Mécanostimulation d’organismes multicellulaires par un système de compression microfluidique à haut débit

Ce protocole explique comment fabriquer et utiliser les technologies microfluidiques pour tirer parti des avantages expérimentaux en termes de débit d’échantillons, de manipulation automatisée et de capacité à appliquer avec précision des contraintes mécaniques tout en visualisant simultanément des échantillons. Cette technique minimise la manipulation manuelle des organismes biologiques multicellulaires, tels que les embryons et les organoïdes, pour leur immobilisation, leur alignement et leur imagerie en direct. Il permet également de leur appliquer une compression mécanique pour les études de mécanobiologie.

La fabrication de moules avec des caractéristiques de rapport d’aspect élevé pour cette puce microfluidique peut être difficile avec les techniques de microfabrication conventionnelles. Les conseils expliqués dans cet article vidéo peuvent surmonter ces défis. Pour commencer, nettoyez d’abord la plaquette de silicium avec de l’acétone, puis avec de l’alcool isopropylique.

Placez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 250 degrés Celsius pendant 30 minutes. pour la déshydratation, cuire. Enduire la plaquette de silicium d’hexaméthyldisiloxane dans un four à vapeur.

Placez une bouteille de SU-8 2100 Photoresist dans un four à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes pour réduire sa viscosité. Versez un millilitre de la résine photosensible chauffée pour chaque pouce de plaquette de silicium placée sur la plaque chauffante jusqu’à ce que la résine photosensible couvre la majeure partie de la surface. Appliquez d’abord le pré-spin à 250 rotations par minute pendant 30 secondes, puis à 350 rotations par minute pendant 30 secondes supplémentaires, les deux avec une accélération de 100 tr / min par seconde.

Ensuite, appliquez d’abord une rotation à 500 rotations par minute pendant 15 secondes avec une accélération de 100 tr/min par seconde, puis à 1 450 rotations par minute pendant 30 secondes avec une accélération de 300 tr/min par seconde. Retirez le cordon de bord avec un écouvillon de salle blanche et vaporisez de l’acétone sur la plaquette pour éliminer les imperfections et favoriser un revêtement uniforme. Exposez la plaquette de silicone à une lumière UV de 350 millijoules par centimètre carré à travers le masque photo.

À l’aide de la gouttière du masque de contact, appliquez la cuisson post-exposition sur la plaquette de silicium et laissez-la refroidir à température ambiante. Placez le bécher à l’intérieur d’un autre bécher plus grand et remplissez le plus grand bécher avec une nouvelle solution de révélateur. Placez un treillis métallique sur le bécher.

Placez la plaquette de silicium sur le treillis métallique à l’envers. Laissez la plaquette de silicium immergée dans le révélateur pendant 30 minutes avec l’agitateur allumé. Transférez la plaquette de silicium dans un sonicateur à bain à ultrasons rempli du révélateur frais pendant une heure à 40 kilohertz.

Ensuite, retirez la plaquette du bécher et lavez-la avec une nouvelle solution de révélateur. Préparez la solution PDMS prédurcie en mélangeant la base PDMS avec l’agent de durcissement dans un rapport de 10 pour un. Dégazer le mélange en le plaçant dans une centrifugeuse pendant 500 g pendant cinq minutes à température ambiante.

Versez le PDMS prédurci sur une plaquette de silicium et dégazez-le à nouveau. Enfin, placez le PDMS non durci dans un four à 60 degrés Celsius pour le durcissement. Utilisez un scalpel pour couper les bordures de la région PDMS durcie correspondant à la géométrie de la puce microfluidique.

Percez les trous d’entrée et de sortie du PDMS à l’aide d’un poinçon de biopsie ou d’une aiguille avec une pointe émoussée. Placez le PDMS sur la lame de verre avec sa surface à motifs orientée vers la lame de verre après le traitement au plasma pour sceller les microcanaux par liaison covalente. Permettre aux mouches adultes de l’Oregon-R de pondre des œufs sur des assiettes de gélose au jus de pomme et recueillir les plaques au moment de développement souhaité après la ponte pour l’expérience donnée.

