Name: Ciblage génique hautement efficace médié par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez le ciblage génique CRISPR/Cas9 dans les cellules souches embryonnaires pour créer des modèles murins génétiquement modifiés. Cette méthode améliore l'efficacité de l'intégration d'ADN long sans sélection médicamenteuse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Saki Nishioka de l’Université d’Osaka, Biotechnology Research and Development (organisation à but non lucratif), et Mio Kikuchi et Reiko Sakamoto de l’Institut des sciences médicales de l’Université de Tokyo, pour leur excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par: les subventions KAKENHI du Ministère de l’éducation, de la culture, des sports, de la science et de la technologie (MEXT)/Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) à l’IM (JP19H05750, JP21H05033) et au MO (20H03162); la subvention Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Agency (JST) à MI (JPMJCR21N1); l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain à l’IM (R01HD088412); la Fondation Bill & Melinda Gates à MI (subvention INV-001902 de Grand Challenges Explorations); et la subvention pour le projet de recherche conjoint de l’Institut de recherche sur les maladies microbiennes de l’Université d’Osaka à l’IM et à l’OM.

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Tokyo (numéro d’approbation PA17-63) et de l’Université d’Osaka (numéro d’approbation Biken-AP-H30-01) et réalisées conformément à leurs directives ainsi qu’aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org).
1. Ciblage de la construction vectorielle
<ol><li>Amplifiez une cassette KI (CreERT ici, l’ADN modèle pour la PCR provient à l’origine d’une société commerciale de synthèse de gènes) et un fragment d’environ 1 ko de bras d’homologie 5' ou 3' par PCR. Pour le clonage de l’ADN (étape 1.3), ajoutez des séquences de chevauchement de 15 mères à l’extrémité 5' de chaque amorce de PCR. Purifier les fragments d’ADN PCR par électrophorèse sur gel d’agarose, suivie de l’extraction du fragment d’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN.</li>
	<li>Linéariser le plasmide du squelette (p. ex. pUC19 ou pBS) à l’aide d’une ou de plusieurs enzymes de restriction appropriées qui digèrent de façon unique quelque part dans le site de clonage multiple pour le clonage. Ensuite, purifiez le plasmide digéré à l’aide d’un kit de purification de l’ADN.</li>
	<li>Cloner chaque fragment de PCR (p. ex., bras d’homologie 5', bras d’homologie 3') et séquence de KI simultanément dans le plasmide digéré à l’aide d’une trousse de clonage d’ADN conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Transformer les cellules compétentes à l’aide du plasmide construit (étape 1.3) en les chauffant à 42 °C pendant 1 min au bain-marie, puis les ensemencer sur une plaque LB contenant la concentration appropriée d’antibiotiques tels que l’ampicilline ou la kanamycine. Cultivez-les pendant la nuit pour des sélections de clones résistants.</li>
	<li>Prélever plusieurs colonies individuelles (quatre à huit) à l’aide d’embouts de pipette de 200 μL et transférer les embouts dans 3 mL de LB liquide contenant les antibiotiques appropriés (100 μg/mL d’ampicilline ou 20 μL/mL de kanamycine) et les cultiver pendant la nuit à 37 °C en agitant les gouttes de l’alcool.</li>
	<li>Purifier le plasmide le lendemain à l’aide d’une trousse de purification plasmidique commerciale de qualité sans endotoxines conformément aux instructions du fabricant. Confirmer la séquence clonée dans le plasmide par séquençage de Sanger. Ajuster la concentration plasmidique à 1 μg d’ADN/μL en utilisant de l’eau sans nucléase. Utilisez le plasmide comme vecteur de ciblage du gène.</li>
</ol>2. Préparation du fibroblaste embryonnaire de souris (MEF) en tant que cellules nourricières pour l’ESC
<ol><li>Sacrifier des souris femelles ICR gravides âgées de 8 à 10 semaines (14,5 jours après le coït) par luxation cervicale. Essuyez bien l’abdomen en utilisant de l’éthanol à 70% (v / v) pour la stérilisation, coupez l’abdomen à l’aide de ciseaux orbitaux et de forceps, et récupérez l’utérus contenant le fœtus.</li>
	<li>Placer l’utérus dans une boîte de 100 mm contenant 10 mL de sérum bovin phosphaté (PBS) contenant 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Retirer les placentas et les tissus extraembryonnaires des fœtus à l’aide de ciseaux orbitaires et de forceps. Hacher les fœtus à l’aide de ciseaux orbitaires et transférer la solution PBS contenant les cellules fœtales hachées dans un tube conique de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 280 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le surnageant par aspiration. Ajouter 10 mL de solution trypsine-EDTA à 0,25 % (p/v), bien mélanger par pipetage, puis incuber pendant 10 min à 37 °C au bain-marie pour la digestion de la trypsine.</li>
	<li>Ajouter 20 mL de milieu MEF (DMEM contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) pour arrêter la réaction enzymatique, bien mélanger par inversion douce et centrifuger à 280 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant par aspiration, ajouter 10 mL de milieu MEF et bien mélanger par pipetage.</li>
	<li>Ensemencer la suspension cellulaire dans plusieurs nouvelles boîtes de 100 mm (préparer le même nombre de plats que le nombre de fœtus avec 10 ml de milieu MEF pour une boîte de 100 mm). Changez le milieu 4 à 5 heures après l’ensemencement pour enlever les cellules non attachées et laissez le MEF attaché se développer. Passage des cellules lorsqu’elles atteignent ~80% de confluence en utilisant la trypsine.</li>
	<li>Placer les boîtes de culture contenant le MEF proliférant dans un milieu MEF, environ 12-15 jours après l’ensemencement, dans un dispositif d’irradiation par rayons X. Exposer le MEF avec une radiographie de 50 Gy (total) pour arrêter le cycle cellulaire conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Trypsiniser le MEF irradié en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25% pour une boîte de 100 mm pendant 5 min à 37 °C, puis ajouter 4 mL de milieu MEF pour arrêter la digestion de la trypsine et recueillir la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 50 mL.</li>
	<li>Laver le MEF avec un milieu MEF frais par centrifugation à 280 x g pendant 5 min à 4 °C, compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration au bleu de trypan et les congeler à 1,6 x 106 cellules/tube dans un milieu de congélation cellulaire. Conserver jusqu’à utilisation; Les cellules peuvent être stockées de manière stable dans de l’azote liquide pendant plusieurs années.</li>
</ol>3. Préparation du mélange Cas9-RNP-ADN
<ol><li>Dissoudre l’ARNtrac et l’ARNcr dans un tampon de dilution (chaque concentration d’ARN à 200 μM) par pipetage. Mélanger la solution d’ARNtrac, la solution de crisprRNA et le tampon de dilution (rapport volumique à 2:2:5) en tapotant doucement et en recuisant chaque ARN à l’aide d’un thermocycleur à 95 °C pendant 10 minutes, suivi de cycles de réduction progressive de 1 °C/min jusqu’à ce que la température atteigne 4 °C. REMARQUE: La séquence d’ARNg a été conçue à l’aide de CRISPOR, http://crispor.tefor.net.</li>
	<li>Incuber les ARN recuits, 10 μg/μL de nucléase Cas9 et le tampon d’électroporation mélangés dans un rapport volumique de 5:3:2 à 37 °C pendant 20 min pour former le complexe Cas9-RNP. Dans le travail de routine, mélanger et incuber 1,25 μL d’ARN recuit, 0,75 μL de nucléase Cas9 et 0,5 μL de tampon d’électroporation pour une édition du génome du locus.</li>
	<li>Mélanger les matériaux suivants dans un tube de 1,5 mL : 10 μL de tampon d’électroporation, 1 μL de complexe Cas9-RNP (étape 3.2) et 1 μL de vecteur de ciblage circulaire (1 μg/μL, étape 1.6). La quantité totale de mélange Cas9-RNP-ADN est de 12 μL. Gardez le mélange Cas9-RNP-ADN sur la glace jusqu’à l’électroporation. REMARQUE: Pour éviter le reclivage de l’ARNg après KI, concevez l’ARNg dans une position où la séquence de reconnaissance de l’ARNg est divisée par l’intégration du donneur de KI. Si l’ARNg ne peut pas être conçu dans un tel endroit, plusieurs mutations silencieuses nucléotidiques, par lesquelles la séquence d’acides aminés ne change pas, sont incluses dans le plasmide du donneur de KI.</li>
</ol>4. Ciblage génique des CES
<ol><li>Pour préparer les boîtes de culture cellulaire enrobées de gélatine, ajouter une solution de gélatine à 0,1 % (p/v) à 2 mL pour une boîte de 60 mm, 500 μL pour une assiette de 24 puits, 100 μL pour une assiette de 96 puits, et incuber pendant 2 h dans un incubateur humide. Retirer la solution de gélatine, laver deux fois avec la même quantité de PBS et conserver à température ambiante jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Décongeler le MEF congelé inactivé mitotiquement (étape 2.2) à l’aide d’un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et placer le MEF sur une capsule de 60 mm recouverte de gélatine (un tube de MEF congelé contenant 1,6 x 106 cellules pour deux boîtes de 60 mm, étape 2.2) 1 jour avant l’ensemencement de l’ESC.</li>
	<li>Décongeler un tube de stockage d’ESC congelé (stocké à 2 x 10 5 ESC/tube; le comptage des cellules a été effectué à l’aide d’un compteur de cellules) à l’aide d’un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et placer 1 x 105 CES sur une capsule de 60 mm contenant du MEF pré-ensemencé (étape 4.1).</li>
	<li>Culture dans un milieu de culture ESC de 4 mL (ESCM, milieu modifié à base de DMEM avec 15 % (v/v) de sérum fœtal bovin, substrat de L-glutamine 2 mM, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol, facteur inhibiteur de la leucémie, et t2i (0,2 μM PD0325901 et 3 μM CHIR99021) qui maintient la pluripotence de l’ESC11) à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que l’ESC atteigne 50 % à 70 % de confluence. REMARQUE: Nous utilisons trois lignes différentes d’ESC: JM8. A3 de B6N, V6.5 de B6-129 F1, et BALB/c ESC développé en interne. Les mêmes protocoles KI dans ce manuscrit sont utilisés pour toutes les lignes ESC.</li>
	<li>Laver l’ESC de culture avec 4 mL de PBS, puis traiter avec 800 μL de solution trypsine-EDTA à 0,25% pendant 5 min à 37 °C pour la digestion. Ajouter 1 mL d’ESCM pour inactiver la trypsine et dissocier les CSE en cellules individuelles par pipetage.</li>
	<li>Centrifuger la solution contenant l’ESC pendant 5 min à 280 x g, jeter le surnageant, remettre en suspension les CSE dans 1 mL frais d’ESCM et compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration au bleu trypan. Transférer 1 x 10 5 ESC dans un nouveau tube de1,5 mL et les laver trois fois avec du PBS par centrifugation à 500 x g, 4 °C.</li>
	<li>Resuspendre la pastille d’ESC dans 12 μL de mélange Cas9-RNP-ADN (étape 3.3) et bien mélanger par pipetage doux pour éviter les bulles. Servir l’ESC remis en suspension pour l’électroporation. Le système d’électroporation utilise une seule impulsion à 1 400 V et 30 ms pour la transduction Cas9-RNP-ADN (Figure 1).</li>
	<li>Culture des CSE électroporées dans une boîte de 60 mm contenant 4 mL d’ESCM avec MEF mitotiquement inactivé (section 4.2). Changez le support tous les jours.</li>
