Une approche d’imagerie intravitale fluorescente pour étudier la dynamique de la signalisation calcique induite par la charge dans les ostéocytes de souris
24 février 2023
Le présent article décrit la mise en œuvre d’une approche d’imagerie intravitale pour observer la signalisation calcique induite mécaniquement des ostéocytes intégrés in vivo en temps réel en réponse à la charge mécanique au niveau tissulaire du troisième métatarsien de souris.
Ce protocole permet d’observer in vivo les ostéocytes intégrés, ce qui représente une avancée importante dans l’étude de la mécanobiologie osseuse. Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’observer les événements aux niveaux cellulaire et moléculaire dans les ostéocytes in vivo, en maintenant leur disposition spatiale 3D native, leur flux sanguin et leurs conditions endocriniennes, et en surmontant les limites généralement imposées par l’expérimentation cellulaire in vitro. Cette technique est conçue pour l’investigation scientifique fondamentale sur des modèles murins. Ils ne s’étendent pas encore à la thérapie ou au diagnostic, mais offrent la possibilité d’obtenir des informations qui définissent la prochaine génération de traitements osseux.
[Narrateur] Pour commencer, faites une incision au scalpel à travers le derme entre le deuxième et le troisième métatarsien, en commençant par l’extrémité distale et en progressant proximale le long de la longueur des os. À l’aide d’une pince, ouvrez le site chirurgical en tirant la peau vers les bords médiaux ou latéraux. Réséquez les tendons extenseurs à l’aide de ciseaux Vannas droits pour exposer le troisième métatarsien. Insérez la goupille centrale du dispositif de charge métatarsienne dans le petit espace à l’extrémité distale où le troisième métatarsien rencontre la phalange proximale. Déplacez ensuite la goupille vers la proximale jusqu’à ce qu’elle repose au milieu de la tige du troisième métatarsien. Veillez tout particulièrement à garantir une interface directe entre l’os et l’axe, à l’exclusion de tout muscle et fascia. Tenez la cheville avec une pince et placez le pied dans le bain-marie rempli de DPBS. Fixez la patte en place avec le support de chargement et connectez le support à la disposition de la cellule de charge de l’actionneur. Prenez avec précaution la configuration du dispositif de chargement à l’aide de la souris et placez-la sur la plate-forme du microscope. Commencez par l’objectif à faible grossissement en mode épifluorescence pour localiser et centrer la diaphyse moyenne de l’os. Une fois qu’une région d’intérêt est localisée, passez à un grossissement d’objectif d’immersion dans l’eau plus élevé et basculez l’optique à deux photons. Définissez la densité de pixels à l’aide des paramètres de contrôle de zone Galvo/Résonance. Pour éviter le blanchiment des photos, réduisez la puissance à l’aide de l’option de contrôle de l’alimentation et augmentez l’amplification PMT dans les paramètres de contrôle du scanner Galvo/Resonance. Identifiez la surface de l’os en mode deux photons en recherchant l’autofluorescence fibreuse du périoste dans le canal vert qui utilise un filtre passe-bande centré à 525 nanomètres. S’il y a un mouvement visible de l’os pendant le chargement, sélectionnez une autre région d’intérêt le long des directions Y ou Z pour vous assurer qu’elle se trouve directement au-dessus de la goupille du point d’appui central. Si le mouvement persiste, ajustez manuellement la position chirurgicale de la broche sous le troisième métatarsien. Effectuez une imagerie de la pile Z avec charge selon le plan expérimental pour enregistrer les événements de signalisation morphométrique, puis une imagerie de la série T avec charge pour enregistrer les événements de signalisation induits par la charge dynamique. Une image à deux photons d’ostéocytes métatarsiens exprimant GCaMp6f in vivo est présentée ici. L’expression endogène des constructions rapporteures calciques fournit une cible fluorescente sans avoir besoin d’incubation. La projection 3D Z d’ostéocytes in vivo capturés par microscopie à deux photons est présentée dans cette figure. La coupe transversale dans le plan XY et une coupe sagittale montrent la profondeur de l’empilement Z. L’image représentative montre un exemple de cours temporel du signal fluorescent GCaMp6f provenant d’un ostéocytes intégré. Au repos, de faibles fluctuations bruyantes sont présentes. Avec la charge, les fluctuations du calcium augmentent en ampleur et en régularité, se produisant souvent au fur et à mesure de la charge appliquée.
Cette méthode ouvre la voie aux chercheurs pour répondre à des questions fonctionnelles concernant la mécanobiologie des ostéocytes in vivo qui n’étaient auparavant possibles qu’in vitro ou ex vivo.
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Aperçu
Cet article présente un protocole d'imagerie intravitale permettant d'observer la signalisation calcique dans les ostéocytes en réponse à une charge mécanique in vivo. Cette avancée permet d'observer en temps réel les événements cellulaires tout en préservant l'environnement natif de l'os.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Mécanobiologie osseuse
- Techniques d'imagerie intravitale
- Signalisation calcique dans les ostéocytes
Contexte
- Les ostéocytes jouent un rôle crucial en mécanobiologie osseuse.
