Name: Évaluation de l’hypersensibilité mécanique induite par une lésion nerveuse chez le rat à l’aide d’un test de douleur opérante orofaciale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez l'évaluation de l'hypersensibilité mécanique chez le rat à l'aide du dispositif OPAD. Cette méthode opérante permet d'étudier la douleur orofaciale neuropathique induite par lésion du nerf infra-orbitaire.

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Cette étude est financée par la Facial Pain Research Foundation.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride et étaient conformes aux normes énoncées dans le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Ici, l’évaluation de l’hypersensibilité mécanique à l’aide de l’OPAD est décrite à l’aide d’un modèle de douleur orofaciale neuropathique chez le rat. Un schéma de la chronologie utilisée dans l’étude est présenté à la figure 1. Toutes les évaluations comportementales ont été effectuées par des expérimentatrices.
1. Animaux
<ol><li>Hébergez les rats Sprague-Dawley femelles (n = 8/groupe, 150-200 g) par paires dans une pièce à température contrôlée (22 °C ± 1 °C) avec un cycle lumière-obscurité de 12 h:12 h. Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum. Gardez les rats dans l’installation pendant 5 jours pour l’acclimatation avant les expériences.</li>
	<li>Effectuer les tests de douleur opérants le même jour de la semaine et à la même heure (9 h-11 h).</li>
	<li>À la fin des expériences, euthanasier les rats par décapitation après anesthésie à l’isoflurane.</li>
</ol>2. Mise en place de l’OPAD
<ol><li>Placez des bacs d’égouttage à lait, des cages en plexiglas et des grilles de sol en métal sur l’OPAD. Fixez le câblage aux cages. Glissez le porte-bouteille sur le poteau métallique à l’arrière de l’appareil.</li>
	<li>Préparez un rapport de 2:1 d’eau au lait concentré sucré comme solution de récompense en ouvrant une boîte de lait concentré sucré et en la versant dans un bécher de 1 L. Ajouter ~600 ml d’eau du robinet à 300 ml de lait. Mélangez d’abord la solution à l’aide d’une cuillère, puis utilisez une barre d’agitation et l’agitateur à plaque chauffante. Ensuite, remplissez les flacons de récompense avec la solution de lait et conservez la solution de lait mère à 4 °C. REMARQUE: Couvrir la solution de lait bouillon avec une pellicule alimentaire en plastique. Réchauffer la solution de lait avant chaque utilisation. La solution de lait de bouillon dans le réfrigérateur peut coaguler après une semaine. Lorsqu’il coagule, il peut obstruer le tube à lécher. Par conséquent, jetez-le et préparez une nouvelle solution mère.</li>
	<li>Placez les bouteilles de lait de récompense sur le porte-biberon et ajustez-les de manière à ce que le bec puisse être atteint par l’animal. Serrez le bouton gauche du support pour fixer le flacon en place.</li>
	<li>Allumez les cages à l’aide de l’interrupteur situé sur le panneau avant.</li>
</ol>3. Mise en place d’un protocole et création d’un fichier d’expérience
Remarque : Tout d’abord, configurez le protocole pour exécuter l’expérience. Le protocole décrit comment le logiciel ANY-maze effectue l’expérience.
<ol><li>Ouvrez le logiciel. Tapez le mot de passe. Cliquez sur Me connecter ou appuyez sur Entrée.</li>
	<li>Cliquez sur Nouvelle expérience vide | Menu Protocole .<ol><li>Sélectionnez le mode que ce protocole utilisera et nommez-le. Sous Appareil, cliquez sur Protocole sans nom, cliquez sur la section Sélectionnez le mode que ce protocole utilisera et, sous Modes spécifiques à l’équipement, sélectionnez Mode de cage mécanique OPAD, puis cliquez sur OK. Ensuite, nommez le protocole (par exemple, OPAD mécanique).</li>
		<li>Ajoutez des cages OPAD.<ol><li>Sous Appareil, cliquez sur Appareil | Ajouter un élément situé en haut du volet Protocole | Nouvelle cage de l’OPAD | Ajoutez toutes les cages OPAD connectées. REMARQUE: Avant d’ajouter les cages, assurez-vous que toutes les cages sont allumées.</li>
		</ol></li>
		<li>Ajoutez des étapes de test d’expérience.<ol><li>Sous Test, cliquez sur Étapes | Première étape et nom Stade (p. ex., jour de référence 1). Tapez 10 min pour la durée de l’essai. Pour ajouter d’autres étapes, cliquez sur Ajouter un élément situé en haut du volet Protocole | Nouvelle étape. REMARQUE: Chaque étape fait référence à la séance où un test est effectué. Par exemple, pour 10 jours de formation, 10 étapes sont nécessaires. La durée de l’essai peut être augmentée ou diminuée en fonction de la conception expérimentale.</li>
		</ol></li>
		<li>Assignez des groupes de traitement.<ol><li>Sous Informations supplémentaires, cliquez sur Groupes de traitement. Cochez Utiliser les groupes de traitement | L’utilisateur affectera manuellement les animaux à leurs groupes. NOTE: Le logiciel référencé (voir le tableau des matériaux) permet également d’assigner les animaux de manière aléatoire ou dans un ordre spécifique. Les expériences peuvent être menées à l’aveugle. Pour afficher les groupes de traitement attribués, décochez Exécuter les expériences à l’aveugle.</li>
