Name: Modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Découvrez la modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D à partir de cellules iPSC. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes impliqués dans les troubles neuropsychiatriques.

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Nous remercions Jenny Gringer Richards pour son travail approfondi dans la validation de nos sujets témoins, à partir desquels nous avons généré les CSPi de contrôle. Ce travail a été soutenu par NIH T32 MH019113 (à D.A.M. et K.A.K.), le Nellie Ball Trust (à T.H.W. et A.J.W.), NIH R01 MH111578 (à V.A.M. et J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (à A.J.W.) et le Roy J. Carver Charitable Trust (à V.A.M., J.A.W. et A.J.W.). Les figurines ont été créées avec BioRender.com.

La recherche sur des sujets humains a été approuvée sous le numéro d’approbation 201805995 du comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Iowa et le numéro d’approbation 2017-02 du comité des cellules souches pluripotentes humaines de l’Université de l’Iowa. Des biopsies cutanées ont été obtenues des sujets après avoir obtenu un consentement éclairé écrit. Les fibroblastes ont été cultivés dans du DMEM avec 15% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution d’acides aminés MEM non essentiels à 37 °C et 5% de CO2. Les fibroblastes ont été reprogrammés à l’aide d’un kit de reprogrammation épisomique suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un nucléofector pour l’électroporation. Toutes les procédures ont été effectuées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II de type A2 (« capot » en abrégé). Tous les milieux de culture cellulaire étaient exempts d’antibiotiques; Par conséquent, chaque composant qui est entré dans la hotte a été nettoyé avec de l’éthanol à 70%. Tous les milieux et composants de culture cellulaire ont été filtrés stériles ou ouverts dans la hotte pour maintenir leur stérilité.
1. Préparation expérimentale
<ol><li>Préparer les plaques revêtues de matrice membranaire basale (BMM). REMARQUE: BMM se solidifie plus rapidement à des températures plus chaudes. Les plaques doivent être préparées rapidement et immédiatement placées à 4 °C pour le stockage.<ol><li>Décongeler le BMM (voir le tableau des matériaux) sur la glace, à 4 °C pendant au moins 2 h, ou pendant la nuit.</li>
		<li>Mélanger DMEM/F12 et BMM jusqu’à une concentration finale de 80 μg/mL. Distribuer la solution de BMM dans des boîtes de culture tissulaire (1 mL pour 35 mm et 2 mL pour des boîtes de 60 mm) et incuber à 37 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de plaquer les cellules. NOTE: La vaisselle non utilisée peut être conservée à 4 ° C pendant 2 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer des plaques revêtues de poly-L-ornithine/laminine (OLP/laminine).<ol><li>Préparer 20 μg/mL de PLO (voir le tableau des matières) dans du DPBS+/+ stérile et ajouter 1 mL à chaque puits d’une plaque à 6 puits. Incuber pendant la nuit à 37 °C dans l’incubateur.</li>
		<li>Le lendemain, aspirez l’OLP avec un aspirateur sous vide et lavez-le deux fois avec DPBS+/+. Sécher à l’air libre dans la hotte. REMARQUE: Les plaques séchées à l’air peuvent être conservées à 4 ° C jusqu’à 2 semaines, enveloppées dans du papier d’aluminium, pour une utilisation ultérieure.</li>
		<li>Préparer 10 μg/mL de laminine (voir le tableau des matières) dans DPBS+/+ et ajouter 1 mL à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber au moins pendant 3 h ou toute la nuit à 37 °C dans l’incubateur.</li>
		<li>Aspirer la laminine avec un aspirateur à vide et ajouter 1 mL de DPBS+/+ moyen ou stérile. REMARQUE: Le revêtement de laminine ne doit pas sécher. PBS ou un milieu de culture approprié doit être ajouté immédiatement pour éviter cela. Les plaques revêtues peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer la solution de passage PSC. NOTA : Un osmomètre (voir le tableau des matériaux) est nécessaire pour préparer la solution de passage des CSP10.<ol><li>Dissoudre 11,49 g de chlorure de potassium (KCl) et 0,147 g de citrate de sodium dihydraté (HOC(COONa)(CH2 COONa)2*2H2O) dans 400 mL d’eau de culture cellulaire stérile (voir le tableau des matières).</li>
		<li>Mesurez le volume de la solution et enregistrez-le comme volume initial (Vi).</li>
		<li>Mesurez l’osmolarité et ajustez-la à 570 mOsm en ajoutant de l’eau de culture cellulaire stérile en utilisant la formule Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.</li>
		<li>Filtrer-stériliser la solution avec un filtre de 0,20 μm et faire des aliquotes de 10 mL. Conservez les aliquotes à température ambiante (RT) jusqu’à 6 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le milieu de cellules souches pluripotentes (CSP). REMARQUE : Les CSPi sont maintenues dans un milieu contenant du FGF2 thermostable (voir le tableau des matières), ce qui permet d’obtenir un horaire d’alimentation sans fin de semaine. D’autres supports PSC disponibles dans le commerce n’ont pas été essayés pour ce protocole.<ol><li>Décongeler le supplément moyen PSC pendant une nuit à 4 °C.</li>
		<li>Ajouter 10 mL de supplément de milieu PSC à 500 mL de milieu PSC basal. Préparer 25 mL d’aliquotes et conserver à −20 °C. NOTA : Les aliquotes congelées peuvent être conservées à −20 °C pendant 6 mois. Les aliquotes décongelées doivent être conservées à 4 °C et utilisées dans un délai de 2 semaines. Les cellules peuvent être congelées pour un stockage à long terme dans un milieu PSC avec 10% (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le milieu de décongélation du PSC.<ol><li>Compléter le milieu PSC avec 50 nM de chroman, 1,5 μM d’emricasan, 1x supplément de polyamine et 0,7 μM trans-ISRIB (cocktailCEPT 11) (voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Filtrer-stériliser avec un filtre de 0,20 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 4 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparez des pipettes en verre tiré.<ol><li>Tirez des pipettes Pasteur en verre de 22,9 cm (9 po) en deux morceaux au-dessus d’un brûleur Bunsen, ~2 cm sous le col, en créant deux pipettes, le côté le plus mince étant ~4 cm plus court que l’autre.</li>