	<li>Laver les CSE avec 4 mL de PBS 3 à 5 jours après l’électroporation, puis traiter avec 800 μL de trypsine-EDTA à 0,25% et cultiver à 37 °C pendant 5 min dans un incubateur humide pour la digestion. Ajouter 2 mL d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine et centrifuger le mélange cellulaire à 280 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant, remettre en suspension les CSE dans 1 mL d’ESCM frais et compter la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration bleu trypan. Passage des ESC à 1 x 103 ESC par boîte de 60 mm contenant la MEC et le MEF d’alimentation. Changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que la colonie reprenne. REMARQUE: La raison pour laquelle l’ESC est passé une fois avant le prélèvement est que l’édition du génome peut continuer à se produire après la division de l’ESC, de sorte que la première colonie n’est pas toujours le clone dans de nombreux cas. Par conséquent, le premier passage de l’ESC avant le ramassage de la colonie est une étape essentielle pour ramasser des clones uniques.</li>
</ol>5. Génotypage par PCR des CES ciblés
<ol><li>Aspirer l’ESCM de la boîte de culture ESC 5 à 7 jours après le premier passage (étape 4.9) et ajouter 4 mL de PBS. Prélever des colonies d’ESC simples contenant 5 μL de PBS à l’aide d’une pipette de 20 μL au stéréomicroscope (grossissement de 30x à 40x). Placer les colonies individuelles dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 puits contenant 15 μL de solution trypsine-EDTA à 0,25 %.</li>
	<li>Gardez la plaque de 96 puits sur la glace jusqu’à ce que 48 colonies individuelles soient ramassées. Incuber la plaque de 96 puits pendant 5 minutes dans un incubateur humide à 5 % de CO2 à 37 °C, puis ajouter 80 μL d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine et dissocier les colonies d’ESC en cellules individuelles par pipetage. REMARQUE: Étant donné que l’efficacité KI de cette méthode est généralement de 10% à 50%, nous prenons régulièrement 48 clones et effectuons d’abord le génotypage en utilisant 24 d’entre eux. Si plusieurs clones de KI ne peuvent pas être obtenus à ce stade, nous poursuivons le dépistage du KI en utilisant les 24 clones restants.</li>
	<li>Transférer 40 μL de suspension d’ESC (étape 5) dans une plaque de 96 puits sans gélatine contenant 50 μL d’ESCM par puits pour le génotypage par PCR. Transférer les 60 μL restants de suspension d’ESC dans un puits dans une plaque de 24 puits recouverte de gélatine, qui contient 500 μL d’ESCM et de MEF d’alimentation, pour obtenir le stock d’ESC congelé.</li>
	<li>Stocker des clones d’ESC individuels cultivés dans la plaque de 24 puits (étape 5.3) jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 60 % à 80 %. Récupérer des clones d’ESC individuels par trypsinisation comme mentionné ci-dessus, recueillir des cellules dans un nouveau tube de 1,5 mL et centrifuger à 280 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 500 μL de milieu de congélation cellulaire et les congeler à l’aide d’un congélateur à -80 °C.</li>
	<li>Pour le génotypage par PCR, cultiver des clones d’ESC dans la plaque sans alimentation à 96 puits (étape 5.3) jusqu’à ce que l’ESC atteigne plus de 90 % de confluence. Retirer l’ESCM de chaque puits par aspiration et laver deux fois avec 100 μL de PBS.</li>
	<li>Aspirer le PBS et ajouter 100 μL de tampon de lyse contenant la protéinase K, bien mélanger et transférer le lysat d’ESC dans un nouveau tube de 1,5 mL. Chauffer le lysat de l’ESC à 65 °C pendant au moins 1 h à l’aide d’une chambre thermique. Extraire et purifier l’ADN génomique à l’aide d’une méthode conventionnelle de purification de l’ADN phénol-chloroforme suivie d’une précipitation à l’éthanol.</li>
	<li>Dissoudre l’ADN précipité dans 20 μL d’eau exempte de DNase et déterminer la pureté et la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Effectuer une PCR génomique à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques au locus pour amplifier la région cible. Ensuite, vérifiez la séquence et choisissez les clones ESC avec les séquences KI souhaitées.</li>
</ol>6. Préparation d’embryons au stade huit cellules et micro-injection de CSE
<ol><li>Injecter 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) par voie intrapéritonéale aux femelles adultes ICR. Après 48 h, injecter 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) aux mêmes femelles, puis accoupler les femelles traitées aux hormones avec les mâles ICR. Vérifiez le bouchon copulatoire dans le vagin le lendemain (jour embryonnaire 0,5, ED0,5). NOTE: Pour évaluer le chimérisme par rapport de couleur de la robe, utiliser le blastocyste de la souche ICR comme receveur pour un ESC qui a un fond de couleur de robe noir ou agouti, ou le blastocyste de la souche C57BL/6 comme receveur pour un ESC qui a le fond albinos.</li>
	<li>Recueillir l’oviducte à ED1.5 et le placer dans des gouttes de milieu tamponné HEPES (FHM). Récupérer les embryons au stade bicellulaire ou à quatre cellules en rinçant l’oviducte avec FHM à l’aide d’une aiguille de rinçage insérée dans l’infundibulum.</li>
	<li>Lavez les embryons prélevés en les déplaçant dans plusieurs gouttes fraîches de MHF à l’aide d’une pipette buccale. Culture des embryons dans 50 μL de KSOM tombent sur une boîte de culture cellulaire de 35 mm recouverte d’huile minérale à 37 °C, incubateur à 5% de CO2 pendant 1 jour jusqu’à ce que le stade de huit cellules ou morula (ED2.5) soit atteint.</li>
	<li>Si les embryons ne sont pas utilisés le jour de prélèvement suivant, les congeler par vitrification selon le protocole CARD (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) et les conserver dans de l’azote liquide jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Préparer des pipettes en verre pour contenir les embryons (diamètre extérieur de 80 à 100 μm) et l’injection d’ESC (diamètre d’environ 13 μm) à l’aide d’un extracteur et d’une microforge.</li>
	<li>Intégrez une pipette de maintien contenant FHM dans un support capillaire relié à un micro-injecteur et installé sur le côté gauche du micromanipulateur. Connectez une pipette d’injection à un autre micro-injecteur et installez-la sur le côté droit. Aligner les deux pipettes droites dans le champ de vision du microscope.</li>
	<li>Distribuer 5 μL de polyvinylpyrrolidone (PVP) à 12 μL de polyvinylpyrrolidone (PVP) dans un milieu HFM et 5 μL de gouttes de FHM sur le même couvercle d’une capsule de 60 mm côte à côte et couvrir les gouttes d’huile minérale. Transférer les embryons dans la goutte de MHF de 5 μL et ajouter 1 à 5 μL de la suspension d’ESC à la goutte de MHF qui contient des embryons. NOTA: Laisser la suspension ESC et MEF pendant 30 minutes dans la ESM de 4 ml sur une capsule de culture de 60 mm avant la préparation de la goutte. Étant donné que les MEF adhèrent au fond plus rapidement que les ESC, cette incubation de 30 minutes permet la concentration de cellules ES non attachées dans le surnageant.</li>
	<li>Laver à l’intérieur de la pipette d’injection avec du PVP, puis passer à la goutte contenant les embryons et les ESC.</li>
	<li>Prenez trois doublets ECS individuels qui viennent de terminer leur division cellulaire (six cellules) dans la pipette d’injection. Tenir un embryon de stade de huit cellules ou de morula, qui a terminé le compactage, avec la pipette de maintien par aspiration. Faites un trou dans la zone pellucide avec une impulsion piézoélectrique (intensité: 3; vitesse: 3). Expulser l’ESC à six cellules à l’intérieur de la zone pellucide et retirer la pipette des embryons.</li>
	<li>Lavez doucement les embryons injectés par l’ESC avec plusieurs gouttes de KSOM à l’aide d’une pipette buccale et incubez-les dans une nouvelle goutte KSOM de 50 μL recouverte d’huile minérale à 37 °C, 5% de CO2 jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade de blastocyste.</li>
	<li>Transférer les 10 blastocystes injectés par l’ESC dans chaque corne utérine de souris femelles pseudo-gravides (2,5 jours après le coït, 20 blastocystes par tête).</li>
	<li>Après l’accouchement de la mère porteuse, sélectionnez au moins deux chimères mâles présentant le rapport chiméristique le plus élevé (70% ou plus, comme confirmé par la couleur du pelage), puis accouplez-les avec des femelles souches appropriées pour obtenir un KI hétérozygote F1.</li>
	<li>Élever des souris KI individuelles avec des partenaires appropriés pour obtenir des souris ayant un ou plusieurs génotypes ou antécédents génétiques souhaitables adaptés à la recherche.</li>
</ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Oji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+genome+editing+in+ES+cells+and+its+application+for+chimeric+analysis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice.</a> Scientific Reports. 6, 31666(2016).</li>
<li>Kaneko, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+proto-oncogene+int-2+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%3A+a+general+strategy+for+targeting+mutations+to+non-selectable+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.</a> Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).</li>
<li>Johnson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+nonexpressed+genes+in+embryonic+stem+cells+via+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination.</a> Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).</li>
<li>Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+a+subtle+mutation+into+the+Hox-2.6+locus+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells.</a> Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).</li>
<li>Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzawa%2C+M+%22Genome+Editing+in+Animals+-+Methods+and+Protocols+2nd+edition%22">Genome Editing in Animals - Methods and Protocols 2nd edition</a>. Hatada, I. , (2022).</li>
<li>Yagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+ground-state+female+ES+cells+maintaining+gamete-derived+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation.</a> Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).</li>
<li>Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+an+extrachromosomal+plasmid+vector+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322 (5903), 949-953 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+chimeric+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+4-+to+8-cell+and+blastocyst+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos.</a> Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+to+Chimeras+through+Injection+and+Coculture+of+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos.</a> Stem Cells International. 2014, 409021(2014).</li>
<li>Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+double-strand+break+indel+byproducts+with+secondary+guide+RNAs+improves+Cas9+HDR-mediated+genome+editing+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies.</a> Nature Communications. 13 (1), 2351(2022).</li>
<li>Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocyst+complementation+using+Prdm14-deficient+rats+enables+efficient+germline+transmission+and+generation+of+functional+mouse+spermatids+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats.</a> Nature Communications. 12 (1), 1328(2021).</li>
<li>Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+chimeric+mice+with+spermatozoa+fully+derived+from+embryonic+stem+cells+using+a+triple-target+CRISPR+method+for+Nanos3%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3.</a> Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à divulguer.