		</ol></li>
		<li>Attribuez des identifications d’animaux (ID).<ol><li>Cliquez sur le menu Protocole ; sous Informations supplémentaires, cliquez sur ID de l’animal et cochez Utiliser mes identifiants pour faire référence aux animaux.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Cliquez sur le menu Expérimenter .<ol><li>Tapez un titre d’expérience.</li>
		<li>Nommez les traitements en cliquant sur Afficher les traitements, puis tapez les noms des traitements (par exemple, Traitement 1 : CCI-ION, Traitement 2 : simulacre).</li>
		<li>Ajoutez des animaux et attribuez des traitements et des identifiants d’animaux en cliquant sur Afficher les animaux | Ajoutez des animaux, entrez le nombre d’animaux qui seront testés, puis cliquez sur OK. Attendez que la liste des animaux apparaisse et ajoutez des identifiants d’animaux et des traitements pour chaque rat. REMARQUE : Une liste d’état apparaissant à côté de l’ID de l’animal sera définie sur Normal au début de l’étude. Les animaux peuvent ensuite être retirés du calendrier des tests en changeant leur statut en Retiré ou Supprimé.</li>
	</ol></li>
	<li>Enregistrez le protocole en cliquant sur le menu Protocole | Enregistrez le protocole situé en haut du volet Protocole . Tapez Nom de fichier et mot de passe du logiciel (ANY-maze) et cliquez sur Enregistrer. REMARQUE : Les protocoles enregistrés peuvent être réutilisés pour de nouvelles expériences.</li>
	<li>Enregistrez le fichier d’expérience en cliquant sur Fichier | Enregistrez, tapez le mot de passe du logiciel, puis cliquez sur Enregistrer.</li>
</ol>4. Séances de formation et d’essais de base
REMARQUE: Amenez les rats dans la pièce au moins 15 minutes avant le test si la salle d’essai comportemental se trouve dans le même centre de logement pour animaux. S’ils sont transportés dans une salle d’essai à l’extérieur de l’animalerie, donnez aux rats 1 h pour s’acclimater à la salle.
<ol><li>Avant les enregistrements de référence, entraînez les rats dans les OPAD pendant 2 semaines (5 jours / semaine, 10 minutes / jour) à presser leur visage contre les barres métalliques pour recevoir la solution de lait. REMARQUE : Une image représentative de barres dopées et d’un rat effectuant le test est présentée à la figure 2.</li>
	<li>Configurez l’équipement OPAD.</li>
	<li>Allumez les cages à l’aide de l’interrupteur situé sur le panneau avant. Recherchez la lumière verte sur la cage, ce qui signifie que la cage est prête à tester.</li>
	<li>Double-cliquez sur le fichier d’expérience enregistré pour l’ouvrir. Tapez le mot de passe. Cliquez sur Me connecter ou appuyez sur Entrée.</li>
	<li>Attendez que le menu Tests s’affiche. Sur le côté gauche de l’écran, notez le nombre d’animaux et la cage correspondante (par exemple, l’animal 1 sera testé dans la cage 1), l’étape qui sera exécutée ce jour-là et le statut du test (« prêt »). Sur le côté droit de l’écran, observez le tableau de chaque animal qui montre le nombre de coups de langue et de contacts.</li>
	<li>Observez l’écran des cages qui affiche l’ID de l’animal à tester. Placez chaque rat dans la cage correspondante et appuyez deux fois sur le bouton de la cage. Notez que le voyant vert se transformera en voyant orange une fois le test commencé, et un son d’avertissement se fera entendre à la fin de la session de test.</li>
	<li>Pendant les 2 premiers jours d’entraînement, placez complètement les bouteilles de lait dans la cage pour permettre aux rats de boire du lait sans entrer en contact avec le stimulus.</li>
	<li>Les jours 3 à 8 de l’entraînement, une fois que les animaux commencent à boire, déplacez progressivement les bouteilles vers l’arrière pour encourager les rats à presser leur visage contre les barres à pointes.</li>
	<li>Les jours 9 et 10 de l’entraînement, une fois que les animaux appuient complètement contre les barres à pointes et que le nombre de léchages est constant (un minimum de 500 coups de langue pendant les séances d’essai de 10 minutes), notez l’emplacement de la bouteille de lait pour chaque animal et utilisez cette distance pour les enregistrements de base.</li>
	<li>Après 2 semaines de formation, recueillir des données à partir de la distance de la bouteille de lait notée pendant 5 jours comme référence (10 min/jour).</li>
</ol>5. Induction de la douleur neuropathique orofaciale et évaluation de l’hypersensibilité mécanique
REMARQUE : À la suite des mesures de base, les rats ont subi une chirurgie CCI-ION, qui impliquait une ligature bilatérale de l’ION, comme décrit précédemment20. Les rats témoins ont subi une chirurgie fictive. Aucune analgésie pré ou postopératoire n’a été utilisée dans la procédure car elle peut modifier l’évolution de la neuropathie. ATTENTION : Les déchets d’isoflurane doivent être récupérés dans des bidons de charbon de bois. Les lames et aiguilles de scalpel doivent être éliminées dans les déchets présentant un risque biologique.
