Name: Isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (AAV) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez l'ingénierie et le criblage de variants de capside AAV pour la thérapie génique. Cette méthode améliore l'efficacité et la spécificité de la livraison de transgènes thérapeutiques tout en réduisant les doses virales requises.

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D.G. apprécie grandement le soutien de la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par l’intermédiaire des centres de recherche collaborative DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) et TRR179 (Projektnummer 272983813), ainsi que du Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF, BMBF; TTU-VIH 04.819).

<ol><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
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<li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification%2C+Rational+Design+and+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756(2022).</li>
<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
<li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li>
<li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075(2014).</li>
<li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li>
<li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li>
<li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li>
<li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li>
<li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li>
<li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).</li>
<li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li>
<li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li>
<li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).</li>
<li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li>
<li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).</li>
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<li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li>
<li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).</li>
<li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNABarcodes%3A+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).</li>
<li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li>
<li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+design%3A+A+Goldilocks+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li>
<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).</li>
</ol>

D.G. est co-fondateur d’AaviGen GmbH. D.G. et K.R. sont des inventeurs sur une demande de brevet en instance liée à la génération de variantes de capside AAV échappant au système immunitaire. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, les étapes nécessaires à l’ingénierie de la capside AAV d’affichage peptidique et au criblage de bibliothèques AAV à code-barres, ainsi qu’à l’analyse bioinformatique de la composition de la bibliothèque et des performances de la capside, sont décrites. Ce protocole se concentre sur les étapes qui facilitent l’analyse bioinformatique de ces types de bibliothèques, car la plupart des laboratoires de virologie accusent un retard dans les compétences en programmation correspondant à leurs compétences en t...

