolaires et l’incuber à 95 degrés Celsius pendant 20 minutes, puis neutraliser avec 1,5 microlitre d’acide chlorhydrique tris. Centrifuger à 13 800 fois G pendant 30 secondes et conserver le surnageant contenant l’ADN génomique extrait.Récupérer la larve dans un milieu E3 et la remettre dans le système de logement si une étude plus approfondie est prévue. En utilisant l’ADN génomique extrait comme modèle, effectuez un séquençage de Sanger basé sur la PCR des sites cibles et potentiels hors cible. Assurez-vous que la conception de l’amorce sur la cible capture le site de mutation et le site de liaison de l’ARNg le plus proche.Concevoir une amorce de séquençage distincte pour détecter la transition entre le bras d’homologie inséré et le gène cible afin de confirmer l’intégration dans le gène d’intérêt. Concevez des amorces pour séquencer les trois principaux sites potentiels hors cible. Compiler sur et hors cible le génotypage, la fréquence cardiaque, les dimensions péricardiques, le phénotypage ECG et les données génétiques rapporteures identifiables pour chaque poisson zèbre.L’expression du gène rapporteur veineux YFP M a été observée dans les îles, agissant comme un rapporteur positif de l’intégration réussie du modèle. Les poissons porteurs du gène rapporteur se sont avérés avoir l’édition précise G2A qui introduit la variante R56Q dans ZKCNH6A. La mesure des dimensions péricardiques en tant que rapport du contour des yeux est présentée ici.Une tendance de bradycardie avec augmentation de l’œdème péricardique associé aux troubles de la repolarisation cardiaque chez les poissons-zèbres a été observée chez les larves modifiées par le gène R56Q. L’enregistrement ECG d’un cœur de larve de poisson zèbre trois jours après la fécondation est montré ici. L’aspect le plus important de cette approche est la conception de guides, comme c’est souvent le cas dans les procédures CRISPR.Des guides efficaces sont essentiels pour des modifications CRISPR réussies. Des méthodes CRISPR alternatives peuvent être suivies, ce qui permet une plus grande précision ou d’autres fonctionnalités. De plus, de grands gènes peuvent être insérés, tels qu’un complexe d’édition principal fournissant un système d’édition inductible in vivo.

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Manipulations transgéniques et l' édition du génome sont essentielles pour tester fonctionnellement le rôle des gènes et des éléments cis -Informations règlementaires. Voici un protocole de microinjection détaillé pour la génération de modifications génomiques (y compris les constructions fluorescentes Tol2 médiées reporters transgène, TALENs et CRISPRs) est présenté pour le poisson modèle émergent, l'épinoche à trois épines.

Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

Un protocole de microinjection simple et efficace pour l’édition de gène dans des embryons de barbue en utilisant le système CRISPR/Cas9 est présenté. À ce protocole, le guide des ARN et protéine Cas9 étaient micro dans le jaune d’embryons unicellulaire. Ce protocole a été validé par assommant deux gènes immunitaires de barbue.

Microinjection de protéine CRISPR/Cas9 dans des embryons de barbue de rivière, Ictalurus punctatus, pour Gene Editing

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Les auteurs décrivent les approches pour la manipulation des gènes dans le système de modèle évolutionniste Astyanax mexicanus. Trois techniques différentes sont décrites : Tol2 médiée par transgénèse, manipulation ciblée du génome à l’aide de CRISPR/Cas9 et précipitation d’expression utilisant les morpholinos. Ces outils devraient faciliter l’enquête directe des gènes qui sous-tendent la variation entre les formes de surface - et cavernicoles.

Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

Ici, un protocole est présenté pour produire et élever des poissons électriques KNOCKOUT génome CRISPR/Cas9. Les exigences requises en matière de biologie moléculaire, de reproduction et d'élevage pour un gymnotiforme et un mormyride, ainsi que les techniques d'injection pour produire des larves d'indel F0 induites par Cas9 sont décrites en détail.

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Le développement précoce dépend des produits hérités de la mère, et le rôle de bon nombre de ces produits est actuellement inconnu. Ici, nous avons décrit un protocole qui utilise CRISPR-Cas9 pour identifier les phénotypes d’effet maternel en une seule génération.

Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels

Les technologies CRISPR-Cas ont révolutionné le domaine de l’édition du génome. Cependant, trouver et isoler la modification souhaitée de la lignée germinale reste un goulot d’étranglement majeur. Par conséquent, ce protocole décrit une méthode robuste pour dépister rapidement les spermatozoïdes de poisson-zèbre injectés par F0 CRISPR pour les modifications de la lignée germinale en utilisant des techniques standard de PCR, de digestion de restriction et d’électrophorèse sur gel.

Dépistage des spermatozoïdes pour l’isolement rapide des modifications de la lignée germinale chez le poisson zèbre

Ce protocole décrit comment effectuer une édition efficace de la base d’adénine sans limitation PAM pour construire un modèle précis de maladie du poisson zèbre en utilisant zSpRY-ABE8e.

Édition de base efficace sans PAM pour la modélisation des maladies génétiques humaines chez le poisson zèbre avec zSpRY-ABE8e

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Découvrez une méthode CRISPR-Cas9 pour l'édition précise de gènes dans les embryons de poisson zèbre Danio rerio. Ce protocole permet de modéliser le syndrome du QT long et d'évaluer les phénotypes cardiaques.

Modifications précises de CRISPR-Cas9 dans les cœurs de poisson zèbre

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