<ol><li>Anesthésiez le rat dans la chambre d’induction avec un mélanged’O2 (1 L/min) et d’isoflurane à 4% et maintenez l’état anesthésique avec un cône nasal spécialisé pendant toute la durée de la chirurgie.</li>
	<li>Placez le rat anesthésié sur un établi chirurgical et retenez-le. Maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour les empêcher de se dessécher. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’orteil et commencez la procédure lorsque le réflexe de retrait de l’orteil n’est plus observé.</li>
	<li>Effectuer l’intervention chirurgicale sous un stéréomicroscope. Ouvrez la bouche à l’aide d’écarteurs et rétractez la lèvre à l’aide d’un petit clip.</li>
	<li>Faites une petite incision entre la gencive dorsale et la lèvre à l’aide d’une lame de scalpel (#15). Coupez doucement les tissus mous à l’aide de la pointe de la lame du scalpel pour révéler une branche de l’ION.</li>
	<li>Placez deux ligatures intestinales chromiques (#5-0) autour de l’ION à l’aide d’une aiguille de seringue émoussée et courbée.</li>
	<li>Fermez la plaie à l’aide d’un adhésif tissu.</li>
	<li>Pour la chirurgie fictive, exposer l’ION en utilisant la même procédure, mais ne pas ligaturer le nerf.</li>
	<li>Après la chirurgie, fournissez du chow de rongeur ramolli au lait pendant 2 jours pour encourager l’alimentation et prévenir la déshydratation.</li>
	<li>Testez les rats dans l’OPAD le lendemain de la chirurgie pendant 3 jours consécutifs, puis 3 jours par semaine (p. ex., tous les mardis, jeudis et vendredis) pendant les semaines suivantes jusqu’à ce que le nombre de coups de langue atteigne ses valeurs de référence. REMARQUE: La durée de la sensibilité mécanique induite par CCI-ION peut dépendre du sexe, de la souche du rongeur utilisé et de la performance de l’expérimentateur. Ainsi, il pourrait ne pas être exact d’indiquer une certaine durée pour tester les animaux. Par conséquent, les tests jusqu’à ce que les nombres de léchage atteignent les valeurs de base sont plus précis.</li>
</ol>6. Nettoyage de l’appareil
<ol><li>Lorsque le test est terminé, quittez le logiciel en cliquant sur l’icône x dans le coin supérieur droit et attendez que les données soient enregistrées automatiquement.</li>
	<li>Éteignez les cages à l’aide de l’interrupteur situé sur le panneau avant.</li>
	<li>Débranchez les fils des grilles de plancher métalliques. Retirez et lavez les bacs d’égouttage de lait, les cages en plexiglas, les grilles de sol en métal et les porte-bouteilles avec du savon à vaisselle. Mettez tout sur le séchoir.</li>
	<li>Essuyez les barres métalliques, le dispositif de test et les paillasses de laboratoire en utilisant de l’alcool isopropylique à 70%. REMARQUE: Les instruments doivent être manipulés avec soin. Utilisez des brosses douces pendant le nettoyage des bouteilles de lait et des tubes à lécher. Un équipement sale peut entraîner une accumulation de bactéries.</li>
</ol>7. Analyse des données
<ol><li>Double-cliquez sur le fichier d’expérience pour l’ouvrir.</li>
	<li>Cliquez sur le menu Résultats . Sélectionnez les mesures (c.-à-d. lécher, contacter) ou les jours de test à voir.</li>
	<li>Cliquez sur Texte, graphique ou statistique situé en haut du panneau Résultats pour afficher un rapport de texte, de graphique ou d’analyse statistique.</li>
	<li>Pour voir les données brutes, cliquez sur le menu Données . Cliquez sur Enregistrer en haut du panneau Données pour enregistrer les données sous forme de feuille de calcul ou cliquez sur Envoyer pour les recevoir par courrier électronique.</li>
	<li>Pour modifier ou ajouter d’autres variables à afficher, cliquez sur Sélectionner des données, sélectionnez les mesures, puis cliquez sur Afficher la feuille de calcul.</li>
	<li>Analyse statistique<ol><li>Dérivez automatiquement le nombre de léchages et de contacts et la latence du premier léchage du logiciel et exportez les données du logiciel vers une feuille de calcul.</li>
		<li>Calculer le rapport L/F comme indice d’hypersensibilité en divisant le nombre de coups de langue par le nombre de contacts21,22,23. REMARQUE: Dans cette étude, l’un des rats du groupe simulé a été exclu de l’étude en raison du faible nombre de léchages (<500 léchages) avant la chirurgie.</li>
		<li>Analyser la signification statistique des différences entre L/F, le nombre de licks et les contacts, et la latence au premier léchage via des ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles suivies des comparaisons multiples de Dunnett ou des tests de comparaisons multiples de Šídák, le cas échéant. REMARQUE : P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. Les données ont été présentées sous forme d’erreur moyenne ± type de la moyenne (MEB).</li>
	</ol></li>
</ol>