La thérapie par transfert de gènes est l’introduction de matériel génétique dans les cellules pour réparer, remplacer ou modifier le matériel génétique cellulaire afin de prévenir, traiter, guérir ou améliorer la maladie. Le transfert de gènes, à la fois in vivo et ex vivo, repose sur différents systèmes d’administration, non viraux et viraux. Les virus ont évolué naturellement pour transduire efficacement leurs cellules cibles et peuvent être utilisés comme vecteurs de livraison. Parmi les différents types de vecteurs viraux utilisés en thérapie génique, les virus adéno-associés ont été de plus en plus utilisés, en raison de leur absence de pathogénicité, de leur innocuité, de leur faible immunogénicité et, surtout, de leur capacité à maintenir une expression non intégratrice à long terme 1,2,3. La thérapie génique AAV a donné lieu à des réalisations considérables au cours de la dernière décennie; trois thérapies ont été approuvées par l’Agence européenne des médicaments et la Food and Drug Administration des États-Unis pour une utilisation chez l’homme 3,4. Plusieurs essais cliniques sont également en cours pour traiter diverses maladies, comme l’hémophilie, les maladies musculaires, cardiaques et neurologiques, comme on l’a vu ailleurs3. Malgré des décennies de progrès, le domaine de la thérapie génique a connu une série de revers ces dernières années4, surtout des décès dans les essais cliniques5 qui ont été suspendus en raison de toxicités limitant la dose, en particulier pour les tissus massifs, tels que les muscles, ou difficiles à atteindre, tels que le cerveau6.
Les vecteurs AAV actuellement utilisés dans les essais cliniques appartiennent aux sérotypes naturels à quelques exceptionsprès 1. L’ingénierie AAV offre la possibilité de développer des vecteurs avec une spécificité et une efficacité supérieures pour les organes ou les cellules. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs approches ont été appliquées avec succès, telles que l’affichage peptidique, l’échange de boucles, le brassage de l’ADN de la capside, la PCR sujette aux erreurs et la conception ciblée, pour générer des variantes AAV individuelles ou des bibliothèques de celles-ci avec diverses propriétés7. Ceux-ci sont ensuite soumis à de multiples cycles d’évolution dirigée pour sélectionner les variantes en leur sein avec les propriétés souhaitées, comme examiné ailleurs 1,3. De toutes les stratégies d’évolution de la capside, les bibliothèques AAV d’affichage peptidique ont été les plus largement utilisées, en raison de certaines propriétés uniques: elles sont relativement faciles à générer et peuvent atteindre une grande diversité et un séquençage à haut débit, ce qui permet de suivre leur évolution.
Les premières bibliothèques AAV d’insertion de peptides réussies ont été décrites il y a près de 20 ans. Dans l’un des premiers, Perabo et al.8 ont construit une bibliothèque de capsides AAV2 modifiées, dans laquelle un pool d’oligonucléotides générés aléatoirement a été inséré dans un plasmide à une position qui correspond à l’acide aminé 587 de la protéine de capside VP1, dans le triple axe dépassant de la capside. En utilisant la co-infection par l’adénovirus, la bibliothèque AAV a été développée à travers plusieurs cycles de sélection, et les variantes finales reciblées se sont révélées capables de transduire des lignées cellulaires réfractaires à l’AAV2parental 8. Peu de temps après, Müller et al.9 ont introduit le système en deux étapes pour la production en bibliothèque, une amélioration significative du protocole. Initialement, la bibliothèque plasmidique, ainsi qu’un plasmide auxiliaire adénoviral, sont utilisés pour produire une bibliothèque AAV qui contient des capsides chimériques. Cette bibliothèque de navettes AAV est utilisée pour infecter des cellules à faible multiplicité d’infection (MOI), dans le but d’introduire un génome viral par cellule. La co-infection par l’adénovirus assure la production d’AAV avec un génome et une capside9 correspondants. Environ une décennie plus tard, Dalkara10 a utilisé l’évolution dirigée in vivo pour créer la variante 7m8. Cette variante a une insertion de 10 acides aminés (LALGETTRPA), dont trois agissent comme des agents de liaison, et cible efficacement la rétine externe après injection intravitréenne10. Cette capside artificielle est une réussite exceptionnelle, car c’est l’une des rares capsides modifiées à se rendre à la clinique jusqu’àprésent11.
Le domaine a connu un deuxième coup de pouce avec l’introduction de techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS). Deux publications d’Adachi et al.12 en 2014 et de Marsic et al.13 en 2015, ont montré la puissance du NGS pour suivre la distribution des bibliothèques de capsides AAV à code-barres avec une grande précision. Quelques années plus tard, le NGS des régions à code-barres a été adapté à la région d’insertion peptidique pour suivre l’évolution de la capside. Körbelin et coll.14 ont effectué un dépistage guidé par NGS pour identifier une capside pulmonaire ciblée basée sur AAV2. L’analyse NGS a permis de calculer trois scores de notation : le score d’enrichissement entre les tours de sélection, le score de spécificité générale pour déterminer la spécificité tissulaire, et enfin le score combiné14. Le laboratoire Gradinaru15 a publié le système d’évolution ciblée AAV basé sur la recombinaison Cre (CREATE) la même année, qui facilite une sélection spécifique au type cellulaire. Dans ce système, la bibliothèque de capsides porte un commutateur Cre-inversible, car le signal polyA est flanqué de deux sites loxP. La bibliothèque AAV est ensuite injectée chez les souris Cre, où le signal polyA est inversé uniquement dans les cellules Cre+, fournissant le modèle pour la liaison d’une amorce de PCR inverse avec l’amorce directe dans le gène de la capside. Ce sauvetage PCR très spécifique a permis l’identification de l’AAV-PHP. Variante B qui peut traverser la barrière hémato-encéphalique15. Ce système a ensuite évolué pour devenir M-CREATE (Multiplexed-CREATE), dans lequel NGS et la génération de bibliothèques synthétiques ont été intégrées dans le pipeline16.