Le ciblage génique des CSE suivi de la production de chimères a été classiquement utilisé pour développer des souris manipulées par des gènes. Néanmoins, l’efficacité de l’incrution génique reste faible même si le vecteur de ciblage contient de longs bras d’homologie (> plusieurs kb en général) avec des cassettes de gènes de sélection de médicaments positives ou négatives. Notre protocole a introduit une méthode ESC KI mise au point de l’ADN exogène long utilisant un plasmide circulaire sans cassettes de sélection de médicaments comme vecteur de ciblage accompagné d’une édition du génome médiée par Cas9-RNP à une efficacité acceptable pour les travaux de routine. Ainsi, ce protocole pourrait contribuer à réduire considérablement le temps nécessaire à la production de souris chimériques génétiquement modifiées par rapport au ciblage conventionnel de l’ESC.
Dans ce protocole, nous avons utilisé CRISPR / Cas9-RNP pour induire des cassures double brin spécifiques au site dans le génome, et un plasmide circulaire a été utilisé comme vecteur de ciblage au lieu d’un vecteur linéarisé. Les plasmides linéarisés sont classiquement utilisés comme vecteur de ciblage pour le gène KI en raison de leur efficacité accrue d’intégration génomique 8,9,10. Cependant, de nombreuses intégrations génomiques ne sont pas spécifiques même si le vecteur contient des bras homologues9. D’autre part, les plasmides circulaires sont rarement utilisés comme vecteurs de ciblage en raison de leur caractéristique difficile à intégrer dans le génome desCSE12 ou des fibroblastes13. Ainsi, il serait possible que l’application d’un plasmide circulaire comme vecteur de ciblage accompagné d’une édition du génome médiée par CRISPR / Cas9 minimise l’intégration aléatoire non spécifique, mais maximise l’intégration spécifique au site dans le génome ESC. Il serait à noter que l’efficacité d’induction de la cassure double brin par CRISPR/Cas9 est assez importante14, il serait donc essentiel d’utiliser l’ARNg qui induit une rupture double brin à haute efficacité. Il devrait être envisagé de reconcevoir l’ARNg lorsque l’efficacité du KI est trop faible. Dans le cas illustré à la figure 2, 40,9 % des clones de l’ESC présentaient une bande spécifique au KI. En fait, en tant que laboratoire principal de l’institut, nous effectuons régulièrement le ciblage génique à l’aide d’ESC par la méthode décrite ici et avons atteint des rendements de KI de 10% à 50% pour des séquences de 1 à 2 kb telles que Cre, CreERT ou les rapporteurs fluorescents, bien qu’il existe certaines variations en fonction du locus du gène. Les séquences d’ADN les plus longues que nous avons obtenues avec succès en utilisant cette méthode sont d’environ 11,2 kb dans le locus Rosa26, et l’efficacité était de 12,2% (cinq colonies de KI sur 41 colonies analysées).
Il convient également de noter que ce protocole utilise des embryons de stade huit cellules ou morula comme receveurs pour la microinjection d’ESC, mais pas des embryons au stade blastocyste. Bien que nous n’ayons pas mené d’expériences comparatives dans cet article, plusieurs rapports ont montré que l’injection de CSE dans des embryons de stade huit cellules ou morula améliore significativement l’efficacité de la contribution de l’ESC à la progéniture chimérique par rapport à l’injection d’ESC dans les blastocystes15,16,17,18 . En effet, les injections d’ESC de diverses lignées ESC, y compris C57BL/6, B6-129 F1 et BALB/c, ont généralement entraîné le développement d’une chimère de couleur de robe élevée chez certains enfants, mais pas tous (voir la figure 4). La limite de la méthode est que les CSE injectés dans l’embryon préimplantatoire ne pouvaient pas toujours contribuer aux cellules germinales dans une chimère19,20. La transmission germinale des CES dépendrait de la qualité de chaque clone de l’ESC19. Par conséquent, il serait avantageux de développer plusieurs lignées de clones ESC comme sauvegarde pour la production stable de souris chimériques. En conclusion, les protocoles présentés ici utilisent des vecteurs de ciblage simples qui n’incluent que chaque bras d’homologie et gène d’intérêt pour le KI sans cassette résistante aux médicaments. Par conséquent, la construction vectorielle serait beaucoup plus facile et la période de culture pourrait être raccourcie par rapport à la technique classique de ciblage ESC. Cela aiderait à produire rapidement et facilement divers types de souris génétiquement modifiées pour une analyse future dans les sciences de la vie.