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John K. Neubert et Robert M. Caudle sont les inventeurs de l’OPAD. Stoelting Co. est le fabricant de l’OPAD, et Richard Mills est un employé de Stoelting. Les frais de publication ont été payés par Stoelting Co. Richard Mills, John K. Neubert et Robert M. Caudle sont les anciens propriétaires de Velocity Laboratories, une société qui fournit des tests comportementaux rémunérés à l’acte à l’aide de tests de douleur opérants.

La douleur déclenchée par une stimulation mécanique inoffensive du visage et de la muqueuse intrabuccale est une caractéristique importante des affections douloureuses orofaciales, y compris la névralgie du trijumeau et les troubles de l’articulation temporo-mandibulaire24,25. Bien que la douleur neuropathique du trijumeau soit cliniquement bien décrite, l’évaluation des comportements nociceptifs neuropathiques chez les rongeurs est difficile. Les tests de douleur mesurant les comportements réflexifs sont les méthodes les plus fréquemment utilisées dans la recherche préclinique sur la douleur. Cependant, le stress lié à l’appareillage de test, l’incapacité d’évaluer l’état affectif et le biais de l’expérimentateur soulèvent des préoccupations quant à l’utilité et à la validité des tests réflexes26.
Cette étude introduit l’évaluation de la sensibilité mécanique dans la région orofaciale des rats, démontrant sa sensibilité à l’ion-CCI à l’aide d’un test de douleur opérant. Le même système opérant peut également être utilisé pour tester la sensibilité mécanique des souris. Il convient de noter que les souches de souris et de rats peuvent présenter des variations dans leur réponse à l’ICC-ION et, par conséquent, les niveaux d’hypersensibilité mécanique peuvent différer. D’après notre expérience, les rats Sprague-Dawley développent généralement une hypersensibilité mécanique stable 2 semaines après le CCI-ION, ils commencent à récupérer 4 semaines après le CCI-ION et, après 6 semaines de CCI-ION, nous constatons une récupération de la chirurgie. 
Dans ce protocole, l’hypersensibilité mécanique a été quantifiée en mesurant le nombre de léchages et les contacts, L/F, et la latence au premier léchage. Les données ont démontré que l’ICC-ION entraînait une diminution de L / F et du nombre de réponses de léchage et une augmentation de la latence à la première réponse de léchage, indiquant que les animaux n’étaient pas disposés à presser leur visage contre des barres à pointes en raison d’une sensibilité accrue à la douleur buccale. 
OPAD est un test de récompense-conflit dans lequel les animaux doivent endurer des stimuli nociceptifs pour accéder à une récompense appétissante. Le comportement de léchage dans le test pourrait être affecté par le comportement appétitif. De plus, dans cette étude, nous avons utilisé des rats qui avaient des poils faciaux. D’après l’expérience antérieure avec des tests de douleur opérants, chez les rongeurs, les souches sans poils sont meilleures pour détecter les contacts faciaux16; Cependant, au moment de la publication, les souches de rats sans poils n’étaient plus disponibles dans le commerce. Cela peut être considéré comme une limitation de l’étude. Comme nous n’avons également utilisé que des rats Sprague-Dawley femelles, il faut s’attendre à des différences liées au sexe et à la souche dans les réponses à la douleur. 
Il y a aussi des étapes critiques pour assurer des résultats optimaux avec le test. Les données de léchage et de contact précises doivent apparaître sous forme de blocs rouges et blancs solides dans le logiciel référencé, respectivement (voir Figure 3). La distance entre les pointes et la bouteille de lait est cruciale pour le succès de l’expérience. Si la pointe de la bouteille de lait est trop avancée, l’animal n’entrera pas en contact avec les pointes et le logiciel n’enregistrera pas correctement les contacts ou les numéros de léchage. Inversement, si la bouteille de lait est trop en arrière, les contacts s’enregistreront, mais l’animal ne pourra pas atteindre le lait. Pendant les séances d’entraînement, les données de léchage peuvent apparaître sous forme de blocs blancs solides, car l’extrémité de la bouteille de lait est trop avancée vers l’avant. Il se transforme en blocs solides rouges une fois que la bouteille de lait est poussée vers l’arrière. Pour une raison quelconque, si les données de léchage commencent à apparaître sous forme de blocs blancs à partir de la distance qui a été notée, pousser un peu le biberon et déplacer le porte-lait légèrement vers le bas / vers le haut pourrait aider. 
Plusieurs points peuvent également être considérés comme des limites du système de douleur opérante orofaciale décrit ici. La formation des rongeurs est nécessaire et prend des semaines. Avant chaque séance de test, une restriction alimentaire est nécessaire chez la souris, mais pas chez le rat. Il a été démontré que les souris non à jeun ont un nombre de léchages faible et incohérent par rapport aux souris à jeun27. Étant donné que le système OPAD est un modèle de récompense-conflit, il peut être affecté par le comportement appétitif des animaux ou par un médicament qui affecte l’appétit. Avoir plusieurs appareils est également avantageux pour réduire le temps global de test des animaux, ce qui pourrait augmenter les coûts. Cependant, les tests de douleur opérante orofaciale sont toujours avantageux par rapport aux tests conventionnels basés sur les réflexes, car ils permettent de tester plusieurs animaux en même temps et limitent l’interaction animal-expérimentateur.
Le conditionnement opérant pendant les états douloureux modifie le comportement humain et animal en fonction de leurs conséquences28. L’utilisation d’un modèle récompense-conflit est donc avantageuse pour évaluer les conditions de douleur, car elle permet aux animaux d’effectuer des réponses opérantes. Ceci est plus pertinent cliniquement parce que les caractéristiques des comportements opérants impliquent l’intention, la motivation et, typiquement, le traitement cortical29. Comme les animaux s’approchent volontairement de la bouteille de récompense et peuvent se retirer librement des barres à pointes à tout moment, cela intègre les centres supérieurs du cerveau et permet d’évaluer les états affectifs-motivationnels liés à la douleur10. Ainsi, les tests de douleur opérants fournissent des données supérieures lors de l’évaluation de la douleur et des analgésiques in vivo. Ils aident également à comprendre les processus nociceptifs dans le système trijumeau, contribuant ainsi à l’avancement du champ de la douleur orofaciale.