Une version améliorée à base d’ARN de ce système du laboratoire Maguire17, iTransduce, permet de sélectionner au niveau de l’ADN des capsides qui transduisent fonctionnellement les cellules et expriment leurs génomes. Le génome viral de la bibliothèque d’affichage peptidique comprend un gène Cre sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire et le gène de la capside sous le contrôle du promoteur p41. La bibliothèque est injectée chez des souris qui ont une cassette loxP-STOP-loxP en amont de tdTomato. Les cellules transduites avec des variantes AAV qui expriment le génome viral et donc Cre expriment tdTomato et, en combinaison avec des marqueurs cellulaires, peuvent être triées et sélectionnées17. De même, Nonnenmacher et al.18 et Tabebordbar et al.19 ont placé la bibliothèque de gènes de la capside sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux tissus. Après injection dans différents modèles animaux, l’ARN viral a été utilisé pour isoler les variantes de capside.
Une autre approche consiste à utiliser le code-barres pour baliser les bibliothèques de capsides. Le laboratoire Björklund20 a utilisé cette approche pour les bibliothèques de capsides d’insertion de peptides à code-barres et a développé l’évolution rationnelle du vecteur AAV à code-barres (BRAVE). Dans un plasmide, la cassette Rep2Cap est clonée à côté d’un transgène à code-barres à répétitions terminales inversées (ITR) exprimant une protéine fluorescente jaune (YFP). En utilisant des sites loxP entre la fin du bouchon et le début du code-barres, une recombinaison Cre in vitro génère un fragment suffisamment petit pour le NGS, permettant ainsi l’association de l’insertion peptidique avec le code-barres unique (table de consultation, LUT). La production d’AAV est réalisée à l’aide de la bibliothèque plasmidique et les codes-barres exprimés dans l’ARNm sont criblés après application in vivo , toujours avec NGS20. Lorsque les bibliothèques de capsides comprennent des variantes de l’ensemble du gène de la capside (c.-à-d. bibliothèques mélangées), le séquençage à lecture longue doit être utilisé. Plusieurs groupes ont utilisé des codes-barres pour étiqueter ces diverses bibliothèques, ce qui permet à NGS d’avoir une profondeur de lecture plus élevée. Le laboratoire Kay21 a étiqueté des bibliothèques mélangées de capsides très diverses avec des codes-barres en aval du signal polyA du capuchon . Dans un premier temps, une bibliothèque de plasmides à code-barres a été générée et la bibliothèque de gènes de capside mélangée y a été clonée. Ensuite, une combinaison de MiSeq (lecture courte, profondeur de lecture plus élevée) et PacBio (lecture longue, profondeur de lecture inférieure) NGS ainsi que le séquençage Sanger a été utilisée pour générer leur LUT21. En 2019, Ogden et ses collègues du laboratoireChurch 22 ont délimité l’aptitude de la capside AAV2 à plusieurs fonctions à l’aide de bibliothèques comportant des mutations, des insertions et des suppressions ponctuelles dans chaque position, ce qui a finalement permis une conception guidée par machine. Pour la génération de la bibliothèque, des fragments plus petits du gène de la capside ont été synthétisés, marqués avec un code-barres, séquencés de nouvelle génération, puis clonés dans le gène complet de la capside. Les données NGS ont été utilisées pour générer une LUT. La bibliothèque a ensuite été examinée à l’aide uniquement des codes-barres et du séquençage de lecture courte, ce qui permet une profondeur de lecture plus élevée22.
Les bibliothèques à code-barres ont été principalement utilisées pour examiner un pool de variantes connues, naturelles et artificielles après plusieurs cycles de sélection de bibliothèques de capsides ou indépendamment d’une étude de l’évolution de la capside. L’avantage de ces bibliothèques est la possibilité de cribler plusieurs capsides, tout en réduisant le nombre d’animaux et en minimisant les variations entre les animaux. Les premières études qui ont introduit cette technologie dans le domaine de l’AAV ont été publiées il y a près de dix ans. Le laboratoire Nakai 12 a marqué 191 mutants doubles alanine couvrant les acides aminés 356 à 736 sur le VP1 de AAV9 avec une paire de codes-barres12 nucléotides. À l’aide de NGS, la bibliothèque a été examinée in vivo pour la liaison au galactose et d’autres propriétés12. Marsic et ses collègues ont délimité la biodistribution des variantes AAV en utilisant également une analyse à double barcordée 1 an plus tard13. Une étude plus récente chez des primates non humains a comparé la biodistribution dans le système nerveux central de 29 capsides en utilisant différentes voies d’administration23. Notre laboratoire a récemment publié des criblages de bibliothèque AAV à code-barres de 183 variantes comprenant des AAV naturels et artificiels. Ces criblages au niveau de l’ADN et de l’ARN ont conduit à l’identification d’une variante AAV24 hautement myotrope chez la souris ainsi que d’autres présentant une spécificité de type cellulaire élevée dans le cerveau de souris25.
Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée dans ce travail et l’élargissons pour inclure le criblage des bibliothèques d’affichage de peptides AAV. Cela comprend la génération de bibliothèques d’affichage de peptides AAV2, une méthode de PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) pour la quantification, et enfin un pipeline NGS pour analyser les variantes AAV, basé en partie sur les travaux de Weinmann et ses collègues24. Enfin, une description de la génération de bibliothèques AAV à code-barres et du pipeline NGS utilisé dans la même publication est fournie.