La production de souris génétiquement modifiées et l’analyse de leur phénotype nous permettent de comprendre en détail des fonctions génétiques spécifiques, in vivo. De nombreuses découvertes importantes ont été découvertes à l’aide de modèles animaux génétiquement modifiés dans le domaine des sciences de la vie. De plus, depuis le rapport sur la technologie d’édition du génome utilisant CRISPR/Cas91, la recherche utilisant des souris génétiquement modifiées s’est rapidement étendue à de nombreux laboratoires 2,3. L’édition du génome des zygotes de souris par CRISPR / Cas9 a atteint une efficacité acceptable pour développer une courte modification de l’ADN, telle que le knockout du gène orienté mutation indel4, le remplacement d’un seul nucléotide ou l’insertion courte de marqueurs peptidiques utilisant des oligonucléotides simple brin (ssODN) comme donneurs knock-in (KI)5. D’autre part, le KI de gros fragments d’ADN en zygotes par édition du génome reste à une faible efficacité par rapport à la modification de l’ADN de courte taille 6,7. En outre, il est difficile d’utiliser des souches de souris telles que BALB / c, qui est une souche importante pour des domaines de recherche spécifiques comme l’immunologie, pour l’édition du génome à base de zygotes parce que leurs embryons préimplantatoires sont sensibles à la manipulation in vitro.
Une autre façon de développer des modèles de souris génétiquement modifiés consiste à utiliser la technique de ciblage des cellules souches embryonnaires (CSE) suivie d’une injection d’ESC dans l’embryon préimplantatoire pour produire des chimères 8,9,10, qui est encore couramment utilisée comme méthode conventionnelle. Bien que le taux d’acquisition pour obtenir des clones KI-ESC précis ne soit pas très élevé dans les méthodes conventionnelles de ciblage ESC, le ciblage ESC offre certains avantages par rapport à l’édition du génome zygote, en particulier pour le KI ADN long. Par exemple, l’efficacité KI de longs fragments d’ADN (> plusieurs kb) dans le génome du zygote est moins évidente6,7, et de nombreux zygotes sont nécessaires pour développer ne serait-ce qu’une seule lignée de souris KI, ce qui n’est pas souhaitable dans la perspective actuelle des expériences animales. Contrairement à l’édition du génome du zygote, le ciblage long de l’ADN sur les CSE suivi de la production de chimères nécessite beaucoup moins d’embryons que l’édition du génome du zygote. En outre, même si les embryons préimplantatoires de BALB/c sont susceptibles d’être manipulés in vitro, leurs CSE peuvent être conservés et manipulés in vitro 11 comme d’autres ESC de fond compétents 129 ou F1, donc applicables aux productions de chimères. Cependant, même si un vecteur de ciblage contient des bras homologues de 5' et 3' et des cassettes de gènes de résistance aux médicaments pour une sélection positive ou négative, l’efficacité conventionnelle du KI des CES est généralement insuffisante, en raison de la fréquence élevée de l’intégration génomique aléatoire 8,10, D’où la nécessité d’une méthode améliorée avec une efficacité précise de ciblage de l’ESC. Récemment, nous avons rapporté une méthode ESC KI mise au point utilisant l’édition du génome basée sur CRISPR / Cas9 pour obtenir une efficacité KI supérieure aux méthodes de ciblage conventionnelles11. La méthode que nous décrivons ici est basée sur cette procédure qui permet un KI long de l’ADN (> plusieurs à 10 kb) vers les CSE avec une efficacité acceptable pour les travaux de routine sans sélection de médicaments; Ainsi, la procédure de construction du vecteur serait beaucoup plus facile et nécessiterait une période plus courte, ou la période de culture cellulaire deviendrait également beaucoup plus courte.