La douleur chronique affecte des millions d’Américains chaque année1. Malheureusement, la douleur chronique est difficile à traiter, car les thérapies existantes sont relativement inefficaces pour atténuer la douleur chronique et ont souvent des effets secondaires indésirables avec une utilisation à long terme 2,3,4. Les tests précliniques traditionnels de la douleur, tels que le test de von Frey, reposent sur des résultats réflexifs ou des réponses stimulées par la douleur5. Bien que le test de von Frey soit utilisé depuis des décennies pour mesurer l’allodynie mécanique, il est sensible à plusieurs facteurs de confusion, notamment le biais de l’expérimentateur6. L’utilisation du test de von Frey pour évaluer la douleur orofaciale est également problématique en raison du degré de contention nécessaire pour sécuriser la tête de l’animal afin de tester avec succès la zone faciale, ce qui peut produire des effets de stress indésirables, tels que l’augmentation de la douleur ou, inversement, l’analgésie induite par le stress.
Les comportements stimulés par la douleur sont également susceptibles de résultats faussement positifs7 et ne tiennent pas compte de la composante affective de la douleur, qui fait partie intégrante de l’expérience de la douleur humaine8. Par conséquent, il y a un intérêt croissant pour l’utilisation de modèles de douleur opérants qui évaluent les comportements dépressifs de la douleur qui englobent à la fois les composantes sensorielles et affectives de la douleur pour améliorer le contenu et la validité prédictive dans les tests précliniques. Le test opérant d’évaluation de la douleur orofaciale décrit ici est basé sur un paradigme récompense-conflit 9,10,11. Dans ce test, le rongeur peut choisir entre recevoir un renforçateur positif et se soumettre à un stimulus nociceptif ou renoncer à la récompense et éviter le stimulus nociceptif, contrôlant ainsi la quantité de douleur qu’il ressent. Contrairement aux tests de douleur traditionnels, le test basé sur l’opérant est indépendant de l’expérimentateur et n’est pas sensible aux résultats faussement positifs en raison d’effets sédatifs indésirables.
Les sensations nocives de la tête et du visage sont transmises par les branches ophtalmiques, maxillaires et mandibulaires du nerf trijumeau. Une lésion ou une inflammation du nerf trijumeau augmente la sensibilité des neurones sensoriels aux stimuli thermiques ou mécaniques12,13,14,15. Les tests de douleur orofaciale basés sur les opérants fournissent une mesure automatisée de la douleur orofaciale thermique ou mécanique transmise par le nerf trijumeau chez les rongeurs 11,12,16,17,18. La stimulation par des stimuli non nocifs et nocifs est une distinction importante entre le test de l’allodynie thermique et mécanique et de l’hyperalgésie dans la région orofaciale avec l’OPAD, car ils peuvent représenter des manifestations de différents mécanismes sous-jacents.
Dans le test thermique orofacial, les animaux pressent leur visage contre des thermodes lisses pour accéder à la récompense. Les thermodes peuvent être réglés à différentes températures froides, chaudes et chaudes, permettant ainsi l’évaluation du comportement dans des conditions neutres ou nociceptives. Dans l’essai mécanique orofacial, les animaux pressent leur visage contre des barres à pointes pendant les essais opérants; Comme ces pointes causent un certain niveau d’inconfort, les rongeurs peuvent boire moins lorsque leurs visages touchent les pointes par rapport aux surfaces lisses des thermodes. Ainsi, le test mécanique orofacial opérant peut évaluer l’effet de divers degrés de stimulation nociceptive mécanique. Nous avons déjà démontré que l’OPAD est une méthode utile et fiable pour évaluer la température aiguë9, ainsi que la mécanique aiguë19, la nociception et l’hyperalgésie.
Cet article rend compte de l’utilisation d’une nouvelle version de l’OPAD pour évaluer la nociception mécanique et l’hypersensibilité. De plus, à titre de validation, nous démontrons la capacité de l’ICC-ION à induire une neuropathie chronique qui entraîne une réponse prévisible dans l’OPAD. On détaille également comment utiliser l’OPAD et son logiciel associé pour obtenir et analyser rapidement les données comportementales des rongeurs.

<table><tbody><tr><td>ANY-maze Logiciel de suivi vidéo</td><td>Stoelting</td><td>60000</td><td></td></tr><tr><td>Brosses de nettoyage de bouteilles</td><td>ANY ANY</td><td></td><td>Brosses de différentes tailles pour bouteilles et tubes</td></tr><tr><td>Suture intestinale chromique taille 5-0</td><td>Ethicon</td><td>687-G</td><td></td></tr><tr><td>Savon à vaisselle</td><td>ANY</td><td></td><td>ANY Liquid</td></tr><tr><td>Éponge à vaisselle</td><td>ANY</td><td>ANY</td><td></td></tr> ANY <tr><td>GraphPad Prism version 9.3.1&nbsp ;</td><td>GraphPad Software, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique à plaque chauffante</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H4000-HS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-8440</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td> pivetal <td>Fisher Scientific</td><td>60-001-56</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Dechra</td><td></td><td>Puralube Pommade vétérinaire, pommade ophtalmique à la vaseline</td></tr><tr><td>Système d’appareil d’évaluation de la douleur opérant (OPAD)</td><td>Stoelting</td><td>67500</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td><td></td><td>d’oxygène Serviette en</td></tr><tr><td>papier</td> médical <td>N’IMPORTE QUEL</td><td>N’IMPORTE QUEL</td><td></td></tr><tr><td>Emballage alimentaire en plastique</td><td>N’IMPORTE QUEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polygon Barres d’agitation</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-124</td><td></td></tr><tr><td>Béchers réutilisables en verre Berzelius (1 L)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FB1021000</tr><tr><td>Lame de scalpel #15</td><td>FST</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Système d’anesthésie pour petits animaux</td><td>VetFlo</td><td>VetFlo-1205S</td><td></td></tr><tr><td>Cuillère</td><td>ANY</td><td>ANY</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rats, femelles</td><td>Charles River Laboratories,&nbsp ; États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréo Omano</td><td></td><td>OM2300S-GX4</td><td></td></tr><tr><td>Lait concentré sucré</td><td>Borden&nbsp ;</td><td></td><td>Eagle Brand</td></tr><tr><td>Adhésif pour tissus</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant et pompe à circulation d’eau</td><td>Gaymar</td><td>Modèle TP-500</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’hypersensibilité mécanique induite par une lésion nerveuse chez le rat à l’aide d’un test de douleur opérante orofaciale

Assessment of Nerve Injury-Induced Mechanical Hypersensitivity in Rats Using an Orofacial Operant Pain Assay

