Optimisation ATAC-Seq pour la recherche en épigénétique du cancer

ATAC-seq nous permet d’identifier l’état des régions ouvertes de chromatine dans le génome, qui est souvent modifié dans les états pathologiques par rapport à l’état normal. Moins d’entrées cellulaires, un protocole simplifié de digestion Tn5, suivi de l’isolement de l’ADN fragmenté et de la préparation de la bibliothèque par amplification PCR et un temps expérimental plus court en font une technique plus avantageuse. La comparaison du paysage épigénétique altéré par ATAC-seq entre les conditions normales et les conditions de la maladie peut faire la lumière sur les éléments régulateurs de la chromatine associés à la maladie et être utile pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Cette technique est facile à réaliser, car elle n’inclut aucune étape expérimentale critique. Pour obtenir des résultats ATAC-seq réussis, il suffit de quelques étapes de normalisation. Pour commencer, transférez 25 microlitres d’une suspension cellulaire contenant un million de cellules par millilitre dans du PBS vers un tube de microcentrifugation de 1,7 millilitre et centrifugez à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez soigneusement le surnageant et ajoutez 25 microlitres de tampon de lyse. Remettez les cellules en suspension en pipitant doucement de haut en bas et incuber sur de la glace pendant cinq minutes. Centrifuger à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter soigneusement le surnageant.

Remettez immédiatement la pastille en suspension dans 25 microlitres de mélange réactionnel Tn5 et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Mélanger la solution toutes les 10 minutes. Ajouter cinq microlitres d’acétate de sodium 3-molaire et 125 microlitres de tampon PB à la solution d’ADN marqué Tn5.

Bien mélanger. Ensuite, placez la colonne de spin dans un tube de collecte de 2 millilitres et appliquez l’échantillon à la colonne de spin. Centrifuger à 17 900 g pendant une minute à température ambiante et éliminer l’écoulement.

Ajoutez un tampon PE à la colonne et faites tourner la colonne. Replacez la colonne de spin dans le même tube de collecte et centrifugez-la pendant cinq minutes pour sécher complètement la membrane. Jetez l’écoulement continu et placez la colonne de spin dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 millilitre.

Éluez les fragments d’ADN avec 10 microlitres de tampon EB et laissez reposer la colonne pendant une minute à température ambiante. Puis centrifuger à 17,900 G pendant une minute à température ambiante pour éluer l’ADN. Configurez la réaction PCR dans des tubes PCR de 200 microlitres et effectuez la première partie du programme d’amplification PCR.

Pour la QPCR en temps réel, préparez le mélange réactionnel PCR en ajoutant cinq microlitres de produit PCR, 0,75 microlitre de SYBR Gold 1 000 fois dilué, cinq microlitres de 2X PCR Master Mix et 3,75 microlitres d’eau sans nucléase. Déterminez le nombre requis de cycles de PCR supplémentaires à l’aide des paramètres d’exécution. Une fois le nombre de cycle déterminé, configurez les PCR avec les cycles supplémentaires calculés précédemment.

Aux produits PCR amplifiés, ajoutez 150 microlitres de billes et incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Placez les tubes sur un support magnétique pendant cinq minutes et retirez délicatement le surnageant. Lavez les billes avec 200 microlitres d’éthanol à 80% et retirez le surnageant.

Retirer complètement l’éthanol et sécher les échantillons à l’air libre pendant 10 minutes à température ambiante. Enfin, re-suspendre avec 50 microlitres de tampon d’élution. Placez le tube sur un support magnétique, puis transférez l’éluat dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 millilitre.

Une comparaison de l’efficacité de la lyse cellulaire à l’aide du bleu de trypan est présentée ici. Les cellules NMuMG ont été traitées avec un tampon hypotonique et un tampon CSK et colorées avec du bleu de trypan. Une efficacité de lyse cellulaire plus élevée a été observée dans les cellules traitées par CSK.

Les bibliothèques ATAC-seq ont été préparées à partir de cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231. Après amplification par PCR, les produits PCR ont été analysés sur un gel d’agarose 0,5X TBE, 1,5% avant et après purification des billes. Les apprêts sont principalement éliminés par la purification initiale des perles.

Les profils de bande d’ADN de l’électrophorèse sur gel d’agarose 1X TAE 1% et d’une électrophorèse automatisée sont également indiqués. SYBR Gold a été utilisé pour visualiser les fragments d’ADN montrés ici. Une piste de navigateur génomique montrant le locus ERS1 est présentée ici.

La couverture génomique des données ATAC-seq dans les cellules T47D est montrée dans cette image. Des amorces d’une publication précédente ont été utilisées et leurs régions cibles sont surlignées en jaune. Un graphique à barres illustrant l’enrichissement de l’amplicon d’amorce dans les bibliothèques ATAC-seq est présenté ici.

Les bibliothèques ATAC-seq ont été préparées par le tampon hypotonique ou un tampon CSK. L’image représentative montre la visualisation du navigateur de génome pour l’optimisation ATAC-seq. Les données ATAC-seq de la condition d’entrée de 25 000 cellules ont montré l’enrichissement le plus élevé de fragments exempts de nucléosomes, tandis que la condition d’entrée de 100 000 cellules présentait les ADN mononucléosomales les plus élevés.

Les traces du navigateur génomique montrant les données ATAC-seq de différents numéros de cellules sont présentées ici. L’analyse de l’annotation du pic HOMER est représentée dans cette image représentative. HOMER a classé chaque pic comme un pic proximal ou distal promoteur.

Le nombre d’entrées cellulaires choisies du tampon de lyse cellulaire et la concentration de l’enzyme Tn5 dépendant du type cellulaire sont les paramètres les plus critiques qui doivent être normalisés. Tn5 fusionné avec la protéine A dans la technique du cut-and-tack est largement utilisé pour identifier le site de liaison à l’ADN d’une protéine d’intérêt en utilisant des anticorps spécifiques à cette protéine d’intérêt.