		<li>À l’aide de la flamme, pliez les extrémités du côté tiré pour créer un « r » lisse.</li>
		<li>Placez les pipettes tirées dans les manchons de l’autoclave et de l’autoclave pour la stérilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le milieu de différenciation cérébelleuse (MDP).<ol><li>Mélanger IMDM et le mélange nutritif F12 de Ham dans un rapport de 1:1. Compléter le mélange avec 1x supplément de L-alanine-L-glutamine, 1 % (v/v) concentré lipidique chimiquement défini, 0,45 mM de 1-thio-glycérol, 15 μL/mL d’apotransférrine, 5 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 7 μg/mL d’insuline (voir le tableau des matières).</li>
		<li>Filtrer-stériliser avec un filtre de 0,20 μm, conserver à 4 °C et utiliser dans un délai de 1 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le milieu de maturation cérébelleuse (MMT).<ol><li>Compléter le milieu neurobasal avec 1x supplément de L-alanine-L-glutamine et 1x supplément de N-2 (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Filtrer-stériliser avec un filtre de 0,20 μm, conserver à 4 °C et utiliser dans les 2 semaines.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Culture iPSC sans alimentation
<ol><li>Décongelez les cellules en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Placer une plaque BMM (étape 1.1) dans l’incubateur à 37 °C pour geler pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de décongeler les cellules.</li>
		<li>Préchauffer 10 mL de milieu décongélateur PSC (étape 1.5) à 37 °C.</li>
		<li>Transférer le cryovial avec les cellules de l’azote liquide au bain-marie à 37 °C. REMARQUE: Pour éviter de générer une source de contamination dans l’espace de culture cellulaire, l’utilisation d’un bain-marie standard n’est pas recommandée. Au lieu de cela, l’eau douce peut être chauffée dans un petit bécher à 37 ° C pour générer un bain-marie à usage unique.</li>
		<li>Lorsqu’il reste un petit morceau de glace dans le tube, retirez-le du bain-marie, séchez le tube et vaporisez avec de l’éthanol à 70%. Transférer le tube dans la hotte et utiliser une pipette sérologique de 2 ml ou 5 ml (voir le tableau des matériaux) pour transférer doucement les cellules dans un tube conique de 15 ml.</li>
		<li>Ajouter 8 ml de milieu décongélateur PSC aux cellules goutte à goutte tout en faisant tourbillonner le tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA.</li>
		<li>Aspirer soigneusement le surnageant avec un aspirateur à vide sans déranger la pastille de cellule. Remettez les cellules en suspension dans 2 mL de milieu de décongélation des CSP.</li>
		<li>Aspirez le BMM de la plaque et ajoutez les cellules en suspension goutte à goutte sur toute la plaque pour une répartition uniforme.</li>
		<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO2. Rafraîchissez le support le lendemain avec PSC medium. Après cela, changez le support tous les jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservez les cellules en suivant les étapes ci-dessous.<ol><li>Préchauffer le volume nécessaire de milieu PSC à 37 °C (p. ex., 1 mL de milieu par plaque de 35 mm).</li>
		<li>Examinez les plaques à la recherche de cellules ou de colonies différenciées et retirez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré (étape 1.6). REMARQUE: Les colonies iPSC ont des bords lisses avec des cellules morphologiquement identiques.</li>
		<li>Changez le milieu passé quotidiennement et le passage tous les 3-4 jours ou lorsque 70% de confluence est atteint.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage des cellules.<ol><li>Placez la quantité nécessaire de plaques BMM dans l’incubateur pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant de passer. Préchauffer la quantité nécessaire de milieu PSC (étape 1.3) à 37 °C.</li>
		<li>À l’aide d’une pipette en verre tiré, nettoyez toutes les cellules ou colonies différenciées.</li>
		<li>Aspirer le milieu usé avec un aspirateur sous vide et ajouter le milieu de dissociation PSC, 1 mL par boîte de 35 mm. Incuber à 37 °C pendant 1-3 min. REMARQUE: Si les colonies se décollent dans la solution de passage PSC avant d’ajouter un milieu PSC, le temps d’incubation peut être réduit.</li>
		<li>Aspirer la solution de passage PSC et ajouter un milieu PSC préchauffé.</li>
		<li>À l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μL, rayez les lignes parallèles les unes aux autres dans une direction, tournez la plaque de 90° et faites une deuxième série de lignes de grattage perpendiculaires aux précédentes (en faisant un motif hachuré croisé sur la plaque).</li>
		<li>Aspirer la solution BMM des plaques de consignement. Recueillir les colonies à l’aide d’une pipette sérologique et les distribuer sur de nouvelles plaques BMM.</li>
		<li>Incuber à 37 °C, 5% CO2. Changez le support tous les jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Congeler les cellules.<ol><li>Préparer les cryoviales en étiquetant le contenu et stériliser sous la lumière ultraviolette (UV) dans la hotte (voir le tableau des matériaux) pendant 30 minutes.</li>
		<li>Préparer le milieu de congélation PSC en complétant le milieu PSC avec 10% (v / v) DMSO. Suivez les étapes 2.3.2-2.3.5.</li>
		<li>Transférer les cellules dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à TA.</li>
		<li>Aspirer soigneusement le milieu et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu de congélation PSC.</li>
		<li>Distribuer dans des cryovials. Placez les flacons dans un récipient de congélation et placez-le dans un congélateur à −80 °C.</li>
		<li>Le lendemain, transférer les cryovials dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Différenciation cérébelleuse
REMARQUE: Avant de commencer la différenciation, les CSPi sont passées à six boîtes de 35 mm et sont prêtes pour la différenciation lorsqu’elles sont à 70% de confluence. Chaque plaque de 35 mm sera transférée dans un puits de la plaque de 6 puits.