La douleur a des composantes sensorielles et affectives. Contrairement aux tests de douleur traditionnels basés sur les réflexes, les tests de douleur opérants peuvent produire des résultats plus pertinents sur le plan clinique en abordant les aspects cognitifs et motivationnels de la douleur chez les rongeurs. Cet article présente un protocole d’évaluation de l’hypersensibilité mécanique à la suite d’une lésion chronique de constriction des nerfs infraorbitaires (CCI-ION) chez le rat à l’aide d’un système de douleur opérante orofaciale. Avant la chirurgie CCI-ION, les rats ont été entraînés avec un dispositif d’évaluation de la douleur orofaciale (OPAD) à boire du lait concentré sucré tout en établissant un contact facial avec les barres métalliques à pointes et le tube à lécher.
Dans ce test, les rats peuvent choisir entre recevoir du lait comme renforçateur positif ou échapper à un stimulus mécanique aversif produit par une rangée verticale de petites pointes en forme de pyramide de chaque côté du trou d’accès à la récompense. Après 2 semaines de formation à l’OPAD et avant la chirurgie CCI-ION, les données de sensibilité mécanique de base ont été enregistrées pendant 5 jours pour chaque rat au cours d’une séance de test de 10 minutes. Au cours d’une session, le système opérationnel enregistre automatiquement le nombre d’activations de bouteilles de récompense (licks) et de contacts faciaux, la durée du contact et la latence jusqu’au premier léchage, entre autres mesures.
Après les mesures de référence, les rats ont subi soit une chirurgie CCI-ION, soit une chirurgie fictive. Dans ce protocole, l’hypersensibilité mécanique a été quantifiée en mesurant le nombre de léchages, la latence jusqu’au premier léchage, le nombre de contacts et le rapport entre les léchages et les contacts faciaux (L/F). Les données ont montré que CCI-ION a entraîné une diminution significative du nombre de léchages et du rapport L/F et une augmentation de la latence au premier léchage, indiquant une hypersensibilité mécanique. Ces données appuient l’utilisation de tests de douleur basés sur des opérants pour évaluer la sensibilité mécanique à la douleur dans la recherche préclinique sur la douleur.

Un exemple de léchage d’un seul rat sur le flacon de récompense et de contacts avec les barres à pointes métalliques au départ et 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après la chirurgie est présenté à la figure 3. Pendant les périodes non nocives, les rats ont généralement de longues séances de consommation d’alcool (p. ex., au départ et au rétablissement après le CCI-ION : semaine 6 sur l’image) et, après l’ICC-ION, le nombre de léchages diminue car ils ne peuvent pas maintenir le contact facial avec les barres enrichies pendant une longue durée (Figure 3A), sans changements significatifs dans les périodes de consommation d’alcool dans le groupe fictif (Figure 3B).
Les rats atteints de CCI-ION ont eu une diminution significative du nombre de léchages jusqu’à 4 semaines après la chirurgie et une augmentation de la latence jusqu’au premier léchage sur la semaine de chirurgie (semaine 0) et 1 semaine après la chirurgie par rapport à la ligne de base. Il n’y a pas eu de changement significatif dans le groupe simulé (Figure 4A,B). L’ICC-ION a entraîné une diminution du nombre de contacts, mais cette différence n’était pas significative (figure 4C). L’ICC-ION a également entraîné une diminution significative du L/F, et la diminution pour le groupe CCI-ION a été supérieure à la diminution pour le groupe fictif (figure 4D).
Ces résultats indiquent que, suite à CCI-ION, les rats montrent moins de comportement de consommation de lait de récompense, et il leur faut un certain temps pour faire le premier léchage, indiquant un comportement nocifensif. Cependant, CCI-ION n’a pas d’impact sur leur désir d’atteindre le lait. De plus, la diminution du L/F chez les rats atteints d’ICC-ION indique une hypersensibilité mécanique, car le L/F est plus élevé dans des conditions non douloureuses.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la conception de l’étude. Abréviations : OPAD = appareil d’évaluation de la douleur buccale; CCI-ION = lésion chronique par constriction des nerfs infraorbitaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig02.jpg"> Figure 2 : Image représentative de barres dopées et d’un rat effectuant le test. Les barres à pointes sont en métal inoxydable. La longueur de la barre entière est de 7 cm. La hauteur des pointes est de 0,3 cm. La distance entre les pointes est de 0,5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig03.jpg"> Figure 3 : Tentatives de contact représentatives et données de léchage d’un seul rat opéré par ICC-ION et simulacre pendant la séance de test standard de 10 minutes au départ et 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après la chirurgie. Abréviations : CCI-ION = lésion chronique par constriction des nerfs infraorbitaires; AS = après la chirurgie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64221/64221fig04.jpg"> Figure 4 : Développement d’une hypersensibilité mécanique après l’ion-CCI chez les rats Sprague-Dawley. (A) Les rats avec CCI-ION (n = 8) ont eu une diminution significative du nombre de léchages jusqu’à 4 semaines après la chirurgie et (B) une augmentation de la latence au premier léchage sur la semaine de chirurgie (semaine 0) et 1 semaine après la chirurgie (**p &lt; 0,01, *p &lt; 0,05: semaines après la chirurgie par rapport à la ligne de base. #p &lt; 0,05 : CCI-ION contre simulacre). Il n’y avait pas de diminution significative dans le groupe simulé (n = 7, p &gt; 0,05). (C) CCI-ION ou chirurgie fictive n’a pas entraîné de changement significatif dans le nombre de contacts. (D) Les rats avec CCI-ION ont montré une diminution significative de L / F la semaine de chirurgie et 3 semaines après et ont montré une tendance à la baisse 2 semaines après la chirurgie. Par rapport aux rats du groupe placebo, cette diminution était significativement plus élevée chez les rats CCI-ION et a commencé 1 semaine après la chirurgie et s’est poursuivie jusqu’à 3 semaines après la chirurgie. Il n’y avait pas de différence significative dans le groupe simulé (**p &lt; 0,01, *p &lt; 0,05 : semaines après chirurgie vs ligne de base. # p &lt; 0,05 : CCI-ION vs simulacre). Dans les graphiques, la ligne rouge représente le groupe CCI-ION et la ligne bleue représente le groupe fictif. Les données sont présentées sous forme de MEB moyen ±. Les différences significatives ont été analysées par ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, suivie des tests de comparaison multiples de Šídák ou de Dunnett, selon le cas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64221/64221fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit l’évaluation de l’hypersensibilité mécanique dans un modèle de douleur orofaciale neuropathique chez le rat à l’aide d’un dispositif d’évaluation de la douleur orofaciale opérant.

Pain has sensory and affective components. Unlike traditional, reflex-based pain assays, operant pain assays can produce more clinically relevant results ...

