In vitro Méthode d’étude des différences fondées sur le sexe dans les cellules caliciformes conjonctivales

En étudiant la fonction des cellules caliciformes en culture primaire, nous obtenons des informations précieuses sur les mécanismes à l’origine des différences entre les sexes dans la santé de la surface oculaire. Nous avons modifié la méthode de culture primaire de cellules caliciformes conjonctivales déjà établie en éliminant les hormones et les substances œstrogéniques du système, permettant un contrôle plus précis des niveaux d’hormones sexuelles. Cette modification améliore l’exactitude et la fiabilité de nos conclusions.

La mesure intracellulaire du calcium est une méthode permettant d’étudier la fonction des cellules caliciformes sous divers stimuli et les voies de signalisation intracellulaires déclenchées par chaque stimulus. La technique peut être étendue au développement de médicaments pour les maladies de la surface oculaire comme l’allergie oculaire, la sécheresse oculaire ou la conjonctivite. Cette technique facilite le criblage de l’effet de diverses molécules sur les cellules caliciformes sous des niveaux hormonaux spécifiques.

Les personnes qui découvrent cette technique ont souvent du mal à séparer le tissu conjonctival du tissu conjonctif. Notre conseil est de porter une attention particulière à la texture et aux propriétés matérielles du tissu. La conjonctive doit être élastique et semi-transparente tandis que le tissu conjonctif est généralement de couleur plus claire et ressemble à une fibre de coton.

Pour commencer, à l’aide d’un scalpel stérile, hachez le tissu conjonctival humain en morceaux d’un millimètre cube. Dans une plaque à six puits, semer quatre morceaux dans chaque puits contenant un millimètre de milieu RPMI complet. Assurez-vous d’ancrer les pièces à l’assiette.

Incubez les morceaux de tissu à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air. Rafraîchissez le milieu de culture tous les deux jours. Après 72 heures après l’ensemencement, retirez le bouchon tissulaire et poursuivez l’incubation jusqu’à ce que les cellules caliciformes atteignent 70 à 80 % de confluence.

Ensuite, rincez les cellules avec du PBS et ajoutez 0,05% de trypsine EDTA pour détacher les cellules du fond de la plaque. Observez le détachement cellulaire au microscope. Et une fois que les cellules se détachent, ajoutez un milieu RPMI complet pour désactiver la trypsine.

Centrifuger la suspension cellulaire à 150 G pendant cinq minutes et remettre la pastille en suspension dans un milieu RPMI sans rouge de phénol. Ensuite, réensemencez la suspension cellulaire sur une boîte de culture à fond en verre pour mesurer la concentration de calcium intracellulaire. Pour le chargement de Fura-2 AM, ajoutez un tampon de bicarbonate Krebs-Ringer contenant 0,5 % de HEPES, 0,5 % de BSA et 0,5 micromolaire de Fura-2 AM, huit micromolaires d’acide pluronique F127 et 250 micromolaires de sulfinpyrazone dans la boîte à fond en verre contenant des cellules caliciformes.

Incubez les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius, en les protégeant de la lumière. Après incubation, laver les cellules avec un tampon bicarbonate de Krebs-Ringer contenant 250 micromolaires de sulfinpyrazone. Pour la mesure de la concentration intracellulaire de calcium, placez la boîte contenant des cellules chargées en Fura-2 sous le microscope.

Ajoutez ensuite un grossissement de 200 fois. Localisez un champ représentatif contenant de 20 à 50 cellules. À l’aide de la fonction à main levée, tracez un contour autour de chaque cellule pour la distinguer de la fluorescence d’arrière-plan et attendez que le logiciel soustrait automatiquement la fluorescence d’arrière-plan de la mesure.

Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience et attendez huit à 15 secondes pour déterminer les niveaux de calcium de base dans les cellules. Ensuite, ajoutez soigneusement l’agoniste cholinergique carbachol et continuez à mesurer pendant au moins 120 secondes ou jusqu’à ce que les niveaux de calcium soient revenus à la ligne de base. À l’aide de la variation de la concentration maximale de calcium intracellulaire, calculez le taux moyen de calcium basal dans chaque cellule des huit à 15 premières secondes de mesure.

Supprimez de l’ensemble de données les cellules dont le taux moyen de calcium basal est égal ou supérieur à 500 nanomolaires. Ensuite, calculez la concentration maximale de calcium intracellulaire pour chaque cellule. Ensuite, soustrayez la valeur basale du taux de calcium de la concentration intracellulaire maximale mesurée pour la même cellule.

Enfin, faites la moyenne de la variation de la concentration maximale de calcium intracellulaire pour toutes les cellules d’une boîte. La pureté des cellules caliciformes conjonctivales humaines a été confirmée par coloration immunofluorescente, en utilisant des anticorps spécifiques aux marqueurs cellulaires caliciformes, à la cytokératine et à la lectine 1 d’Helix pomatia. Les résultats du test Fura-2 AM n’ont montré aucune différence significative entre les cellules incubées dans un RPMI sans rouge de phénol avec 1% de BSA et un milieu RPMI complet.

Cependant, une augmentation significative de la réponse calcique intracellulaire au carbachol a été observée en comparant le groupe de milieu RPMI avancé au groupe de milieu RPMI complet. Le plus important est d’obtenir une culture primaire de cellules caliciformes humaines d’une densité cellulaire suffisante. Pendant la croissance, assurez-vous que les morceaux de tissu adhèrent à la plaque de culture pour une croissance efficace.

Les chercheurs ont pu explorer l’implication de voies spécifiques en appliquant divers inhibiteurs, en ciblant des récepteurs ou des molécules de signalisation aux cellules avant la stimulation. Les autres paramètres indiquant la fonction des cellules caliciformes, comme la sécrétion de mucine et la désactivation des protéines kinases activées par les mitogènes, peuvent également être évalués. Les mesures complémentaires fournissent une compréhension complète de la réponse des cellules caliciformes à différents stimuli.