<ol><li>Le jour 0, soulevez les colonies saines d’iPSC pour la formation d’EB.<ol><li>Ajouter 1 mL de MDP (étape 1.7) complété par 10 μM Y-27632 et 10 μM SB431542 (voir le tableau des matériaux) à chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse (ULA) à 6 puits et placer dans l’incubateur jusqu’à ce que les colonies levées soient prêtes à être ajoutées aux puits.</li>
		<li>Nettoyez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré. Aspirer le milieu et ajouter 1 mL de solution de passage de PSC pour chaque boîte de 35 mm. Incuber pendant 3 min à 37 °C, aspirer et ajouter 2 mL de MDP additionné de 10 μM Y-27632 et 10 μM SB431542. REMARQUE: Si les colonies se décollent dans la solution de passage PSC avant d’ajouter CDM, le temps d’incubation peut être réduit.</li>
		<li>Sous un microscope inversé à lumière transmise, soulevez doucement les colonies à l’aide du bord courbé de la pipette en verre tiré à l’aide d’un grossissement 4x. Une fois chaque colonie soulevée, transférer doucement le tout dans un puits de la plaque ULA à 6 puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Répétez ce processus pour chaque plaque iPSC. Incuber les cellules à 37 °C avec 5% de CO2. REMARQUE: Si les colonies sont trop grandes ou sont fusionnées, elles peuvent être tranchées avec l’extrémité de la pipette en verre tiré pour créer des EB plus petits.</li>
	</ol></li>
	<li>Le jour 2, ajouter FGF2 à chaque puits jusqu’à une concentration finale de 50 ng/mL. REMARQUE: Le FGF2 utilisé pour la différenciation cérébelleuse n’est pas stable à la chaleur. Ce protocole n’a pas été testé avec FGF2 thermostable.</li>
	<li>Le jour 7, faites un changement moyen de 1/3. Pour 3 mL de milieu total dans un puits, avec un pipetor de 1 000 μL, aspirer doucement 1 mL de milieu usé et le remplacer par 1 mL de MDP frais. Incuber les EB pendant 7 jours.</li>
	<li>Le jour 14, aspirer doucement presque tout le milieu usé à l’aide d’un pipeteur de 1 000 μL. Pour minimiser les dommages aux EB, faites tourner la plaque pour rassembler tous les EB au centre de la plaque, puis inclinez la plaque et aspirez lentement à partir du bord.<ol><li>Au fur et à mesure que la quantité moyenne diminue, posez lentement la plaque à plat et continuez à aspirer. Laissez suffisamment de milieu pour éviter de dessécher les EB. Ensuite, ajoutez 3 mL de MDP frais complété par 10 μM Y-27632. Transférer les EB à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml dans une boîte enrobée d’OLP ou de laminine (étape 1.2). REMARQUE: Selon l’application en aval, les EB peuvent être transférés sur une plaque OLP / laminine à 6 puits ou les EB simples peuvent être transférés dans un seul puits d’une plaque OLP / laminine à 24 puits ou d’une lamelle de couverture.</li>
	</ol></li>
	<li>Le jour 15, aspirez le milieu et remplacez-le par du MDP frais. REMARQUE : Il est important d’ajouter suffisamment de milieu aux puits pour assurer suffisamment de milieu entre les tétées car, avec le temps, il y aura évaporation (p. ex., pour un puits dans une plaque de 6 puits, ajouter 3 mL de milieu). Si le milieu a commencé à s’acidifier (devenir clair et jaune), rafraîchissez-le même s’il ne figure pas sur le calendrier d’alimentation avant la fin du protocole.</li>
	<li>Le jour 21, aspirez le milieu usé et remplacez-le par CMM. Le jour 28, changer le milieu avec une nouvelle MMT. Le jour 35, récoltez les cellules pour d’autres applications.</li>
</ol>4. Préparation de l’échantillon pour l’isolement de l’ARN
<ol><li>Aspirer le milieu et ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire (voir Tableau des matériaux) à chaque puits de la plaque à 6 puits. Laissez-le pendant quelques secondes et aspirez.</li>
	<li>Incuber la plaque, avec le couvercle, à température ambiante pendant 2 min. Tapotez les côtés de la plaque pour détacher les cellules.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de MMT (étape 1.8) et recueillir les cellules dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Enduire les cellules par centrifugation à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse (voir le tableau des matériaux) pendant 30 s à TA (vitesse maximale 2000 x g), jeter le milieu et ajouter 1 mL de 1x PBS pH 7,4 pour laver la pastille de cellule.</li>
	<li>Enduisez à nouveau les cellules à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse pendant 30 s à TA et lavez à nouveau avec du PBS.</li>
	<li>les cellules et jetez le PBS. Lyser les cellules dans le réactif contenant du phénol et de l’isothiocyanate de guanidine (voir le tableau des matières). REMARQUE : Les cellules lysées dans du phénol et du réactif contenant de l’isothiocyanate de guanidine peuvent être conservées à -80 °C jusqu’à 1 an. Les cellules peuvent être lysées directement dans la boîte en fonction de la méthode d’isolement de l’ARN et des réactifs utilisés. En raison du faible nombre de cellules dans une boîte, l’isolement de l’ARN à l’aide de colonnes de spin de silice (voir le tableau des matériaux) entraînera des rendements plus élevés d’ARN.</li>
</ol>5. Préparation des cellules pour la coloration immunofluorescente
NOTE: Pour une plaque de 24 puits, un EB par puits est suffisant.
<ol><li>Le jour 35, aspirer le milieu usé et laver les cellules en ajoutant 1 mL de DPBS+/+ par puits (pour un puits d’une plaque de 24 puits).</li>
	<li>Aspirer le DPBS+/+ et ajouter 500 μL de paraformaldéhyde froid à 4% (PFA, voir le tableau des matières) préparé dans DPBS+/+ par puits. Incuber pendant 20 min à TA.</li>
	<li>Retirer 4% PFA et laver les cellules deux fois avec DPBS+/+, comme à l’étape 5.1. Ajouter 1 mL de DPBS+/+ et conserver les cellules à 4 °C jusqu’à coloration. REMARQUE: Il est conseillé de faire la coloration immunofluorescente dans les 1 semaine après la fixation pour éviter le décollement cellulaire et la perte d’antigènes. Cependant, en fonction de l’anticorps et de l’emplacement cellulaire de la cible, la coloration peut être effectuée ultérieurement jusqu’à 4 semaines après la fixation.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