Le dispositif d’évaluation de la douleur orofaciale, ou OPAD, est un outil précieux pour la recherche préclinique sur la douleur, car il utilise un paradigme de conflit de récompense opérant. Cela englobe la nociception, l’apprentissage et la motivation, qui sont importants dans l’expérience de la douleur humaine et l’amélioration de la validité translationnelle. Un avantage significatif de l’OPAD par rapport aux tests traditionnels basés sur les réflexes est qu’il est entièrement automatisé, ce qui élimine la nécessité de retenir les animaux en prévenant les effets de stress connexes, et il réduit également le biais de l’expérimentateur.Darrice Montgomery, technicien de laboratoire de mon laboratoire, fera la démonstration de la chirurgie CCI du nerf infraorbitaire. Commencez par installer le dispositif d’évaluation de la douleur orofaciale, ou OPAD, en plaçant les plateaux d’égouttage de lait, les cages en plexiglas et les grilles de plancher métalliques. Fixez le câblage aux cages et glissez le porte-bouteille sur le poteau métallique à l’arrière de l’appareil.Ensuite, placez les bouteilles de lait de récompense sur le porte-biberon de manière à ce que le bec verseur puisse être atteint par l’animal. Serrez le bouton gauche du support pour fixer le flacon en place. Ensuite, allumez le panneau avant et allumez les cages.Pour configurer le protocole, ouvrez le logiciel, entrez le mot de passe, puis cliquez sur Log Me On ou appuyez sur Entrée. Cliquez sur Nouvelle expérience vide et sur le menu Protocole. Sous Appareil, cliquez sur Protocole sans nom et sélectionnez le mode que ce protocole utilisera.Sous Modes spécifiques à l’équipement, sélectionnez Mode cage mécanique OPAD et nommez le protocole. Après vous être assuré que toutes les cages sont allumées, ajoutez les cages OPAD en cliquant sur Appareil et Ajouter un élément en haut du volet du protocole, puis sélectionnez Nouvelle cage OPAD et Ajouter toutes les cages OPAD connectées. Pour ajouter les étapes de test d’expérience, accédez à l’onglet Test pour sélectionner les étapes, puis aux onglets Première étape, puis nommez l’étape.Ajouter 10 minutes comme durée du test. Ajoutez d’autres étapes en cliquant sur Ajouter un onglet Élément, puis sur Nouvelle étape. Ensuite, attribuez les groupes en cliquant sur Informations supplémentaires et Groupes de traitement.Vérifiez les groupes de traitement utilisés puis sélectionnez l’option L’utilisateur attribuera manuellement les animaux à leurs groupes. Attribuez des identifications d’animaux en cliquant sur le menu Protocole. Sous Informations supplémentaires, cliquez sur ID de l’animal et cochez l’option Utiliser mes identifiants pour faire référence aux animaux.Définissez l’expérience en tapant le titre de l’expérience avant de cliquer sur Afficher les traitements et de taper les noms des traitements. Ajoutez des animaux et attribuez les traitements et les identifiants d’animaux en cliquant sur Afficher les animaux et Ajouter des animaux. Entrez le nombre d’animaux à tester, suivi de OK.Une fois que la liste des animaux apparaît, ajoutez l’identification de l’animal et le traitement pour chaque rat. Enregistrez le protocole en cliquant sur le menu Protocole suivi de Enregistrer le protocole. Entrez le nom de fichier et le mot de passe du logiciel, puis cliquez sur Enregistrer.Ensuite, enregistrez le fichier d’expérience en cliquant sur le fichier, puis sur Enregistrer, en tapant le mot de passe du logiciel et en cliquant sur l’onglet Enregistrer. Après avoir allumé les cages, recherchez la lumière verte sur la cage indiquant que la cage est prête à tester. Ouvrez le fichier d’expérience enregistré en double-clic.Entrez le mot de passe, cliquez sur Connectez-moi ou appuyez sur Entrée. Sur le côté gauche de l’écran, notez le nombre d’animaux et la cage correspondante, l’étape en cours ce jour-là et l’état des tests. Observez l’identification de l’animal testé sur l’écran de la cage.Placez le rat dans la cage et appuyez sur le bouton de la cage correspondante. Notez que le voyant vert se transforme en voyant orange une fois le test commencé. Assurez-vous que l’animal peut accéder à la bouteille de récompense tout en établissant un contact suffisant avec les pointes mécaniques.Sur le côté droit de l’écran, observez le tableau de chaque animal montrant le nombre de coups de langue et de contacts. Un signal sonore se fait entendre lorsque la session de test est terminée. Placez le rat anesthésié sur un établi chirurgical et retenez-le.Maintenez la température corporelle à 37 degrés Celsius à l’aide d’un coussin chauffant. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour les empêcher de se dessécher. Utilisez la lame de scalpel 15 pour faire une petite incision entre la gencive dorsale et la lèvre.Retirez les tissus mous à l’aide de la lame du scalpel et révélez la branche des nerfs infraorbitaires, ou ION. À l’aide d’une aiguille de seringue émoussée courbée, placez deux ligatures intestinales chromiques 5-O autour de l’ION, puis fermez la plaie à l’aide d’adhésif tissulaire. Les tentatives de contact et les données de léchage d’un seul rat opéré par CCI ION et Sham au cours de la séance de test standard de 10 minutes au départ, et deux semaines, quatre semaines et six semaines après la chirurgie sont présentées ici.Le modèle a révélé que pendant les périodes non nocives, les rats ont de longues séances de boisson. Après la blessure, l’animal ne peut pas maintenir le contact facial avec les barres à pointes pendant une longue durée, ce qui entraîne une diminution du nombre de léchages. Dans le groupe Sham, aucun changement significatif n’a été observé pour la période de consommation d’alcool.Le nombre moyen de léchages entre les rats ioniques CCI et les rats opérés par simulacre au départ n’a montré aucune différence significative. Cependant, CCI ION a significativement réduit le nombre de léchages jusqu’à quatre semaines après la chirurgie et a augmenté la latence pour le premier léchage au cours de la semaine post-opératoire et une semaine après la lésion nerveuse indiquant une hyperalgésie mécanique. Il n’y a pas eu de changement significatif chez les rats opérés par Sham.Lors de l’utilisation de l’OPAD, optimisez la distance de la bouteille de lait et la largeur des pointes. Il est important de garder cela cohérent pour réduire les erreurs lors de la collecte de données.

assessment-nerve-injury-induced-mechanical-hypersensitivity-rats

Research

Recherche

JoVE Journal

Behavior

Comportement

Le modèle du nerf Epargnée blessures animal est décrit ici comme un modèle murin de douleur neuropathique périphérique suivantes dénervation partielle du nerf sciatique par lesioning les branches du tibia et du nerf péronier commun, laissant le nerf saphène reste intacte. Modification du comportement résultant d'allodynie mécanique est quantifiée par des filaments de von Frey.