<table><tbody><tr><td>Amorce d’amplification</td><td>ELLA Biotech (Munich, Allemagne)</td><td>-</td><td>Synthèse du second brin d’un insert d’oligonucléotides</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Réactifs</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>5067-1504 Validation des</td><td>fragments d’ADN</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent</td><td>Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>G2938C</td><td>Validation des fragments d’ADN</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>80204</td><td>Extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Réactifs</td><td>Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>5067-1504</td><td>Préparation de la banque NGS</td></tr><tr><td>Système de bioanalyseur Agilent 2100 Agilent</td><td>Technologies (Santa Clara, CA, USA)</td><td>G2938C</td><td>Préparation de la bibliothèque NGS</td></tr><tr><td>BC-seq fw :&nbsp ;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td><td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&nbsp ;</td><td>Préparation de la bibliothèque NGS</td></tr><tr><td>BC-seq rv :&nbsp ; &nbsp ;</td><td>IDT (San Joce, CA, CA, USA)</td><td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&NBSP ;</td><td>Préparation de la bibliothèque NGS</td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td><td>44-420-3250ML</td><td>Extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>BglI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>R0143</td><td>Digestion d’insert double brin</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1851196</td><td>dd-PCR cycler dNTPS</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>N0447S</td><td>NGS Préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP)</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863024</td><td>dd-PCR supermix</td></tr><tr><td>Huile de génération de gouttelettes</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863005</td><td>dd-PCR Huile de génération de gouttelettes</td></tr><tr><td>DG8 Cartouches pour générateur de gouttelettes QX100 / QX200</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864008</td><td>Cartouche de génération de gouttelettes dd-PCR</td></tr><tr><td>DG8</td><td>Porte-cartouche Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1863051</td><td>Porte-cartouche dd-PCR</td></tr><tr><td>Générateur de gouttelettes DG8 Joint Bio-Rad</td><td>(Hercules, CA, USA)</td><td>1863009</td><td>Couvercle dd-PCR pour cartouche</td></tr><tr><td>Plaques ddPCR 96 puits, Semi-Jupe</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>12001925</td><td>dd-PCR Plaque 96 puits</td></tr><tr><td>E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cellules</td><td>Lucigen (Middleton, WI, USA)</td><td>60081-1</td><td>Cellules électrocompétentes</td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation, 1mm</td><td>Biozym Scientific (Oldendorf, Allemagne)</td><td>748050</td><td></td></tr><tr><td>Mélange d’amorce/sonde d’électroporation GAPDH</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>Mm00186825_cn</td><td>Amorce qPCR Taqman</td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité</td> par électroporation <td>Applied Biosystems (Waltham, MA, États-Unis)</td><td>4368814</td><td>Transcription inverse de l’ADNc</td></tr><tr><td>ITR_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, États-Unis)</td><td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>amorce dd-PCR</td></tr><tr><td>ITR_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, États-Unis)</td><td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>ITR_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>HEX-CACTCCCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>sonde dd-PCR</td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 500 system</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td><td>SY-415-1001</td><td>NGS Library séquençage</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td><td>Roche AG (Bâle, Suisse)</td><td>KK2600 07958919001</td><td>Préparation d’échantillons NGS</td></tr><tr><td>MagnaBot 96 Dispositif de séparation magnétique</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, USA)</td><td>V8151</td><td>Préparation d’échantillons pour la bibliothèque NGS</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 2000 Thermo</td><td>Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>ND-2000</td><td>Digestion d’un insert double brin</td></tr><tr><td>NGS_frw</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, États-Unis)</td><td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td><td>NGS primer</td></tr><tr><td>NGS_rev</td><td>Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)</td><td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td><td>NGS primer</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)</td><td>Illumina Inc (San Diego, CA, USA)</td><td>FC-404-2005</td> Système <td>de séquençage NGS</td></tr> Library <tr><td>Ovation Library Kit for Low Complexity Samples Kit&nbsp ;</td><td>NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, États-Unis)</td><td>9092-256</td><td>NGS Préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>PX1 Scelleuse de plaques&nbsp ;</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1814000</td><td>dd-PCR scelleuse de plaques</td></tr><tr><td>Feuille perçable Thermoscellage</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1814040</td><td>dd-PCR feuille d’étanchéité</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F530S</td><td>Synthèse deuxième brin de l’insert oligonucléotidique</td></tr><tr><td>PEI MAX - Chlorhydrate de polyéthylénimine linéaire de qualité transfection (MW 40,000)</td><td>Polysciences, Inc. (Warrington, Pennsylvanie, États-Unis)</td><td>24765-1G</td><td>Préparation de la banque</td></tr><tr><td>AAV ProNex Système de purification sélective en fonction de la taille</td><td>Promega GmbH (Madison, WI, États-Unis)</td><td>NG2002</td><td>Préparation d’échantillons pour la bibliothèque NGS</td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II Polymerase&nbsp ;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>F549L</td><td>NGS Préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche AG (Bâle, Suisse)</td><td>5963117103</td><td>Extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>pRep2Cap2_PIS</td><td></td><td></td><td>vecteur ITR-Rep2Cap2-ITR. Site d’insertion peptidique dans l’ORF Cap2, fabriqué/préparé en laboratoire&nbsp ;</td></tr><tr><td>QX200 Générateur de gouttelettes</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864002</td><td>générateur de gouttelettes dd-PCR</td></tr><tr><td>QX200 Lecteur de gouttelettes</td><td>Bio-Rad (Hercules, CA, USA)</td><td>1864003</td><td>analyse de gouttelettes dd-PCR</td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>28306</td><td>Synthèse deuxième brin de purification d’inserts d’oligonucléotides</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>28704</td><td>Purification de vecteurs plasmidiques</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>12162</td><td>Préparation de l’ADN de la bibliothèque de plasmides</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR Kit</td><td>de purification Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>28104</td><td>Préparation d’échantillons pour la bibliothèque NGS</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Invitrogen (Waltham, MA, USA)</td><td>Q32857</td><td>Préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>NGS Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>Q32851</td><td>NGS Préparation de la bibliothèque</td></tr><tr><td>QuantiFast PCR Master Mix</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>1044234</td><td>Taqman qPCR</td></tr><tr><td>rep_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>rep_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>CAATCACGGCGCACATGT</td><td>dd-PCR</td></tr><tr><td>primer rep_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td><td>sonde dd-PCR</td></tr><tr><td>DNase sans RNase</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>79254</td><td>Extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>R0123</td><td>Digestion du vecteur</td></tr><tr><td>5 mm, acier Perles</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>69989</td><td>Extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>TRIMER-oligonucléotides</td><td>ELLA Biotech (Munich, Allemagne)</td><td>-</td><td>Oligonucléotide dégénéré</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)</td><td>M0202L</td><td>Ligature de la bibliothèque de plasmides</td></tr><tr><td>TissueLyserLT</td><td>Qiagen (Venlo, Pays-Bas)</td><td>85600</td><td>Extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>YFP_fw</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>YFP_rv</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td><td>dd-PCR primer</td></tr><tr><td>YFP_probe</td><td>IDT (San Joce, CA, USA)</td><td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td><td>sonde dd-PCR</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)</td><td>Zymo research (Irvine, CA, USA)</td><td>D4013</td><td>Purification de vecteurs et de ligatures</td></tr></tbody></table>

isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (aav)

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

Les vecteurs de livraison de gènes dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont l’un des outils les plus prometteurs pour le traitement des maladies génétiques, comme en témoignent les données cliniques encourageantes et l’approbation de plusieurs thérapies géniques AAV. Deux raisons majeures du succès des vecteurs AAV sont (i) l’isolement préalable de divers sérotypes viraux naturels ayant des propriétés distinctes, et (ii) la mise en place ultérieure de technologies puissantes pour leur ingénierie moléculaire et leur réutilisation à haut débit. Le potentiel de ces techniques est récemment mis en œuvre pour coder à barres des capsides AAV sélectionnées au niveau de l’ADN et de l’ARN, permettant leur stratification in vivo complète et parallèle dans tous les principaux organes et types de cellules d’un seul animal. Ici, nous présentons un pipeline de base englobant cet ensemble de voies complémentaires, en utilisant l’affichage peptidique AAV pour représenter l’arsenal diversifié de technologies d’ingénierie de capside disponibles. En conséquence, nous décrivons d’abord les étapes cruciales de la génération d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV pour la sélection in vivo de candidats ayant les propriétés souhaitées, suivie d’une démonstration de la façon de coder à barres les variantes de capside les plus intéressantes pour le criblage secondaire in vivo. Ensuite, nous illustrons la méthodologie de création de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris l’amplification de codes-barres et la ligature d’adaptateurs, avant de conclure par un aperçu des étapes les plus critiques de l’analyse des données NGS. Comme les protocoles rapportés ici sont polyvalents et adaptables, les chercheurs peuvent facilement les exploiter pour enrichir les variantes optimales de capside AAV dans leur modèle de maladie préféré et pour des applications de thérapie génique.