La capacité de modéliser le développement cérébelleux humain in vitro est importante pour la modélisation de la maladie ainsi que pour approfondir la compréhension du développement normal du cerveau. Des protocoles moins compliqués et moins rentables créent plus d’opportunités pour la génération de données reproductibles et une large mise en œuvre dans plusieurs laboratoires scientifiques. Un protocole de différenciation cérébelleuse est décrit ici en utilisant une méthode modifiée de génération d’EB qui ne néce...

Comprendre le développement cérébelleux humain et les fenêtres temporelles critiques de ce processus est important non seulement pour décoder les causes possibles des troubles neurodéveloppementaux, mais aussi pour identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique. La modélisation du développement cérébelleux humain in vitro a été difficile, mais au fil du temps, de nombreux protocoles différenciant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou les CSPi avec le destin de la lignée cérébelleuse ont émergé 1,2,3,4,5,6,7,8 . De plus, il est important de développer des protocoles qui génèrent des résultats reproductibles, qui sont relativement simples (pour réduire les erreurs) et qui ne sont pas lourds en coûts monétaires.
Les premiers protocoles de différenciation cérébelleuse ont été générés à partir de cultures 2D de corps embryoïdes plaqués (EB), induisant le devenir cérébelleux avec divers facteurs de croissance similaires au développement in vivo, y compris WNT, BMP et FGF 1,9. Des protocoles publiés plus récents ont induit une différenciation principalement dans la culture organoïde 3D avec FGF2 et insuline, suivie de FGF19 et SDF1 pour les structures rhombiques ressemblant à des lèvres3,4, ou ont utilisé une combinaison de FGF2, FGF4 et FGF85. Les deux méthodes d’induction organoïde cérébelleuse ont abouti à des organoïdes cérébelleux 3D similaires, car les deux protocoles ont rapporté une expression similaire du marqueur cérébelleux à des moments identiques. Holmes et Heine ont étendu leur protocole 3D5 pour montrer que les cellules cérébelleuses 2D peuvent être générées à partir d’hESCs et d’iPSCs, qui commencent sous forme d’agrégats 3D. En outre, Silva et al.7 ont démontré que les cellules représentant des neurones cérébelleux matures en 2D peuvent être générées avec une approche similaire à celle de Holmes et Heine, en utilisant un point temporel différent pour passer de la 3D à la 2D et prolonger le temps de croissance et de maturation.
Le protocole actuel induit le devenir cérébelleux dans les CSPi sans alimentation en générant des corps embryoïdes flottants à l’aide d’insuline et de FGF2, puis en plaquant les EB sur des plats enrobés de PLOL / laminine au jour 14 pour une croissance et une différenciation 2D. Au jour 35, les cellules ayant une identité cérébelleuse sont obtenues. La capacité de récapituler les premières étapes du développement cérébelleux, en particulier dans un environnement 2D, permet aux chercheurs de répondre à des questions spécifiques nécessitant des expériences avec une structure monocouche. Ce protocole se prête également à d’autres modifications telles que des surfaces micropatternées, des tests de croissance axonale et le tri cellulaire pour enrichir les populations cellulaires souhaitées.

