Macro-imageur à vie de fluorescence pour applications biomédicales

Notre protocole fournit une cartographie 2D détaillée de la durée de vie de la phosphorescence et de la concentration d’oxygène dans les objets macroscopiques, en particulier les tissus animaux vivants et les animaux entiers, au moyen de sondes et de matériaux de détection dédiés. Cette information est importante pour de nombreux domaines de recherche. Notre protocole utilise un module d’imagerie intégré et compact qui fonctionne en mode TCSPC et fournit une visualisation facile et précise de la durée de vie et de la distribution de l’oxygène dans des échantillons biologiques complexes, tels que les tissus vivants.

Prenez l’adaptateur Cricket et inspectez-le de différents côtés. Retirez l’adaptateur de monture C de la face avant pour montrer l’intensificateur de PP0360EF Photonis logé dans le Cricket, puis remettez l’adaptateur de monture C. Retirez l’adaptateur de monture C de la face avant du Cricket et insérez le filtre d’émission 650 plus / moins 50 nanomètres.

Réparez-le en remettant la monture C. Ensuite, connectez le module de caméra à trois cames TPX à l’arrière du module Cricket via leurs adaptateurs annulaires. Connectez l’objectif à l’avant du module Cricket via l’adaptateur de monture C.

Connectez la LED à une alimentation et à un générateur d’impulsions. Maintenant, montez la LED super lumineuse de 390 nanomètres sur un poteau attaché à une breadboard à l’intérieur de la boîte noire. Allumez la LED et concentrez-la pour assurer une excitation efficace et uniforme de l’échantillon à imager.

Montez l’ensemble caméra sur le dessus de la boîte noire optique vers le bas vers la scène où les échantillons seront imagés. Connectez la caméra et la LED à des générateurs à deux impulsions et à un oscilloscope à quatre canaux. À l’aide des réglages de l’oscilloscope et des générateurs d’impulsions, synchronisez les impulsions envoyées à la caméra et à la LED.

Utilisez le câble spécial et la prise de l’unité Cricket pour connecter l’intensificateur à une alimentation standard et régler le gain à 2,7 volts. Placez l’échantillon devant l’objectif de la caméra. Ensuite, allumez la caméra et tous les modules électriques, à l’exception de l’intensificateur.

Activez le logiciel SOFI pour régler les paramètres opérationnels, tels que la mise au point et l’alignement des échantillons. Dans les modules, définissez l’exposition de l’image sur 0,01 seconde. Sélectionnez Images infinies et définissez le mode de fonctionnement des pixels sur le dépassement du seuil.

Ensuite, allez dans Aperçu et sélectionnez Module actif pour ouvrir la fenêtre des images Medipix / Timepix. À l’étape suivante, après avoir démarré l’enregistrement, ajustez l’échelle de couleurs et faites pivoter l’image dans l’orientation souhaitée. Après cela, éteignez les lumières de la pièce et allumez l’intensificateur.

Concentrez l’optique de la caméra sur la scène d’échantillonnage avec les capacités de mise au point de l’objectif et de l’adaptateur Cricket pour générer des images claires des échantillons avec un bon contraste et une bonne luminosité. Une fois le focus terminé, fermez le logiciel SOFI. Ensuite, allez au terminal, exécutez les commandes du logiciel de conception personnalisée pour acquérir les données brutes au format binaire et fermez le terminal.

Ouvrez un nouveau terminal pour traiter les données acquises. Chargez le fichier de données et exécutez le réducteur de données. Analysez les données de post-traitement avec un programme dédié écrit en langage C qui écrira les données dans un fichier image ICS.

Ensuite, ouvrez les fichiers image ICS à l’aide du logiciel d’imagerie à résolution temporelle disponible gratuitement et utilisez deux fonctions exponentielles pour s’adapter aux désintégrations de phosphorescence. Enfin, ouvrez le Fitted. ICS fichiers d’image avec le logiciel d’analyse d’image disponible.

Générez des images de durée de vie de phosphorescence à l’aide de tables de correspondance et codez-les dans une pseudo-échelle de couleurs. Utilisez la fonction Mesure pour calculer les valeurs moyennes de durée de vie de l’image ou des régions d’intérêt. Les images de microscopie d’imagerie de l’intensité de phosphorescence et de la durée de vie de la phosphorescence du capteur de colorant octaéthylporphyrine de platine dans les états oxygéné et désoxygéné sont montrées.

Assurez-vous que le bon filtre d’émission est monté à l’intérieur du Cricket et que la bonne LED, les connexions de câble et les paramètres d’impulsion sont utilisés. Actuellement, ce protocole est limité aux modèles animaux, mais peut potentiellement être appliqué pour diagnostiquer et traiter les états pathologiques associés à l’hypoxie tissulaire, tels que le cancer, les accidents vasculaires cérébraux et l’inflammation.