<table><tbody><tr><td>BALB/c ESC</td><td>-</td><td>-</td><td>ESC développé à partir de la souche BALB/c</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>CS-02-001</td><td>Milieu de congélation cellulaire. Section 2.6 et autres</td></tr><tr><td>sections Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>Section 3.2 et autres dispositions.</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>038-23101</td><td>Section 4.3</td></tr><tr><td>Fragment de gène CreERT</td><td>GeneWiz</td><td></td><td>Section 1.1.</td></tr><tr><td>CRISPR-Cas9 crisprRNA</td><td>IDT</td><td></td><td>crisprRNA. Section 3.1 et ailleurs.</td></tr><tr><td>CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072534</td><td>tracrRNA. Section 3.1 et ailleurs.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08458-45</td><td>MEF moyen. Section 2.3 et ailleurs</td></tr><tr><td>Tampon duplex</td><td>IDT</td><td>1072534</td><td>tampon de dilution de l’ARN. Section 3.1 et ailleurs.</td></tr><tr><td>Kit d’extraction FastGene Gel/PCR</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>Section 1.1 et 1.2.</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td>Substrat L-glutatime</td></tr><tr><td>hCG</td><td>ASKA Santé</td><td></td> animale <td>Section 6.1.</td></tr><tr><td>Kit de clonage HD In-Fusion</td><td>Clontech</td><td>639648</td><td>kit de clonage d’ADN. Section 1.3 et ailleurs</td></tr><tr><td>JM8. A3 ESC</td><td>EuMMCR-ESC</td><td></td> <td>développé à partir de la souche C57BL/6N</td></tr><tr><td>Knock-out DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td>Section 4.3 et ailleurs, milieu commercial modifié à base de DMEM.</td></tr><tr><td>KSOM</td><td></td><td>Merck MR-121-D</td><td>Sections 6.3 et 6.9.</td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>125-05603</td><td>Section 4.3. Aucune donnée de concentration unitaire n’est fournie par le fournisseur. Utilisation de la dilution 1 000 fois dans ce protocole.</td></tr><tr><td>Système d’électroporation au néon</td><td>Thermo Fisher</td><td>MPK5000</td><td>Section 3.2, 4.5 et ailleurs. Le système contient un tampon d’électroporation comme celui utilisé dans la section 3.2.</td></tr><tr><td>Plasmide NucleoSpin Grade Transfection Takara</td><td></td><td>U0490B</td><td>Section 1.6.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>162-25291</td><td>Section 4.3</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>ASKA Santé</td><td></td> animale <td>Section 6.1.</td></tr><tr><td>Tampon de lyse de la queue</td><td>Nacalai</td><td>06169-95</td><td>Section 5.5.</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Nacalai</td><td>32777-15</td><td>Section 2.2 et ailleurs</td></tr><tr><td>V6.5 ESC</td><td>-</td><td>-</td><td>ESC développé à partir du dispositif d’irradiation par rayons X de souche B6J-129 F1</td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>MBR-1618R-BE</td><td>Section 2.6.</td></tr></tbody></table>

ciblage génique hautement efficace médié par crispr/cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