Génération d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV2. Comme première étape vers la sélection d’AAV techniques, la génération d’une bibliothèque de plasmides est décrite. L’insert peptidique est produit à l’aide d’amorces dégénérées. Réduire la combinaison de codons chez ceux de 64 à 20 a l’avantage d’éliminer les codons stop et de faciliter l’analyse NGS, en réduisant la diversité des bibliothèques sur l’ADN mais pas au niveau de la protéine. L’insert d’oligonucléotide est acheté sous forme d’ADN ...

Génération de bibliothèque d’affichage de peptides AAV et validation ultérieure par le codage à barres de candidats ayant de nouvelles propriétés pour la création d’AAV de nouvelle génération.

Isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (AAV)

Gene delivery vectors derived from Adeno-associated virus (AAV) are one of the most promising tools for the treatment of genetic diseases, evidenced by ...

Ce protocole comble un écart important entre l’évolution naturelle des virus et leur utilisation comme vecteurs recombinants pour la thérapie génique humaine en permettant leur ingénierie, leur diversification et leur stratification. Cette technique permet le criblage parallèle à haut débit de virus adéno-associés nouveaux, isolés ou modifiés, en abrégé AAV, ce qui permet d’économiser sur le nombre d’animaux, le travail, les coûts et le temps. Les variantes de capside du VHA identifiées peuvent augmenter l’efficacité et la spécificité de l’administration de transgènes thérapeutiques à base d’AAV, réduisant ainsi la dose virale requise.Cela pourrait améliorer la sécurité et l’applicabilité de la thérapie génique. La même approche pourrait également être utilisée pour l’ingénierie de la capside ou du promoteur d’autres véhicules de livraison de gènes, ce qui améliore notre compréhension de leur biologie et de leur utilisation en thérapie génique. Les doctorants Jonas Becker et Jixin Liu, la post-doctorante Joanna Szumska et Margarita Zayas, ainsi que les assistantes de recherche Emma Gerstmann et Ellen Widtke de mon laboratoire aideront à démontrer la procédure.Commencez par analyser les données de séquençage NGS avec Python 3 et Biopython. L’analyse NGS est composée de deux étapes. Pour la première étape, recherchez dans les fichiers de séquence des séquences qui répondent à des critères spécifiques tels que les séquences latérales, la longueur et l’emplacement à l’aide du script un, ainsi qu’un fichier de configuration qui fournit les informations nécessaires.Pour la deuxième étape, traduisez les séquences extraites à partir de la séquence AGWGGC en utilisant le script numéro deux et la configuration et zuordnung. txt qui fournit les informations nécessaires. Préparez deux dossiers : script et données.Copiez les fichiers compressés Gzip résultant du séquençage dans le dossier de données. Copiez ensuite les fichiers Python et de configuration dans le dossier de script comme décrit dans le manuscrit texte. Avant d’exécuter les scripts, ouvrez le zuordnung.TXT et ajoutez deux colonnes séparées par des tabulations. Entrez les noms des fichiers Gzip dans la première colonne et le nom final souhaité dans la deuxième colonne. Modifiez les variables dans le fichier de configuration comme décrit dans le manuscrit texte.À l’aide de la commande spécifique, lancez la détection et l’extraction de la séquence de variantes. La sortie sera des fichiers TXT avec les séquences d’ADN extraites et leur nombre de lectures. L’en-tête de ce fichier contient des données statistiques et ces données seront transférées dans les fichiers suivants.Ces données TXT seront le fichier d’entrée du script numéro deux dans lequel les séquences d’ADN sont traduites, classées et analysées. À l’aide de la commande spécifique, lancez la traduction PV et l’analyse des fichiers de sortie texte du script un, comme décrit dans le manuscrit du texte. Les fichiers de sortie du script numéro deux seront nommés à l’aide de la deuxième colonne de la table de choix dans zuordnung.TXT avec extensions basées sur le type d’analyse. Assurez-vous que les trois fichiers de sortie contiennent des données statistiques dans les premières lignes et une première colonne avec l’index de chaque séquence d’ADN des fichiers texte d’entrée. Les colonnes restantes doivent comprendre la séquence d’ADN, le nombre de lectures, la lecture directe ou inverse et la séquence peptidique traduite.Les séquences non valides doivent avoir NA et ne pas être valides dans les deux dernières colonnes. Visualisez les fichiers de sortie à l’aide des logiciels disponibles en fonction des besoins de l’utilisateur. Pour effectuer l’analyse des données de séquençage NGS à l’aide de code personnalisé dans Python 3, le flux de travail comprend la détection de séquences de codes-barres guidées par les séquences latérales, leur longueur et leur emplacement, ainsi que l’analyse de l’enrichissement et de la distribution des codes-barres sur l’ensemble des tissus.Préparez deux dossiers : script et données. Copiez les fichiers compressés Gzip résultant du séquençage dans le dossier de données. Copiez ensuite le python et les fichiers