Inonder la gélose avec un lavage d’œuf embryonnaire et agiter doucement les embryons avec un pinceau pour les déloger de l’agar. Transférer les embryons dans une solution d’eau de Javel à 50% pendant 90 secondes, en remuant de temps en temps. Filtrer les embryons à travers un tamis à tissus et laver soigneusement la solution d’eau de Javel avec de l’eau.

Transférer les embryons dans une boîte de Petri en verre de 90 millimètres avec suffisamment de lavage d’œufs d’embryons pour couvrir complètement les embryons. Examiner les embryons avec transillumination sur un microscope à dissection et sélectionner des embryons du stade de développement souhaité pour les charger dans le dispositif microfluidique. Amorcez les sept microcanaux embryonnaires en les remplissant de 0,4 micromètre d’IPA filtré à travers l’orifice d’entrée principal de l’embryon.

Remplacez l’IPA par 0,4 micromètre d’eau désionisée filtrée. Remplacez ensuite l’eau DI par une solution de lavage d’œufs d’embryons. Prélever environ 100 embryons présélectionnés dans la boîte de Petri en verre à l’aide d’une pipette en verre.

Ensuite, pipeter les embryons dans l’orifice d’entrée de l’embryon et appliquer environ trois PSI à l’entrée de gaz à l’aide d’une pompe à vide portable pour ouvrir les microcanaux embryonnaires. Ensuite, inclinez la puce microfluidique vers le bas pour que les embryons s’alignent automatiquement et se déposent dans les microcanaux embryonnaires. Si les entrées du microcanal embryonnaire sont obstruées par plusieurs embryons entrant simultanément, inclinez la puce microfluidique vers le haut, puis à nouveau vers le bas pour éliminer le colmatage.

En fonction du débit requis, introduisez jusqu’à 300 embryons dans les microcanaux embryonnaires. Une fois le chargement embryonnaire terminé, retirez le vide pour immobiliser les embryons. Inclinez ensuite la puce microfluidique vers la position horizontale.

Connectez une source de pression positive portable avec manomètre à l’entrée de gaz pour appliquer trois compressions PSI. Si des expériences d’imagerie en direct doivent être menées sur les embryons stimulés mécaniquement, placez la puce microfluidique sur un support de lame en verre standard au stade du microscope avec l’entrée de gaz connectée à la source de pression. Examiner les embryons au microscope fluorescent à l’intérieur des canaux microfluidiques.

Une fois l’expérience de compression terminée, les embryons peuvent être collectés pour une analyse en aval. Pour ce faire, appliquez d’abord le vide sur l’entrée de gaz pour libérer les embryons. Ensuite, inclinez la puce microfluidique vers le haut pour que les embryons se déplacent vers le bas vers le port d’introduction de l’embryon.

Recueillir les embryons de la puce microfluidique à l’aide d’une pipette en verre. La fonctionnalité du dispositif microfluidique a été déterminée expérimentalement en chargeant des embryons de drosophile dans les canaux de compression et en appliquant une pression positive aux canaux gazeux. Les embryons ne subissent pas de compression significative sous vide ou dans des états de pression neutre.

Ils sont comprimés lorsqu’une pression positive est appliquée. Les mesures de la largeur décroissante des embryons au microscope montrent comment la pression du gaz peut être utilisée pour obtenir un niveau de compression cible. Les dispositifs microfluidiques ainsi fabriqués permettent la stimulation chimique d’échantillons immobilisés.

La stimulation permet une imagerie spatio-temporelle élevée. Une question fondamentale en biologie du développement est de savoir comment les forces mécaniques régulent-elles l’expression des protéines et des gènes au cours du développement. Cette technologie nous permet d’appliquer une stimulation mécanique à un grand nombre d’embryons à la fois, de sorte que nous pouvons isoler des quantités suffisantes de protéines et d’ARN pour effectuer des expériences comparatives de protéomique ou de transcriptomique.

Cela permettra aux chercheurs d’en apprendre davantage sur les protéines et les gènes sensibles aux forces mécaniques.