Quantification expérimentale des interactions entre les systèmes d’administration de médicaments et les cellules in vitro : Guide d’évaluation préclinique de la nanomédecine

Ce protocole fournit des données quantitatives sur la façon dont les systèmes porteurs interagissent avec les cellules. Les données quantitatives sont essentielles pour l’ingénierie et l’optimisation. Cela nous permet de passer de questions biologiques oui ou non à combien de questions.

Cette technique est utile pour convertir les résultats de la performance préclinique des porteurs de médicaments, qui étaient qualitatifs, en résultats quantitatifs. Et cela fonctionne même lorsque vous caractérisez votre porteur sur un système différent de celui que vous caractérisez vos cellules. Il peut falloir quelques itérations pour trouver la dilution de porteuse optimale qui se situe dans les plages linéaires ou quantitatives du côté nano.

Prenez votre temps pour trouver les bonnes conditions. Pour commencer, montez la cellule d’écoulement sur le module laser. Rincez lentement la cellule d’écoulement à raison de 0,1 millilitre par seconde avec un millilitre d’eau distillée.

Si des bulles se forment à l’intérieur de la cellule d’écoulement, rétractez partiellement la suspension pour fusionner la bulle avec l’interface air-liquide avant de continuer. Verrouillez ensuite l’ensemble du module laser en place à l’intérieur de l’instrument. Démarrez l’appareil photo à peu près à mi-chemin du rinçage.

Assurez-vous de confirmer que les débris du support sont emportés. Sélectionnez capture pour ouvrir l’onglet Paramètres de capture et cliquez sur Démarrer la caméra. Pilotez le système avec un millilitre d’air.

Si des supports statiques sont visibles à l’écran, nettoyez la cellule d’écoulement conformément aux instructions du fabricant. Préparez les porteurs à l’analyse de suivi des nanoparticules, en vous assurant que les porteurs sont bien suspendus par sonication ou vortex, selon le système de support impliqué. Diluer les supports dans l’eau pour préparer au moins 0,6 à un millilitre de chaque échantillon avec une concentration de support comprise entre 1x10 au septième et 1x10 au neuvième porteur par millilitre.

Retirez le module laser et placez-le à la verticale. Déposez le premier échantillon porteur dans une seringue d’un millilitre et fixez la seringue à l’entrée du tube. Ensuite, chargez soigneusement l’échantillon dans la cellule d’écoulement.

Si des bulles se forment à l’intérieur de la cellule d’écoulement, rétractez partiellement la suspension pour fusionner la bulle avec l’interface air-liquide avant de continuer. Assurez-vous que toute la cellule d’écoulement est remplie de liquide, puis interrompez le chargement. Ajustez la mise au point de la caméra si nécessaire pour visualiser les supports individuels.

Effectuez des réglages de mise au point grossiers avec le bouton rotatif situé sur le côté droit de l’instrument. Effectuez des ajustements plus fins en sélectionnant l’onglet Matériel. Modifiez la mise au point en ajustant le curseur de mise au point.

Pour vous assurer qu’il n’y a pas de sursaturation, sélectionnez le niveau optimal de la caméra en ajustant le curseur dans l’onglet de capture. Si l’instrument est équipé de cet accessoire, chargez la seringue contenant l’échantillon porteur dans la pompe à seringue. Sous l’onglet SOP, sélectionnez la mesure standard pour effectuer cinq captures de 30 secondes chacune.

Entrez le nom du fichier de base et, si vous le souhaitez, ajoutez des informations supplémentaires en cliquant sur le bouton avancé qui ouvrira une boîte de dialogue modale avec différents choix. Appuyez sur créer et exécuter le script et attendez qu’une fenêtre contextuelle apparaisse vous demandant de faire avancer l’échantillon. Si vous utilisez la pompe à seringue, sélectionnez l’onglet Matériel, puis l’onglet Pompe à seringue.

Régler le débit de perfusion souhaité et appuyer sur infuser. Si vous n’utilisez pas la pompe à seringue, avancez manuellement l’échantillon. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez OK pour lancer la capture.

Après chacune des cinq captures, lorsque la fenêtre contextuelle s’il vous plaît échantillon avancé réapparaît, vérifiez que l’échantillon se déplace toujours dans la cellule d’écoulement. Sélectionnez ensuite OK pour procéder à la capture suivante. Dans l’onglet processus, réglez le curseur du seuil de détection entre quatre et huit pour identifier correctement les transporteurs distincts visibles à l’écran.