de configuration dans le dossier de script comme décrit dans le manuscrit texte.Avant d’exécuter le script, créez deux fichiers texte délimités par des tabulations :capsidvariance. txt avec les séquences de codes-barres attribuées aux noms de variantes de capside AAV et la contamination. TXT avec des séquences de codes-barres provenant d’une contamination possible.Enfin, modifiez le fichier de configuration pour inclure les informations du chemin d’accès au dossier avec les données de séquencement, la séquence des régions flanquantes des codes-barres, leur position et la taille de la fenêtre pour la détection des codes-barres. Exécutez le script de détection de code-barres avec les chemins d’accès et les fichiers de configuration fournis à l’aide de la commande correspondante. La sortie de l’exécution de cette commande sera des fichiers TXT avec des recomptages par variante de capside et le nombre total de lectures récupérées à partir des données brutes.Évaluer la distribution de la capside AAV à code-barres parmi les tissus ou les organes, dans la zuordnung. TXT, attribuez le nom de chaque fichier texte obtenu à partir de l’exécution de détection de code-barres à un nom de tissu ou d’organe. Ajoutez les noms des fichiers texte dans la première colonne et les noms de tissus ou d’organes correspondants dans l’affectation délimitée par des onglets.Créez un organe. TXT avec la liste des noms des organes sur et hors cible, qui correspondent aux noms donnés dans l’affectation Zuordnung. TXT.Ensuite, créez normalization_organ. txt et normalization_variant. Fichiers texte délimités par la tabulation TXT avec des valeurs normalisées pour toutes les variantes de capside et tous les organes et tissus.Dans la première colonne avec le normalization_organ. txt, écrivez les noms donnés pour chaque organe et la deuxième colonne avec les valeurs de normalisation du tissu correspondant. Renseignez la première colonne de la normalization_variant.TXT avec la liste des noms de capside et la deuxième colonne avec les valeurs normalisées du nombre de lectures pour chaque capside dans la bibliothèque regroupée. Modifiez le fichier de configuration en spécifiant les chemins d’accès complets à tous les fichiers supplémentaires et exécutez le script d’analyse de code-barres à l’aide de cette commande spécifique. Le script d’analyse de code-barres génère plusieurs fichiers tels que les fichiers texte avec la concentration relative ou les valeurs RC de la distribution de la capside dans différents tissus en fonction de plusieurs étapes de normalisation décrites précédemment, et le fichier de feuille de calcul qui combine les données du fichier texte dans les données matricielles fusionnées.Visualisez les données et effectuez une analyse groupée des données matricielles comme décrit dans le manuscrit texte. Le script saisira la concentration relative. xls et générer deux tracés de carte thermique de cluster hiérarchique et d’analyse en composantes principales.Pour modifier des tracés ou des paramètres PNG, ouvrez le script R et suivez les instructions de la section des commentaires. Les régions quantifiées du gène AAV2 rep ont montré que 99,2% étaient positives pour ITR, ce qui suggère que les capsides AAV contenaient l’intégralité des génomes viraux. Dans les trois ensembles, les lectures extraites basées sur des séquences de signatures spécifiques à la bibliothèque représentaient environ 94% du total des lectures, ce qui indique une bonne qualité.Parmi ceux-ci, plus de 99 % étaient des lectures PV valides et plus de 99 % des lectures PV valides étaient uniques, ce qui suggère que la bibliothèque était équilibrée avec une grande diversité interne. Les deux principales branches de la hiérarchie de la carte thermique reflétaient la différence d’efficacité de transduction des variantes de capside. La branche gauche avec la majorité des variantes de capside comprenait toutes les capsides qui montraient une valeur de concentration relative élevée dans la plupart des tissus.Outre une spécificité hépatique étonnamment élevée, trois autres capsides présentaient une spécificité dans le diaphragme, le muscle squelettique, les biceps et le cerveau. La branche droite du regroupement hiérarchique comprenait les variantes de capside avec une efficacité de transduction globale plus faible plus évidente dans le duodénum et le pancréas. L’analyse en composantes principales pour le sous-ensemble original forme le groupe de variantes de capside avec une spécificité hépatique élevée et décrit le tropisme musculaire exceptionnel de la capside VAR60.Lorsque vous essayez ce protocole, vous devez faire attention aux erreurs de frappe. La syntaxe est également différente si vous utilisez l’invite de commande Windows par rapport à Linux. Après l’identification de nouvelles variantes d’AAV, le potentiel thérapeutique et translationnel doit être vérifié dans un modèle animal décédé ou plus grand.Cette technique permet une comparaison directe côte à côte des variantes AAV dans des conditions identiques et est extrêmement polyvalente, ouvrant la voie à sa traduction chez les grands animaux, voire chez l’homme.