<table><tbody><tr><td>10 mL Pipette sérologique</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-thio-glycérol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Pipette sérologique</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Unité de filtration, 0,2 & micro ; m aPES, 50 mm Dia</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plat de culture tissulaire Easy Grip</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector unité centrale</td><td>Lonza</td><td>276885</td><td>Nucleofector</td></tr><tr><td>5 mL Pipette sérologique</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture tissulaire Easy Grip 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>6 puits plaques de fixation ultra-basses</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>9" Pipettes Pasteur jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité culture cellulaire</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>Concentré lipidique chimiquement défini</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>Classe II, Type A2, Armoire de sécurité biologique</td><td>NuAire, Inc.</td><td>Capot NU-540-600</td><td></td></tr>, <tr><td>plaque Costar 24 puits à</td> lumière UV, <td>Corning</td><td>3526</td><td></td>traité TC</tr>, <tr><td>plaque Costar 6 puits,</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td>solution</tr><tr><td>DAPI</td> traitée TC <td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethly sulfoxyde)</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5 episomal iPSC kit de reprogrammation Life</td><td>Technologies</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>PSC medium avec système d’imagerie FGF2</td></tr><tr><td>EVOS XL Core stable à</td> la chaleur <td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Supplément L-alanine-L-glutamine</td></tr><tr><td>Ham’s F12 Nutrient Mix</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i Incubateur CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Humain Anti-EN2, souris</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-293311</td><td></td></tr><tr><td>Humain anti-Ki67/MKI67, lapin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PTF1a humain, lapin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUBB3 humain, souris</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Gibco</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>Laminine Protéine de souris</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrice de membrane basale</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifugeuse</td><td>Labnet International</td><td>C1310</td><td>Mini centrifugeuse de paillasse</td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &micro ; g)</td><td>New England BioLabs</td><td>T2040</td><td>Colonnes de spin en silice</td></tr><tr><td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>T2010</td><td>Colonnes de spin en silice</td></tr><tr><td>N-2 supplément</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de polyamine</td><td>Sigma</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>Sachets transparents auto-refermables</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td><td>Sachets autoclave</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydraté&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour seringues, stériles, PES 0.22 & micro ; m, 30 mm Dia</td><td>Research Products International</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Phénol et guanidine isothiocyanate</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Gibco</td><td>12604039</td><td>Réactif de dissociation cellulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Osmomètre à pression de vapeur</td><td>Wescor, Inc.</td><td>Modèle 5520</td><td>Osmomètre</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2d