Le système CRISPR/Cas9 a permis de développer des souris génétiquement modifiées par édition directe du génome à l’aide de zygotes fécondés. Cependant, bien que l’efficacité dans le développement de souris knock-out géniques en induisant une petite mutation indel serait suffisante, l’efficacité de l’édition du génome embryonnaire pour fabriquer un knock-in d’ADN de grande taille (KI) est encore faible. Par conséquent, contrairement à la méthode KI directe chez les embryons, le ciblage génique à l’aide de cellules souches embryonnaires (CSE) suivi d’une injection d’embryons pour développer des souris chimères présente encore plusieurs avantages (par exemple, le ciblage à haut débit in vitro, la manipulation multi-allèle et la manipulation des gènes Cre et flox peuvent être effectuées en peu de temps). En outre, les souches dont les embryons sont difficiles à manipuler in vitro, telles que BALB/c, peuvent également être utilisées pour le ciblage de l’ESC. Ce protocole décrit la méthode optimisée pour le KI d’ADN de grande taille (plusieurs kb) dans les CES en appliquant l’édition du génome médiée par CRISPR / Cas9 suivie de la production de souris chimères pour développer des modèles de souris manipulés par des gènes.

Nous avons ciblé des gènes spécifiques dans l’ESC suivis de la production de chimères pour développer la production de souris manipulées par des gènes selon notre manuscritprécédent 11. Le génotypage de l’ESC (décrit à la rubrique 4) est systématiquement effectué par PCR à l’aide d’amorces. Les amorces sont conçues sur des séquences génomiques en dehors des bras d’homologie et les séquences spécifiques dans le fragment d’ADN KI (Figure 2A). Dans ce cas, aucun allèle de type sauvage n’est amplifié, alors qu’un amplicon PCR d’une taille spécifique n’est détecté que lorsque l’ADN exogène ciblé est KI au locus cible. Les résultats représentatifs de la PCR par génotypage sont présentés à la figure 2B. Neuf clones sur 22 (40,9%) présentaient une bande spécifique au KI dans ce cas. Trois résultats de ciblage représentatifs, y compris le résultat illustré à la figure 2, sont présentés au tableau 1. Ces résultats indiquent que la méthode présentée ici est efficace et reproductible pour le gène KI sans aucune sélection de médicaments.
L’ESC est prélevé dans une pipette d’injection, puis un trou dans la zone pellucide est fait à l’aide d’un plus piézoélectrique, et l’ESC est libéré entre les cellules embryonnaires (Figure 3). Techniquement, ce protocole d’injection d’un ESC dans un embryon à huit cellules ou au stade morula est similaire au protocole d’injection d’ESC dans un blastocyste couramment utilisé dans de nombreuses installations pour souris. Des souris chimériques représentatives sont illustrées à la figure 4. Pour l’évaluation de la couleur du pelage du chimérisme, l’embryon de la souche ICR (albinos, cheveux blancs) a été utilisé comme receveur de l’ESC B6 ou B6-129 F1, et les embryons B6 ont été utilisés comme receveurs de CSE BALB/c (Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de l’intégration du plasmide circulaire médié par la ribonucléoprotéine (RNP) CRISPR/Cas9 dans le locus spécifique d’un génome ESC. L’électroporation introduit un plasmide circulaire comme vecteur de ciblage dans les CES avec Cas9-RNP. Abréviations : GOI = gène d’intérêt, HA = bras d’homologie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig02.jpg"> Figure 2 : Analyses PCR génomiques pour le criblage par KI de clones d’ESC ciblés. (A) Les amorces de PCR spécifiques au KI sont conçues sur des séquences génomiques en dehors des bras d’homologie (avant) et dans les séquences spécifiques du fragment d’ADN KI (inverse). (B) Résultats représentatifs de la PCR par génotypage. Un génome de type sauvage a été utilisé comme témoin négatif. Abréviations : GOI = gène d’intérêt, HA = bras d’homologie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig03.jpg"> Figure 3 : Images représentatives de l’injection d’embryons au stade huit cellules. (A) Pour la micro-injection, trois doublets de CSE (six cellules, pointes de flèches) sont prélevés. (B) Un trou dans la zone pellucide est fait avec une impulsion piézoélectrique, et les CES sont expulsés entre chaque blastomère. La barre d’échelle représentée est de 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig04.jpg"> Figure 4 : Images représentatives de souris chimères. (A,B) L’ESC dérivé de C57BL/6N (JM8. A3, cheveux Agouti; A) ou B6-129 F1 (cheveux Agouti; B) sont injectés dans des embryons ICR (albinos, cheveux blancs), suivis du transfert des embryons à la mère porteuse. (C) L’ESC dérivé de BALB/c (albinos, cheveux blancs) est injecté dans des embryons C57BL/6J (cheveux noirs), puis transféré les embryons à des mères porteuses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ID du projet</td>
			<td>Chorosome</td>
			<td>5'HA longueur (pb)</td>
			<td>Longueur 3'HA (pb)</td>
			<td>Taille d’insertion (pb)</td>
			<td>Nombre de clones analysés</td>
			<td>Nombre de clones de KI</td>
			<td>Efficience (%)</td>
			<td>Remarques</td>
		</tr><tr><td>R26-CC*</td>
			<td>Chr6</td>
			<td>965</td>
			<td>1006</td>
			<td>5321</td>
			<td>23</td>
			<td>2</td>
			<td>8.7%</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>R4-03*</td>
			<td>Chr8</td>
			<td>1000</td>
			<td>997</td>
			<td>3070</td>
			<td>22</td>
			<td>6</td>
			<td>27.3%</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>P4-01*</td>
			<td>Chr15</td>
			<td>1000</td>
			<td>1000</td>
			<td>2569</td>
			<td>22</td>
			<td>9</td>
			<td>40.9%</td>
			<td>illustré à la figure 2</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Efficacité du KI dans trois loci génomiques indépendants de l’ESC. *Ces projets n’ont pas encore été publiés. Le nom de ces gènes sera divulgué dans des manuscrits indépendants à l’avenir.

