Utilisation de l’imagerie in vivo pour dépister les phénotypes de morphogenèse chez les souches mutantes de Candida albicans au cours d’une infection active chez un mammifère hôte

La morphogenèse de Candida albicans est déclenchée par une myriade de signaux environnementaux. En étudiant la morphogenèse in vivo, nous déterminons comment l’organisme intègre et répond à tous ces signaux environnementaux. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’étudier la morphogenèse en l’absence de biais ou d’artefacts qui pourraient être introduits à l’aide de systèmes modèles in vitro.

Très peu de gens ont de l’expérience avec les injections intradermiques. Je recommande fortement à quelqu’un de nouveau dans cette technique de contacter son vétérinaire de ressources animales pour obtenir de l’aide pour l’apprendre. Rohan Wakade, un boursier postdoctoral de notre groupe de laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Commencez par préparer l’animal à l’inoculation en nourrissant le chow exempt de chlorophylle pendant au moins sept jours avant l’inoculation. Un jour avant l’injection, prenez une noisette de cellules de Canada albicans d’une colonie à l’aide d’un cure-dent. Inoculer 25 millilitres de YPD et répéter ce processus plusieurs fois pour obtenir des cellules de plusieurs colonies différentes.

Incuber la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius dans un incubateur à agitateur orbital à 175 RPM. Centrifuger un millilitre de culture pendant deux minutes à 500 x g, puis laver la levure trois fois avec un millilitre de DPBS stérile. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de DPBS stérile et diluez la culture entre 1 et 100.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez en conséquence la densité cellulaire. Ensuite, créez l’inoculum pour injection en mélangeant des volumes égaux de la souche référencée et expérimentale. À l’aide d’un coton-tige, appliquez généreusement une crème dépilatoire en vente libre sur la surface interne et externe des deux oreilles d’un animal anesthésié.

Après deux à trois minutes, essuyez doucement l’oreille avec une gaze sèche suivie de tampons de gaze saturés d’eau stérile pour éliminer complètement les résidus de crème dépilatoire. Après avoir stérilisé la surface des oreilles avec de l’éthanol à 70%, mélangez bien l’inoculum en inversant le flacon plusieurs fois ou en le tourbillonnant. Aspirez 20 à 30 microlitres d’inoculum dans une seringue à insuline.

Tenez l’aiguille en position verticale et tapotez doucement la seringue pour vous assurer que l’air dans le canon est en haut. Éjectez soigneusement l’air et l’excès d’inoculum dans le tube d’inoculum ou un tube de déchets afin que le piston soit à la marque de 10 microlitres. Appliquer sur le ruban adhésif double face sur un petit tube en plastique conique ou à fond rond et draper l’oreille sur le ruban, en évitant de déloger le cône nasal d’anesthésie.

En gardant l’aiguille de seringue presque parallèle à la peau et en évitant les grosses veines, insérez la pointe de l’aiguille dans la couche la plus externe de la peau jusqu’à ce que le biseau soit juste couvert et injectez lentement l’inoculum par voie intradermique. Une bonne injection intradermique fera monter une petite bulle dans la peau. Gardez l’aiguille en place pendant 15 à 20 secondes avant de la retirer de l’oreille pour minimiser les fuites.

Conformément aux protocoles institutionnels, marquer la cage avec des étiquettes de risque biologique indiquant que les animaux dans la cage sont infectés par Candida albicans. En utilisant les mêmes cultures lavées que celles utilisées pour préparer l’inoculum, créer une dilution de 1 à 50 cellules dans RPMI 1640, complétée par 10% de chaleur et de sérum bovin fœtal activé et incuber à 37 degrés Celsius avec culbutage pendant quatre heures. Examinez l’échantillon à l’aide d’un microscope.