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

Le développement précis et opportun du cervelet est crucial non seulement pour une coordination motrice et un équilibre précis, mais aussi pour la cognition. En outre, la perturbation du développement cérébelleux a été impliquée dans de nombreux troubles neurodéveloppementaux, notamment l’autisme, le trouble déficitaire de l’attention avec hyperactivité (TDAH) et la schizophrénie. Les études sur le développement cérébelleux chez l’homme n’étaient auparavant possibles que par des études post-mortem ou la neuroimagerie, mais ces méthodes ne sont pas suffisantes pour comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent in vivo au cours du développement précoce, qui est à l’origine de nombreux troubles neurodéveloppementaux. L’émergence de techniques pour générer des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) à partir de cellules somatiques et la capacité de redifférencier davantage les CSPi en neurones ont ouvert la voie à la modélisation in vitro du développement précoce du cerveau. La présente étude fournit des étapes simplifiées vers la génération de cellules cérébelleuses pour des applications nécessitant une structure monocouche en 2 dimensions (2D). Les cellules cérébelleuses représentant les premiers stades de développement sont dérivées de CSPi humaines via les étapes suivantes: premièrement, les corps embryoïdes sont fabriqués en culture 3 dimensions (3D), puis ils sont traités avec FGF2 et insuline pour promouvoir la spécification du devenir cérébelleux, et enfin, ils sont différenciés en phase terminale en tant que monocouche sur des substrats recouverts de poly-l-ornithine (PLO) / laminine. À 35 jours de différenciation, les cultures de cellules cérébelleuses dérivées de l’iPSC expriment des marqueurs cérébelleux, notamment ATOH1, PTF1α, PAX6 et KIRREL2, ce qui suggère que ce protocole génère des précurseurs neuronaux cérébelleux glutamatergiques et GABAergiques, ainsi que des progéniteurs cellulaires de Purkinje. De plus, les cellules différenciées présentent une morphologie neuronale distincte et sont positives pour les marqueurs d’immunofluorescence de l’identité neuronale tels que TUBB3. Ces cellules expriment des molécules de guidage axonal, y compris la sémaphorine-4C, la plexine-B2 et la neuropiline-1, et pourraient servir de modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la croissance des neurites et de la connectivité synaptique. Cette méthode génère des neurones cérébelleux humains utiles pour des applications en aval, y compris l’expression génique, les études physiologiques et morphologiques nécessitant des formats monocouches 2D.