Nous présentons ici un protocole pour le développement de modèles murins génétiquement modifiés utilisant des cellules souches embryonnaires, en particulier pour les grands knock-in d’ADN (KI). Ce protocole est mis au point à l’aide de l’édition du génome CRISPR / Cas9, ce qui permet d’améliorer considérablement l’efficacité du KI par rapport à la méthode conventionnelle de ciblage de l’ADN linéarisé par recombinaison homologue.

Ciblage génique hautement efficace médié par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

La production de souris génétiquement modifiées et l’analyse de leur phénotype nous permettent de comprendre en détail des fonctions génétiques spécifiques, in vivo. De nombreuses découvertes importantes ont été découvertes à l’aide de modèles animaux génétiquement modifiés. La méthode que nous décrivons ici permet à un ADN long d’implanter des cellules souches avec une efficacité acceptable sans sélection de médicament.La technique est bénéfique non seulement pour les sciences fondamentales de la vie, mais les résultats seront également mis en œuvre dans les sciences appliquées telles que la science médicale et la science animale. Le Dr Chihiro Emori, professeur adjoint, et le Dr Manabu Ozawa, professeur agrégé de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Après avoir préparé le fibroblaste embryonnaire de souris, préparez le plat de culture cellulaire recouvert de gélatine comme décrit dans le manuscrit et incuberez-le pendant deux heures dans un incubateur humide.Retirez la solution de gélatine, lavez le plat deux fois avec du PBS et conservez-le à température ambiante jusqu’à utilisation. Décongeler le stock de MEF congelé inactivé mitotiquement à l’aide d’un bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius pendant une minute. Un jour avant l’ensemencement de l’ESC, placer le MEF sur une capsule de 60 millimètres recouverte de gélatine.Décongeler un tube de stockage d’ESC congelé comme indiqué précédemment et placer une fois 10 à la cinquième CSE sur une boîte de 60 millimètres contenant du MEF pré-ensemencé. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu de culture ESC et incuber la capsule jusqu’à ce que l’ESC atteigne 50 à 70% de confluence. Après avoir lavé l’ESC cultivé avec quatre millilitres de PBS, digérez-les avec 800 microlitres de solution d’EDTA à 0,25% de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Une fois que la trypsine est inactivée avec un millilitre d’ESCM, ajoutez un millilitre d’ESCM frais aux cellules, transférez le milieu dans un tube et granulez les cellules par centrifugation à 280 G pendant cinq minutes. Après avoir remis les cellules en suspension dans un millilitre d’ESCM frais, compter la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration bleu trypan. Après avoir transféré une fois 10 au cinquième CES dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et les avoir lavés trois fois avec du PBS par centrifugation, remettre en suspension la pastille d’ESC dans 12 microlitres de mélange d’ADN Cas9 RNP et bien mélanger par pipetage doux pour éviter les bulles.Ensuite, servez l’ESC suspendu pour l’électroporation. Ensuite, cultivez les CSE électroporées dans une boîte de 60 millimètres contenant quatre millilitres d’ECSM avec du MEF mitotiquement inactivé et continuez à changer le milieu quotidiennement. Trois à cinq jours après l’électroporation, laver les CES avec quatre millilitres de PBS puis les digérer avec 800 microlitres d’EDTA à 0,25% trypsine et les cultiver dans un incubateur humide.Ensuite, ajoutez deux millilitres d’ESCM pour arrêter la digestion de la trypsine. Une fois que le mélange de cellules est granulé, remettez le granulé en suspension dans un millilitre d’ESCM frais et comptez la concentration de la cellule à l’aide d’un compteur de cellules avec coloration bleue de trypan. Faire passer les CSE une fois 10 à la troisième cellule par boîte de 60 millimètres contenant l’ESCM et le MEF d’alimentation.Assurez-vous de changer le milieu jusqu’à ce que la colonie se rétablisse. Cinq à sept jours après le premier passage, une fois que l’ESCM est aspiré de la boîte de culture ESC, ajoutez quatre millilitres de PBS. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, prélevez des colonies d’ESC simples contenant cinq microlitres de PBS au stéréomicroscope.Placer les colonies individuelles dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 puits contenant 15 microlitres de solution d’EDTA à 0,25% de trypsine. Après avoir incubé la plaque de 96 puits, arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 80 microlitres d’ESCM et en dissociant les colonies d’ESC en cellules individuelles par pipetage. Pour le génotypage par PCR, transférer 40 microlitres de suspension d’ESC dans une plaque de 96 puits sans gélatine et sans alimentation contenant 50 microlitres d’ESCM par puits.Pour constituer le stock d’ESC congelé, transférer les 60 microlitres restants de suspension d’ESC dans un puits d’une plaque de 24 puits recouverte de gélatine contenant 500 microlitres d’ESCM et de MEF d’alimentation. Stocker des clones d’ESC individuels cultivés dans la plaque de 24 puits jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 60 à 80 % et récupérer les clones d’ESC individuels par trypsinisation, comme démontré précédemment. Après avoir obtenu la pastille cellulaire par centrifugation, remettre en suspension 500 microlitres de milieu de congélation cellulaire pour congeler les cellules à moins 80 degrés Celsius.Pour le génotypage par PCR, cultivez les clones d’ESC comme démontré précédemment et retirez l’ESCM de chaque puits par aspiration avant de le laver deux fois avec 100 microlitres de PBS. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse contenant la protéinase K et mélangez bien. Maintenant, transférez le lysat ESC dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et conservez-le dans une chambre de chaleur à 65 degrés Celsius pendant au moins une heure.Une fois que l’ADN génomique est dissous dans 20 microlitres d’eau sans DNase, déterminez la pureté et la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Après avoir effectué la PCR génomique à l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques au locus pour amplifier la région cible, vérifiez la séquence et choisissez les clones ESC avec les séquences knock-in souhaitées. Après l’accouplement des femelles traitées aux hormones avec les mâles ICR et la collecte de l’oviducte, placer les oviductes prélevés dans des gouttes FHM et récupérer les embryons au stade à deux ou quatre cellules en rinçant l’oviducte avec FHM à l’aide d’une aiguille de rinçage insérée dans l’infundibulum.Lavez les embryons prélevés en les déplaçant dans plusieurs gouttes fraîches de MHF à l’aide d’une pipette buccale. Culture des embryons dans 50 microlitres de KSOM gouttes sur une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres recouverte d’huile minérale comme démontré précédemment pendant une journée jusqu’à ce que le stade de huit cellules ou morula soit atteint. Préparer des pipettes en verre pour maintenir les embryons et l’injection d’ESC à l’aide d’un extracteur et d’une microforge.Après avoir intégré une pipette de maintien contenant de la MHF dans un support capillaire relié à un micro-injecteur, installez-le sur le côté gauche du micromanipulateur. Connectez une pipette d’injection à un autre micro-injecteur et installez-la sur le côté droit. Alignez les deux pipettes directement dans le champ de vision du microscope.Faire des gouttes de cinq microlitres de pyrrolidone polyvinylique à 12% et des gouttes de cinq microlitres de FHM sur le même couvercle d’un plat de 60 millimètres, côte à côte. Couvrir les gouttes avec de l’huile minérale. Transférer les embryons dans cinq microlitres de goutte de MHF et ajouter un à cinq microlitres de suspension d’ESC à la goutte de MHF contenant des embryons.Une fois la pipette d’injection lavée avec de la polyvinylpyrrolidone, déplacer la pipette d’injection vers la goutte contenant les embryons et les ESC. Choisissez trois doublets ESC individuels qui viennent de terminer leur division cellulaire dans la pipette d’injection. À l’aide de la pipette de maintien, tenir un embryon de stade de huit cellules ou de morula qui a terminé le compactage par aspiration et faire un trou dans la zone pellucide avec une impulsion piézoélectrique.Expulser l’ESC à six cellules à l’intérieur de la zone pellucide et retirer la pipette des embryons. Lavez doucement les embryons injectés par l’ESC avec plusieurs gouttes de KSOM à l’aide d’une pipette buccale et incuber dans une nouvelle goutte KSOM de 50 microlitres recouverte d’huile minérale, comme démontré précédemment, jusqu’à ce que les embryons atteignent le stade de blastocyste. Un amplicon PCR de taille spécifique à la cible knock-in est obtenu et 9 clones sur 22 ont montré une bande spécifique knock-in.Ces résultats sont efficaces et reproductibles pour l’inactivation génique sans aucune sélection de médicaments. La détermination de la taille optimale des colonies d’ESC est très importante pour cette procédure. Évitez de choisir des colonies trop grandes ou trop petites.L’édition directe du génome médiée par CRISPR Cas9 à l’aide d’un zygote serait applicable à la fabrication de souris knock-out de gènes simples. Ce protocole de ciblage du gène ESC médié par CRISPR Cas9 facilite la production de diverses souris génétiquement modifiées pour une analyse future en sciences de la vie.