Vous pouvez ajuster le gain de l’écran pour faciliter la visualisation, cela n’affectera pas l’analyse en aval. Dans la fenêtre contextuelle, appuyez sur OK pour lancer l’analyse du suivi. Surveillez la progression de l’analyse en cliquant sur l’analyse dans un seul onglet d’analyse.

Une fois l’analyse terminée, recherchez une invite de paramètres d’exportation qui s’affiche. Vérifiez que l’option Inclure PDF et inclure le résumé de l’expérience est sélectionnée. Sélectionnez les autres formats d’exportation souhaités.

Dans la section des résultats de l’exportation de données PDF, pour vous assurer que la concentration mesurée est fiable, vérifiez que la concentration de support mesurée est comprise entre 1x10 au septième et 1x10 à la neuvième porteuse par millilitre et vérifiez s’il y a des messages d’erreur ou des messages de prudence sous le résultat de la mesure de la concentration. Répétez la procédure deux fois ou plus avec des dilutions différentes du stock et assurez-vous que la concentration de chaque échantillon se situe dans la plage linéaire de l’instrument. Calculez la concentration du porteur de stock comme décrit dans le manuscrit du texte.

Préparer la solution de fluorochrome libre ou conjuguée aux anticorps comme décrit dans le manuscrit. Calculez la concentration de la solution mère à partir de la concentration, du poids moléculaire et du nombre d’Avogadro comme indiqué dans l’équation. Effectuez ensuite une dilution en série du colorant dans le diluant porteur pour générer des échantillons de courbe standard.

Ajoutez ensuite l’échantillon porteur à la plaque de mesure et mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques. Générez la courbe standard telle que décrite dans le manuscrit textuel. Calculer l’intensité absolue de fluorescence par porteur en divisant la fluorescence apparente par la concentration du porteur.

Configurez le cytomètre en flux pour l’expérience finale de cellule porteuse en déterminant les réglages optimaux de tension PMT dans les canaux appropriés. Exécuter un échantillon témoin négatif où les cellules ne sont pas incubées avec des porteurs pour déterminer la fluorescence de fond. Préparer et remettre en suspension les billes de quantification de cytométrie en flux.

Utilisez le même tampon que celui utilisé pour les échantillons de cellules. Si les populations de billes sont fournies séparément, rassemblez-les. Exécutez le cordon de quantification de cytométrie en flux et les échantillons de cellules porteuses pour déterminer l’intensité de fluorescence par cellule.

Exécutez les billes de quantification du cytomètre en flux pour générer une courbe standard, convertissant l’intensité fluorescente absolue en MFI. Utilisez-le pour calculer l’IMF théorique des transporteurs tel que décrit dans le manuscrit du texte. Exécutez les échantillons de vecteurs de cellules pour déterminer l’intensité fluorescente par cellule de chaque échantillon.

Enfin, calculez le nombre de porteurs par cellule pour chaque échantillon en soustrayant la fluorescence de fond de la fluorescence mesurée de l’échantillon, puis en divisant par la fluorescence par particule. Pour 633 nanomètres de particules de noyau d’acide polyméthacrylique, la concentration et l’intensité fluorescente par porteur étaient directement quantifiables à l’aide du flux du cytomètre. En revanche, les nanoparticules d’oxyde de fer super paramagnétique de 100 nanomètres étaient trop petites pour être détectées individuellement et ont été analysées à l’aide du flux en vrac.

Des billes de quantification marquées ont été utilisées pendant plusieurs jours pour générer des courbes standard sur un cytomètre en flux. La corrélation entre l’IMF mesurée et la valeur MESF des billes de quantification était linéaire et globalement similaire entre les dates mesurées. Des expériences de cours temporels utilisant des cellules HeLa marquées par fluorescence avec des capsules d’acide polyméthacrylique de 235 nanomètres de zéro à 24 heures ont montré une augmentation de l’IMF au fil du temps, indiquant que les capsules s’associaient aux cellules HeLa.

La différence dans la réponse cellulaire apparente aux porteurs était frappante, selon la quantification relative ou absolue. La quantification absolue était indépendante de l’intensité de l’étiquetage et donc plus comparable. Ces techniques sont à la base d’une analyse et d’une comparaison plus approfondies des performances des particules.

Nous sommes enthousiastes à l’idée d’utiliser ces techniques pour paramétrer des modèles mathématiques qui nous permettront de caractériser les performances des particules indépendamment de toute expérience particulière.