Vue d’ensemble de la différenciation cérébelleuse 3D à 2D Les cellules cérébelleuses sont générées à partir des CSPi. La figure 1A montre le flux de travail global et l’ajout de composants majeurs pour la différenciation. Le jour 0, les EB sont fabriqués en soulevant doucement les colonies d’iPSC (Figure 1B) à l’aide d’une pipette en verre tiré dans CDM contenant SB431542 et Y-27632 et placés dans des plaques de fixation ultra-basses. FGF2 es...

Le présent protocole explique la génération d’une monocouche 2D de cellules cérébelleuses à partir de cellules souches pluripotentes induites pour étudier les premiers stades du développement cérébelleux.

Modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

Cette méthode peut aider à étudier le développement cérébelleux précoce de l’homme et comment il pourrait être modifié dans les troubles neuropsychiatriques. Le principal avantage de cette méthode est de générer des cellules cérébelleuses humaines précoces dans une structure de couche 2D sans effectuer d’étapes compliquées. C’est également rentable.La fabrication de pipettes à traction peut être délicate au début, mais avec de la pratique et du temps, il devient plus facile de tirer les pipettes d’une manière qui sera plus facile à travailler. Commencez la préparation expérimentale en tirant une pipette Pasteur de 22,9 centimètres à environ deux centimètres sous le cou, au-dessus du brûleur Bunsen pour créer deux pipettes en verre. Le côté le plus mince sera environ quatre centimètres plus court que l’autre.Pliez les pointes du côté tiré sur la flamme pour créer un R lisse, puis placez les pipettes tirées dans des manchons d’autoclave et stérilisez-les dans un autoclave. Au jour zéro, ajoutez un millilitre de milieu de différenciation cérébelleuse complété par 10 micromolaires Y-27632 et SB-431542 à chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse à six puits, ou ULA, et placez-le dans l’incubateur jusqu’à ce que les colonies levées soient prêtes à être ajoutées aux puits. Nettoyez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré.Aspirer le milieu et ajouter un millimètre de solution de passage iPSC pour chaque boîte de 35 millimètres. Après trois minutes d’incubation à 37 degrés Celsius, aspirer le milieu et ajouter deux millimètres de milieu de différenciation cérébelleuse complété par 10 micromolaires Y-27632 et SB-431542 Sous un grossissement 4x d’un microscope inversé à lumière transmise, soulever les colonies à l’aide du bord courbé de la pipette en verre tiré. Une fois chaque colonie soulevée, transférez doucement toutes les colonies dans un puits de la plaque ULA à six puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres.Répétez ce processus pour chaque plaque iPSC et incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le deuxième jour, ajoutez FGF2 à chaque puits pour ajuster une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre. Le septième jour, changez un tiers du milieu en aspirant un millilitre de milieu usé et en le remplaçant par un millilitre de milieu de différenciation cérébelleuse frais.Incuber les corps embryoïdes pendant sept jours. Le jour 14, faites tourbillonner l’assiette pour rassembler tous les corps embryoïdes au centre de l’assiette. Ensuite, inclinez la plaque et aspirez tout le milieu usé à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres à partir du bord.Au fur et à mesure que la quantité moyenne diminue, posez lentement la plaque à plat et continuez à aspirer, en laissant suffisamment de milieu pour éviter d’aspirer les corps embryoïdes. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu de différenciation cérébelleuse frais complété par 10 micromolaires Y-27632. Ensuite, transférez les corps embryoïdes à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres dans un plat enrobé de poly-L-ornithine laminine.Le jour 15, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu de différenciation cérébelleuse frais. Le jour zéro, les colonies d’iPSC ont été nettoyées et soulevées dans un milieu de différenciation cérébelleuse contenant SB-431542 et Y-27632 et ont été placées dans des plaques de fixation ultra-basses pour générer des corps embryoïdes. L’ajout de FGF2 le deuxième jour et un changement de milieu de 1/3 le septième jour ont entraîné un élargissement des corps embryoïdes le 14ème jour.Les cellules ont commencé à migrer vers l’extérieur des corps embryoïdes le long de la surface recouverte le 15ème jour. Le changement complet du milieu à milieu de maturation cérébelleuse à partir du 21ème jour a abouti à une monocouche de cellules avec une morphologie et une complexité de type neuronal au 35ème jour. L’analyse de l’expression génique au jour 35 a révélé que les cellules expriment des marqueurs progéniteurs cérébelleux précoces tels que les progéniteurs glutamatergiques, ATOH1, GABAergic progenitors, PTF1 alpha et les marqueurs cellulaires progéniteurs de Purkinje KIRREL2 et SKOR2.De plus, l’expression du marqueur labial rhombique OTX2 et principalement du SIX3 spécifique du neurone antérieur ont également été observées. Le marquage immunofluorescent des cellules récoltées le 35e jour a montré une coloration positive pour les marqueurs du cervelet EN2 et PTF1 alpha, le marqueur neuronal bêta tubuline III et le marqueur de prolifération KI67. La coloration nucléaire avec du 4'6-diamidino-2-phénylindole, ou DAPI, a montré des noyaux cellulaires.Pour une différenciation réussie, il est crucial de commencer par des colonies d’iPSC saines et indifférenciées et d’utiliser des réactifs aussi fraîchement reconstitués que possible.