crisprcas9-mediated-highly-efficient-gene-targeting-embryonic-stem

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) peuvent être utilisés pour modifier le génome d'embryons de pré-implantation de souris en déclenchant à la fois la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH) des voies. Ces progrès permettent la génération rapide de la souris avec des modifications génétiques précises.

Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

La meilleure approche de la validation expérimentale de l’activité de l’amplificateur est l’analyse de perte de fonction. Voici un protocole efficace qui utilise la délétion médiée par CRISPR/Cas9 pour étudier la régulation de la transcription des gènes spécifique de l’allèle dans les cellules ES F1 qui contiennent un génome hybride (Mus musculus129 x Mus castaneus).

CRISPR Génération / cas9 Mediated monoallélique Suppressions pour étudier la fonction Enhancer dans souris cellules souches embryonnaires

La micro-injection d'ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L'intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

Un protocole pour rapide CRISPR/Cas9-mediated disruption de génique chez la souris et des cellules hématopoïétiques humaines primaires est décrit dans cet article. Ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA sont introduits par électroporation avec sgRNAs des vicitimes in vitro de transcription et commerciale Cas9. Édition de hautes efficacités sont réalisées avec peu de temps et de coût financier.

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Les protocoles décrits pour l'édition génomique très efficace des cellules hématopoïétiques et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) par le système CRISPR/Cas9 pour développer rapidement des systèmes de modèle de souris avec des modifications génétiques hématopoïétiques spécifiques au système.

Modification du génome de Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated pour l'étude des cellules hématopoïétiques dans les modèles de maladie

Ici, nous présentons une méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons à une cellule ainsi qu’un protocole qui couple l’utilisation d’embryons dégelés et l’électroporation pour la génération efficace de souris génétiquement modifiées.

Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

Le présent protocole décrit la micro-injection de zygotes de CRISPR-Cas9 et d’ADN de donneur pour produire efficacement des souris frappées par cassette de gènes et floxées.

Micro-injection de zygote pour la création d’allèles knock-in et flox de cassette génique chez la souris

Ici, nous décrivons une technique simple destinée à la génération efficace de souris génétiquement modifiées appelée CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Cette méthode délivre des réactifs d’édition par électroporation dans des embryons avec une efficacité proche de 100%. Ce protocole est efficace pour les mutations ponctuelles, les petites insertions génomiques et les délétions dans les embryons de mammifères.

Édition efficace du génome de souris par électroporation CRISPR de zygotes

Ce protocole présente une approche optimisée pour la production de modèles de rats génétiquement modifiés. Le virus adéno-associé (AAV) est utilisé pour fournir une matrice de réparation de l’ADN, et l’électroporation est utilisée pour délivrer des réactifs CRISPR-Cas9 afin de compléter le processus d’édition du génome dans un embryon à 2 cellules.

Édition du génome CRISPR-Cas9 d’embryons de rats à l’aide d’un virus adéno-associé (AAV) et d’une électroporation d’embryons à 2 cellules

La méthode présentée décrit la génération d’un gène knock-out médié par CRISPR dans la lignée H9 de cellules souches embryonnaires humaines (hESC), qui exprime de manière stable des sgRNA ciblant le gène L2HGDH à l’aide d’un système de distribution de gènes à médiation lentivirale très efficace.

Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

L’efficacité de la méthode I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) est comparable à celle de la micro-injection traditionnelle, qui nécessite la collecte de zygotes sur les femelles donneuses et le transfert à des femelles pseudo-enceintes. Ce protocole démontre son efficacité en introduisant des mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le locus ROSA26 sur le chromosome 6.

Amélioration de l’édition du génome via une technique d’électroporation in vivo basée sur l’administration d’acides nucléiques oviductaux pour la génération de souris knock-out

Découvrez le ciblage génique CRISPR/Cas9 dans les cellules souches embryonnaires pour créer des modèles murins génétiquement modifiés. Cette méthode améliore l'efficacité de l'intégration d'ADN long sans sélection médicamenteuse.

Ciblage génique hautement efficace médié par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes (Vidéo) | JoVE Journal

Ciblage génique hautement efficace médié par CRISPR/Cas9 dans des cellules souches embryonnaires pour le développement de modèles murins manipulés par des gènes

Explorer plus de vidéos