Préparation d’une suspension cellulaire non cardiomyocytaire pour le séquençage d’ARN unicellulaire à partir d’un cœur de souris adulte post-infarctus du myocarde

Notre protocole garantit à la fois la viabilité cellulaire et l’efficacité d’isolation de la suspension monocellulaire à des coûts relativement faibles. Les coûts et les exigences relativement faibles en matière d’équipement de laboratoire sont les principaux avantages de cette technique. Le séquençage unicellulaire révèle l’hétérogénéité des non-cardiomyocytes dans la physiopathologie cardiaque et fournit également des idées pour des études fondamentales et cliniques sur les maladies cardiaques.

Ce protocole peut être utilisé dans ces études sur l’environnement cardiovasculaire post-MI tel que l’implication des cellules immunitaires. Pour les premières préparations, je suggère qu’une attention particulière soit accordée à la pepsine de l’échantillon et au temps de digestion. Une fois les tampons et les solutions préparés comme décrit dans le manuscrit, placez une souris euthanasiée qui a eu un infarctus du myocarde deux semaines plus tôt en décubitus dorsal sur la table chirurgicale.

Fixez ses membres postérieurs à l’aide de ruban adhésif. Pour exciser le cœur, vaporisez le corps avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision verticale à travers la peau abdominale et les muscles tout en évitant le foie.

Sans perforer le cœur, ouvrez soigneusement le thorax et abondez le ventricule gauche avec une solution de PBS pré-refroidie jusqu’à ce que le liquide de perfusion soit incolore. À l’aide de forceps, soulevez doucement le cœur et coupez l’excès de tissus attachés à son extérieur avec des ciseaux ophtalmiques. Placez le cœur dans un millilitre de PBS pré-refroidi dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Transférer le cœur dans un puits d’une plaque de 24 puits placée sur de la glace. Pipet 150 microlitres du tampon de dissociation cardiaque dans le puits, et couper le cœur en morceaux d’un millimètre à l’aide de ciseaux. Transférer le tissu cardiaque haché dans un tube centrifuge de 15 millilitres contenant cinq millilitres de tampon de dissociation tissulaire.

Placez le tube dans un agitateur alternatif thermostatique. Versez la suspension de haut en bas 10 fois toutes les 20 minutes. Pour éliminer les touffes et les tissus non digérés, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres à l’aide de 25 millilitres de tampon de lavage cellulaire.

Rincer le tube de centrifugation et la crépine cellulaire. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres pour éliminer les autres amas de cellules. Centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 300 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Remettez l’échantillon cellulaire en suspension dans cinq volumes de tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Maintenant, ajoutez quatre volumes du tampon de lavage cellulaire dans la suspension cellulaire et la centrifugeuse comme démontré précédemment. Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres du tampon de lavage cellulaire et centrifugez à nouveau.

À la fin de la centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de tampon de lavage cellulaire. Prenez 18 microlitres de la suspension dans un autre tube centrifuge et ajoutez deux microlitres de solution de coloration à l’iodure de propidium d’orange acridine. Ajouter 10 microlitres de cette solution colorée dans une lame de chambre de comptage.

Évaluez le nombre de cellules et leur viabilité à l’aide d’un compteur automatique de cellules. Des fragments cellulaires ont été observés dans la suspension cardiaque unicellulaire. Le tri cellulaire activé par fluorescence a effectivement réduit la proportion de fragments cellulaires et l’agglutination cellulaire, ce qui a entraîné une diminution de la taille moyenne des cellules.

Le séquençage de l’ARN a prouvé une séparation évidente de sept types de cellules immunitaires, comme le démontrent le regroupement non supervisé et la réduction de l’incorporation stochastique des voisins distribués en T. Chaque cellule immunitaire a montré une expression élevée de marqueurs classiques. Le tissu cardiaque doit être coupé suffisamment petit pour éviter une digestion incomplète, ce qui entraîne de nombreuses bosses cellulaires dans la suspension cellulaire.

La suspension unicellulaire obtenue par ce protocole peut être appliquée en continu dans l’analyse en flux de culture cellulaire primaire. Ce protocole profite aux études sur le microenvironnement de l’infection myocardique, ce qui peut aider les chercheurs à regarder au-delà des tissus cardiaques et à considérer l’infection myocardique comme un problème systématique.