- Les méthodes traditionnelles in vitro limitent la compréhension des réponses cellulaires dans leur environnement naturel.
- Cette technique permet l’observation des ostéocytes tout en préservant leur organisation spatiale tridimensionnelle et leurs conditions physiologiques.
- Les connaissances acquises pourraient orienter les stratégies thérapeutiques futures en matière de traitement osseux.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant d'observer les ostéocytes in vivo pendant une sollicitation mécanique.
- Approfondir la compréhension des dynamiques de signalisation calcique dans les ostéocytes.
- Fournir une base pour les recherches futures sur la santé osseuse et les maladies du squelette.
Méthodes utilisées
- Incision au scalpel pour accéder au troisième métatarse chez la souris.
- Utilisation d'un dispositif de chargement du métatarse pour appliquer un stress mécanique.
- Microscopie à deux photons pour l'imagerie en temps réel des ostéocytes.
- Événements de signalisation induits par une charge dynamique capturés par imagerie en série Z et en série T.
Résultats principaux
- L'imagerie en temps réel a révélé des fluctuations du calcium dans les ostéocytes pendant la contrainte mécanique.
- Les signaux fluorescents ont augmenté en intensité avec la contrainte mécanique.
- L'imagerie 3D a permis d'obtenir des informations sur l'agencement spatial des ostéocytes.
- A démontré l'efficacité de la technique pour l'étude de la mécanobiologie osseuse.
Conclusions
- Le protocole permet des avancées significatives dans l'étude de la mécanobiologie osseuse.
- L'imagerie en temps réel des ostéocytes peut conduire à une meilleure compréhension de la santé osseuse.
- Cette technique pourrait ouvrir la voie à de futures stratégies thérapeutiques dans le traitement des os.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie directe in vivo de la signalisation calcique des ostéocytes sous charge mécanique comble une lacune critique dans la compréhension de la mécanotransduction osseuse au niveau moléculaire. Cette capacité renforce la confiance prédictive en phase de découverte précoce en permettant l'observation en temps réel des voies mécanosensorielles dans leur contexte physiologique naturel. L'approche permet une détection mécanistique des risques et oriente la validation des cibles pour les programmes liés à la santé osseuse et aux maladies squelettiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'exploration de voies de mécanosensation ostéocytaire dans un contexte physiologiquement pertinent.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en préservant l'architecture tridimensionnelle native et les influences systémiques.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles impliquées dans les mécanismes de mécanotransduction osseuse.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le classement par ordre de priorité des cibles liées à l'os.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système in vivo validé permettant de quantifier la dynamique de la signalisation calcique en réponse à des charges mécaniques définies.
- Permet des lectures reproductibles et quantitatives de l'activité des ostéocytes pour le développement d'essais en aval.
- Facilite la standardisation des essais de mécanotransduction pour l'évaluation de composés.
- Jette les bases d'un criblage évolutif de modulateurs affectant la mécanosensibilité osseuse.
Recherche translationnelle et préclinique
- Associe les données mécanistiques à des modèles osseux pertinents pour la maladie afin d'assurer une continuité translationnelle.
- Permet une progression ajustée au risque des interventions ciblant l'os, fondée sur des données mécanistiques in vivo.
- Favorise l'identification de biomarqueurs translationnels liés à la dynamique de la signalisation des ostéocytes.
- Établit un lien entre les découvertes effectuées en phase de recherche et leur validation préclinique dans des systèmes intacts.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode d'imagerie intravitale s'intègre à l'interface entre la découverte précoce et la recherche préclinique, permettant de tester directement des hypothèses et de clarifier des voies biologiques dans un tissu osseux vivant.
- Biologie de la découverte : Permet de tester mécanistiquement les réponses des ostéocytes aux stimuli mécaniques in vivo.
- Essais de dépistage : Fournit des mesures quantitatives et reproductibles du signal calcique pour évaluer la préparation des tests.
- Analytique : Offre des lectures dynamiques par fluorescence pour comparer les signaux sous différentes conditions de chargement.
- Recherche translationnelle : Relie les événements de signalisation moléculaire aux résultats fonctionnels au niveau de l'os entier dans des modèles pertinents pour la maladie.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour les études de mécanobiologie dans divers programmes de recherche sur l'os.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur la mécanotransduction osseuse.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles d'imagerie in vivo pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'orientation (go/no-go) et améliore l'efficacité du capital dans la recherche et le développement ciblant l'os.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs liés à la santé osseuse et aux maladies squelettiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie intravitale et en techniques chirurgicales sur petits animaux.
- Exige un accès à une microscopie à deux photons et à un équipement précis pour l'application de charges mécaniques.
- Implique une standardisation interéquipes des paramètres d'imagerie et des analyses de données.
- L'adaptation à d'autres sites osseux ou modèles peut nécessiter une optimisation du protocole.
- Limitée à l'investigation en sciences fondamentales sur des modèles murins, comme le soutiennent les données actuelles.
