Déchiffrer le mécanisme moléculaire et la fonction des toxines formant des pores à l’aide de Leishmania major

Le mécanisme de résistance aux toxines formant des pores est mal compris. Notre protocole permet la fonction et le mécanisme des toxines formant des pores en utilisant Leishmania major, un système génétiquement traitable et physiologiquement pertinent. Le principal avantage du test de cytotoxicité est de comparer la viabilité cellulaire de plusieurs phénotypes au niveau d’une seule cellule dans un test à débit moyen lorsqu’il est confronté à des toxines en temps réel.

Les agents perturbateurs membranaires comme l’amphotéricine B sont des thérapies de première ligne pour la leishmanie. Ce test permet d’identifier des agents qui potentialisent l’amphotéricine B et/ou de nouveaux agents endommageant la membrane. Ce test fournit un aperçu de domaines tels que la réponse à la réparation et les voies de signalisation liées aux réponses de réparation.

Ce test peut être appliqué à des protozoaires tels que Trypanosoma et Naegleria fowleri. Les gens ont du mal à comprendre la série de dilutions en série de toxines. Donc, le meilleur conseil que je puisse donner est de dessiner un schéma de la série de dilutions en série avant de mettre en place l’expérience.

Pour commencer, réservez 0,5 millilitre de promastigotes traités dans un tube séparé comme témoin non coloré. Ajouter deux milligrammes par millilitre d’iodure de propidium, ou IP, à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre aux promastigotes restants. Vortex pendant trois secondes.

Ajoutez des promastigotes traités à chaque puits d’une plaque à fond en V, de 96 puits ou de tubes de Marsh, et placez la plaque ou le support tubulaire sur la glace à un angle d’environ 45 degrés de la vue. Ajouter 100 microlitres de tampon de dosage avec de l’iodure de propidium à chaque contrôle sans toxine. Vérifiez que le contrôle a été correctement ajouté en identifiant visuellement les tubes d’un volume total de 200 microlitres qui apparaissent de couleur plus foncée.

Ajouter le volume de toxine à la dilution la plus élevée. Ensuite, diluez la toxine en série. Pipeter de haut en bas au moins huit fois pour assurer le mélange.

En partant de la concentration de toxine la plus faible, ajoutez rapidement 100 microlitres de toxine à la bonne rangée et continuez jusqu’à ce que toute la toxine ait été ajoutée aux cellules. Scellez la plaque avec du ruban adhésif. Après avoir incubé à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, emballer et transporter la plaque au cytomètre en flux.

Pour l’acquisition de données, commencez par configurer le cytomètre en flux et le logiciel d’acquisition conformément aux instructions du fabricant et à la politique de l’installation. À l’aide de l’échantillon de promastigote L. major non coloré, régler les portes pour la diffusion vers l’avant et sur les côtés et les paramètres fluorescents initiaux en fonction des colorants choisis. À l’aide de commandes à coloration unique, réglez les barrières pour le colorant de viabilité et toutes les toxines marquées par fluorescence.

Surveillez la diffusion vers l’avant en fonction du temps pour les microcolmatages et obtenez plus de 10 000 événements fermés pour chaque échantillon sur le cytomètre. Pour l’analyse des données, ouvrir la grille des promastigotes L.major monocellulaires totaux en déclenchant la diffusion vers l’avant et sur les côtés et le temps au besoin. Utilisez la hauteur ou la surface recommandée pour le cytomètre en flux.

Identifiez et portez les cellules mortes comme PI élevé. Organisez la courbe dose-réponse dans Excel pour analyse. Déterminez le pourcentage moyen de PI élevé pour chaque condition entre les deux répétitions techniques.

Inclure la concentration de toxines et le pourcentage moyen de lyse spécifique, ainsi que les détails expérimentaux et/ou les calculs bruts du pourcentage élevé d’IP. Étiquetez quatre autres colonnes comme Modélisé, Résidus, Paramètres et Valeurs de paramètre. Vérifiez que les premières colonnes correspondent aux paramètres expérimentaux, à la concentration en toxines et au pourcentage de lyse spécifique.

Initialisez les paramètres L, k et c en entrant les valeurs dans la colonne Valeurs des paramètres. Dans la colonne Modélisé, créez le modèle logistique. Dans la colonne Résidus, calculez le carré de la différence entre le nombre modélisé et la lyse spécifique réelle.

Dans la colonne Valeurs des paramètres, en regard de SOMME, additionnez toutes les valeurs de la colonne Résidus. Dans la colonne Valeurs des paramètres, en regard de CL50, initialisez l’équation pour calculer la CL50 à partir des valeurs déterminées. Ouvrez le solveur à partir de l’onglet Données.

Sélectionnez l’objectif défini comme étant la cellule contenant la somme des résidus calculés. Définissez-le sur Min. Modifiez les cellules variables pour les valeurs de paramètre L, k et c.

Pour les valeurs k négatives, modifiez les équations en factorisant une négative de k pour changer k en positif. Utilisez la méthode de résolution non linéaire GRG, puis cliquez sur Résoudre. Vérifiez la courbe et vérifiez que la CL50 est calculée automatiquement.

Vérifiez l’ajustement en traçant graphiquement à la fois le pourcentage de lyse spécifique et la modélisation par rapport à la concentration de toxines. Les promastigotes knockout SPT2 déficients en sphingolipides étaient sensibles au SLO à la fois dans le M199 sans sérum et dans le tampon de Tyrode. Les promastigotes de type sauvage et SPT2 add-back étaient résistants au SLO dans le M199 sans sérum, mais présentaient moins de 20% de lyse spécifique dans le tampon de Tyrode.

Les promastigotes knockout SPT2 étaient environ huit fois plus sensibles au SLO dans le tampon de Tyrode que dans M199. Ces données démontrent que la sensibilité aux toxines peut varier en fonction du tampon utilisé. Une bande de 120 kilodaltons a été observée pour le phospho-MEK chez les promastigotes de L. major.

Pour la MEK totale, des bandes d’environ 120 kilodaltons et 55 kilodaltons ont été observées, ce qui correspond aux tailles de MRK1 et LmxMKK, respectivement. Phospho-ERK a détecté des bandes similaires, tandis que la coloration des anticorps ERK n’était pas robuste dans ce test. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est d’assurer la manipulation appropriée de la toxine.

Leishmania peut être utilisé comme modèle génétiquement traitable pour étudier la réparation de la membrane plasmique, fournissant de nouvelles informations sur la mécanique de réparation de la membrane lors de l’interaction de la bactérie Leishmania dans l’intestin moyen du phlébotome.