isolation-next-generation-gene-therapy-vectors-through-engineering

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous démontrons la technique de base pour concevoir et faire évoluer moléculaire synthétiques viral adéno-associé (AAV) vecteurs de thérapie génique par l'intermédiaire de la famille réarrangement d'ADN. En outre, nous fournir des directives générales et des exemples représentatifs de sélection et d'analyse des différents capsides chimériques avec des propriétés améliorées sur les cellules cibles en culture ou chez la souris.

Vecteurs d&#39;ingénierie et de l&#39;évolution de la synthèse Adeno-Associated Virus (AAV) thérapie génique par la famille de réarrangement d&#39;ADN

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement &gt;1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

Nous présentons ici un protocole pour le développement et la validation de bonnes pratiques de laboratoire dans la détection conforme des vecteurs viraux adéno-associés dans les larmes humaines par réaction en chaîne de la polymérase numérique gouttelette à l’appui du développement clinique de vecteurs de thérapie génique.

Essai validable de réaction en chaîne de polymérase numérique par gouttelettes pour la détection de vecteurs viraux adéno-associés dans des études de bioexcrétion de larmes

Le virus adéno-associé recombinant (rAAV) est largement utilisé pour l’administration de gènes cliniques et précliniques. Une utilisation sous-estimée des rAAV est la transduction robuste des cellules en culture sans avoir besoin de purification. Pour les chercheurs qui découvrent le rAAV, nous fournissons un protocole pour le clonage de cassettes transgéniques, la production de vecteurs bruts et la transduction de cultures cellulaires.

Expression de transgènes dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés recombinants non purifiés

Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .

Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la génération et la purification de vecteurs viraux adéno-associés à l’aide d’une méthode de chromatographie d’affinité optimisée basée sur l’héparine. Il s’agit d’une approche simple, évolutive et rentable, qui élimine le besoin d’ultracentrifugation. Les vecteurs résultants présentent une pureté et une activité biologique élevées, ce qui prouve leur valeur dans les études précliniques.

Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

Alors que le domaine de la thérapie génique continue d’évoluer, il existe un besoin croissant de méthodes innovantes capables de relever ces défis. Ici, une méthode unique est présentée, qui rationalise le processus de génération de vecteurs AAV à haut rendement et de haute pureté à l’aide d’une plate-forme d’usine de cellules, répondant aux normes de qualité des études in vivo .

Une procédure rationalisée et standardisée pour générer des vecteurs viraux adéno-associés de haute qualité et à forte teneur en titres à l’aide d’une plate-forme d’usine cellulaire

La quantification précise des copies du génome du vecteur du virus adéno-associé (AAV) est essentielle, mais un protocole standardisé n’a pas encore été établi. Ce protocole décrit une méthode validée pour la préparation d’échantillons d’AAV purifiés et la réalisation d’une réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) numérique en gouttelettes afin de quantifier de manière fiable le titre du génome viral.

Quantification de génomes viraux adéno-associés dans des échantillons de vecteurs purifiés par réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes

Ce protocole vise à introduire une méthode permettant de produire et de purifier des biomimétiques extracellulaires de vésicules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (MSC) pour la thérapie génique. La nanovésicule est confinée par des bicouches lipidiques dérivées de la MSC et encapsule des VA recombinants portant le gène d’intérêt dans la lumière. Cette nanovésicule offre un vecteur amélioré pour la délivrance de gènes in vivo .

Développement de nanovésicules enveloppées de membrane des cellules souches mésenchymateuses pour une meilleure délivrance de gènes

Découvrez l'ingénierie et le criblage de variants de capside AAV pour la thérapie génique. Cette méthode améliore l'efficacité et la spécificité de la livraison de transgènes thérapeutiques tout en réduisant les doses virales requises.

Isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (AAV) (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (AAV)

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