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Cette vidéo démontre un protocole de différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en progéniteurs cérébelleux. Il s’agit de transférer des colonies de cellules souches sur une plaque de fixation ultra-faible pour former des corps embryoïdes, favorisant la différenciation avec des facteurs de croissance, puis de transférer les corps embryoïdes sur une plaque recouverte de matrice pour l’adhésion. Les étapes suivantes consistent à induire la migration cellulaire et à...

Technique de génération d’une monocouche 2D de cellules cérébelleuses à partir de cellules souches pluripotentes induites

Cette vidéo démontre la génération d’un modèle de lésion neuronale dans les neurones primaires du granule cérébelleux de souris. Il décrit les étapes impliquées dans l’induction de lésions neuronales à l’aide de NMDA, un agoniste des récepteurs de neurotransmetteurs excitateurs, et de glycine, un co-agoniste. Le NMDA et la glycine se lient à des récepteurs neuronaux spécifiques, provoquant leur surstimulation et entraînant un afflux massif de calcium intracellulaire, ce qui entraîne des...

Modélisation des lésions neuronales dans les neurones granulaires cérébelleux primaires de souris

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Nous décrivons un support de protocole de hPSCs, à l’aide de défini différenciation 3D simplifié et réduit les facteurs de croissance, capables de produire des agrégats cellulaires avec les premières structures neuroépithéliales et positifs pour les marqueurs associés à cervelet, ainsi qu’une option Modification 2D afin de différencier les cellules comme une monocouche pour générer des neurones fonctionnels.

Protocole de différenciation cérébelleux 3D simplifiée avec Modification 2D facultative

Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Ce protocole décrit un système de culture dynamique pour produire des agrégats de taille contrôlée des cellules souches pluripotentes humaines et stimuler davantage la différenciation des organoïdes cérébellaires dans des conditions chimiquement définies et sans alimentation à l’aide d’un bioréacteur à usage unique.

Génération évolutive d’Organoïdes cérébellaires matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunostaining

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.

Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical

Cette vidéo montre une méthode de disséquer et de la culture des neurones commissuraux de la moelle épinière de rats E13 dorsale. Dissocié neurones commissuraux sont utiles pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance de l'axone et d'orientation.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Découvrez la modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D à partir de cellules iPSC. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes impliqués dans les troubles neuropsychiatriques.

Modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D

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