Comptez au moins 100 cellules, en notant le nombre de cellules de levure et de filamenteuses pour chaque souche. Faites pivoter l’objectif à longue distance de travail et placez une gouttelette de liquide d’immersion sur l’objectif. Abaissez l’objectif pour éviter d’éventuels dommages lors de la pose du bordereau de couverture.

Placez le couvercle numéro 1.5 sur l’ouverture de la scène et collez-le en place. Soulevez l’objectif de sorte que le fluide d’immersion soit en contact avec la lentille de l’objectif et le glissement du couvercle. Fixez un cône nasal d’anesthésie sur la scène du microscope de manière à couvrir complètement le nez de l’animal lorsqu’il est en position pour l’imagerie.

Placez le nez d’une souris anesthésiée dans le cône nasal. Placez une goutte d’eau stérile sur le couvercle au-dessus de la lentille de l’objectif. Ajustez le cône nasal d’anesthésie et positionnez la souris de manière à ce que l’oreille de la souris soit au-dessus de la gouttelette d’eau.

Prenez un autre bordereau de couverture et placez le bord du bordereau de couverture parallèle au corps de la souris, le bord touchant la souris à l’endroit où l’oreille rencontre la tête. À l’aide d’un mouvement de charnière, abaissez le bord libre du couvercle jusqu’à l’étage du microscope. Lorsque le couvercle vient contre l’étage du microscope, il aplatira l’oreille.

Collez solidement le couvercle supérieur pour maintenir juste assez de pression pour maintenir l’oreille à plat et éviter d’attraper les poils ou les moustaches de la souris dans le ruban. À moins qu’un microscope avec une chambre environnementale ne soit utilisé, couvrez vaguement le corps de la souris avec un champ stérile pour maintenir un environnement thermique normal. À l’aide de la lumière blanche, de l’imagerie à grand champ, ajustez le plan de mise au point dans le tissu de l’oreille et concentrez-vous sur les globules rouges qui se déplacent dans les vaisseaux sanguins.

Pour obtenir un rapport signal sur bruit suffisamment fort pour que la morphologie puisse être déterminée pour toutes les cellules du champ de vision, réglez la puissance laser ou la vitesse d’imagerie. Pour éviter les dommages tissulaires, utilisez la puissance laser la plus faible possible. Choisissez un champ de vision avec une formation de filament claire dans la souche référencée et où la plupart des organismes sont suffisamment dispersés pour que leur morphologie puisse être déterminée.

Définissez les plans de mise au point supérieur et inférieur d’une pile Z. Il n’est pas nécessaire de couvrir toute la profondeur de la zone infectée, mais gardez à l’esprit que les organismes situés en haut ou en bas du volume imagé sont généralement exclus de l’analyse. Acquérir des images Z-stack, pseudo colorer chaque canal pour distinguer chaque souche et superposer les canaux.

Enregistrez les images. Utilisez un logiciel d’imagerie pour effectuer une projection maximale de la pile Z dans une image bidimensionnelle. Compter chaque organisme vu dans les images de projection maximale par type de souche et morphologie.

La souche référencée forme rapidement des filaments in vitro. Alors que l’EFG1 Null n’a pas réussi à former les filaments. L’EFG1 Null présente également un défaut de filamentation important in vivo.

Environ 9% des cellules nulles EFG1 se sont développées sous forme de filaments in vivo. De même, la souche mutante CYR1 Null a montré un défaut de filamentation in vitro par rapport à la souche référencée. En revanche, 53% des cellules mutantes nulles CYR1 se sont développées sous forme de filaments in vivo.

Les filaments formés par le mutant CYR1 Null étaient plus courts que la souche référencée. Il est essentiel de garder l’aiguille parallèle à la peau pendant l’inoculation. L’objectif est de placer l’inoculum juste sous la couche externe de la peau.

Cette technique peut également être utilisée avec des souches de souris qui expriment une protéine fluorescente dans les cellules hôtes d’intérêt, ce qui nous permet d’étudier les interactions entre les pathogènes de l’hôte in vivo.