Les blessures du nerf Epargnée (SNI) Modèle d&#39;allodynie mécanique induite chez la souris

Grâce à la simplicité de la chirurgie et le résultat robuste du comportement, de constriction chronique du nerf sciatique est l'un des modèles animaux pré-éminents de la douleur neuropathique. Dans les 24 heures suivant la chirurgie, hypersensibilité à la douleur est établi et peut être mesurée quantitativement l'aide d'un von Frey esthésiomètre (essais mécaniques) et le compteur analgésie plantaire (essai thermique).

Constriction chronique du nerf sciatique et les essais hypersensibilité à la douleur chez le rat

Cette vidéo présente un protocole chirurgical sur un modèle de rat, détaillant les étapes allant de la préparation de l’anesthésie à l’induction d’une lésion du nerf facial. Ce protocole est utile pour l’étude de la régénération nerveuse et des techniques chirurgicales dans la recherche médicale.

Induire une lésion du nerf facial dans un modèle de rat

Cette vidéo démontre l’induction de la douleur neuropathique orofaciale dans un modèle de rat en ligaturant le nerf infra-orbitaire. Cela entraîne des lésions nerveuses et une inflammation, provoquant une signalisation anormale de la douleur et imitant des conditions de douleur chronique, qui peuvent être utilisées pour étudier le dosage de la douleur orofaciale.

Induction d’une douleur neuropathique orofaciale dans un modèle de rat via des ligatures nerveuses infra-orbitaires

Nous présentons un système opérant conviviale, à haut débit pour l'évaluation des comportements de douleur dans Réveillez-vous, les rongeurs conscients. Le dispositif d'évaluation de la douleur oro-faciale (OPAD) peut évaluer la douleur à travers une récompense / conflit paradigme fournissant ainsi une façon plus humaine de l'essai. Ce protocole d'obtenir des données plus cliniquement pertinentes et translationnelle de rongeurs.

L&#39;utilisation de l&#39;appareil Orofacial d&#39;évaluation de la douleur opérant (OPAD) pour mesurer les changements dans le comportement nociceptif

Un allongement de la durée du repas représente un comportement nociceptif orofacial chez les rongeurs similaire au comportement de garde des humains souffrant de douleur orofaciale. Manger est un comportement qui ne nécessite aucune formation ou manipulation animale, nécessite une participation corticale et n’est pas en concurrence avec d’autres comportements induits expérimentalement, distinguant ce test des mesures réflexes ou opérantes alternatives.

La durée du repas comme mesure des réponses nociceptives orofaciales chez les rongeurs

Ce manuscrit décrit un modèle de rongeur pour étudier la douleur neuropathique du trijumeau. Les méthodes décrites comprennent des interventions chirurgicales pour effectuer une lésion de constriction chronique du nerf infra-orbitaire du rat et des tests comportementaux post-chirurgicaux pour mesurer les changements de comportement spontanés et évoqués qui sont indicatifs d’une douleur persistante et d’une allodynie.

Constriction chronique blessures de orbitaire du nerf de la Rat (ion-CCI) d&#39;étudier trijumeau douleur neuropathique

La chirurgie modifiée est une méthode simplifiée pour le modèle de lésion nerveuse épargnée par la souris ou le rat qui ne nécessite qu’une seule ligature et une incision pour blesser les nerfs péroniers et suraux communs.

Modèle modifié de chirurgie de lésion nerveuse épargnée de douleur neuropathique chez la souris

La ligature partielle du nerf sciatique induit une douleur neuropathique chronique de longue durée, caractérisée par des réponses exagérées aux stimuli thermiques et mécaniques. Ce modèle murin de douleur neuropathique est couramment utilisé pour étudier des thérapies innovantes pour la gestion de la douleur. Cet article décrit en détail l’intervention chirurgicale pour améliorer la standardisation et la reproductibilité.

Ligature partielle du nerf sciatique : un modèle murin de douleur neuropathique chronique pour étudier l’effet antinociceptif de nouvelles thérapies

Les lésions de constriction chronique du nerf infraorbitaire distal chez la souris induisent des changements dans le comportement spontané (augmentation de l’activité de toilettage du visage) et le comportement nocifensif en réponse à la stimulation tactile (hyperréactivité à la stimulation des cheveux de von Frey) qui sont des signes de douleur continue et d’allodynie et servent de modèle pour la douleur neuropathique du trijumeau.

Lésion de constriction chronique du nerf sous-orbitaire distal (DIoN-CCI) chez la souris pour étudier la douleur neuropathique du trijumeau

Découvrez l'évaluation de l'hypersensibilité mécanique chez le rat à l'aide du dispositif OPAD. Cette méthode opérante permet d'étudier la douleur orofaciale neuropathique induite par lésion du nerf infra-orbitaire.

Évaluation de l’hypersensibilité mécanique induite par une lésion nerveuse chez le rat à l’aide d’un test de douleur opérante orofaciale (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation de l’hypersensibilité mécanique induite par une lésion nerveuse chez le rat à l’aide d’un test de douleur opérante orofaciale

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