Name: Culture cellulaire IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Découvrez le protocole de culture 3D des cellules IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire pour étudier l'ostéogenèse et la formation dendritique. Cette méthode améliore l'imagerie et l'analyse de l'expression génique.

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Nous remercions la Dre Lynda F. Bonewald d’avoir fait don de la lignée cellulaire IDG-SW3. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82070902, 82100935 et 81700778) et le projet de voile « Science and Technology Innovation » de Shanghai (21YF1442000).

Ce protocole est adapté à la culture de cellules dans quatre puits de plaques de 24 puits. Si vous préparez plusieurs échantillons ou plaques, les quantités de réactifs doivent être augmentées en conséquence.
1. Préparation du mélange de collagène I
REMARQUE : Le collagène I et la matrice de la membrane basale se gèrent rapidement à température ambiante. Par conséquent, le collagène doit être manipulé sur de la glace (2 °C à 8 °C). Tous les embouts et tubes utilisés doivent être prérefroidis, sauf indication contraire. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une cagoule de sécurité.
<ol><li>Placez tous les réactifs et les tubes à centrifuger sur de la glace.</li>
	<li>Pipeter lentement 0,48 mL de collagène I (5 mg/mL) et 0,1 mL de milieu essentiel (MEM) 10x minimum (avec du rouge phénolique) dans un tube à centrifuger stérile de 15 mL maintenu sur de la glace. Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas.</li>
	<li>Selon la palette de couleurs de l’indicateur rouge phénol, utilisez un volume approprié de 7,5 % (p/v) NaHCO3 (environ 0,2 mL) pour régler l’indicateur rouge phénol à l’orange, ce qui indique que la valeur du pH est comprise entre 7,0 et 7,4. REMARQUE : Selon le pH du milieu, un volume de NaHCO3 est utilisé pour amener le pH à environ 7,0-7,4. De plus, le NaOH est utilisé pour la neutralisation du pH.</li>
	<li>Porter le volume final du mélange à 1 mL en ajoutant un volume approprié de ddH2O. Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas pour préparer l’utilisation. REMARQUE : Le volume final de ddH2O dépendra de la quantité de NaHCO 3 ou de NaOH utilisée à l’étape1.3 .</li>
</ol>2. Préparation du mélange cellule-matrice
<ol><li>Pipeter lentement 0,9 mL de matrice de membrane basale dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL sur la glace.</li>
	<li>Cultivez les cellules IDG-SW3 dans un flacon T25 avec 4 mL de milieu complet (alpha-MEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal [FBS]) complété par 50 U/mL d’INF-γ à 33 °C.</li>
	<li>Une fois que les cellules IDG-SW3 ont atteint 90 % de confluence, retirez le milieu et lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4 tout au long du protocole) avec une pipette. Digérer les cellules avec 0,5 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % à 37 °C pendant 30 s.</li>
	<li>Inactiver la trypsine en ajoutant 3,5 mL de milieu complet (alpha-MEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal [FBS]). Transférez la suspension cellulaire de 4 mL dans un tube à centrifuger de 15 mL.</li>
	<li>Essorer la suspension cellulaire à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu complet sur glace.</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité cellulaire finale avec le milieu complet à 4 × 105 cellules/mL. Ajouter 0,1 mL de la suspension cellulaire préparée à 0,9 mL de matrice extracellulaire à partir de l’étape 2.1. Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas. REMARQUE : Si un témoin acellulaire est nécessaire, ajouter 0,1 mL du milieu complet à 0,9 mL de matrice extracellulaire comme témoin négatif.</li>
</ol>3. Placage du mélange cellule-gel
<ol><li>Délicatement, bien mélanger les deux mélanges de l’étape 2.6 et de l’étape 1.4 à 2 mL en pipetant de haut en bas sur la glace. Pipeter 0,5 mL du mélange final dans chaque puits (quatre puits d’une plaque de 24 puits). Incuber à 37 °C pendant 1 h pour former un mélange cellule-gel.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de milieu ostéogénique (milieu complet contenant 50 μg/mL d’acide ascorbique et 4 mM de β-glycérophosphate, également connu sous le nom de milieu d’induction ostéogénique)4 au mélange cellule-gel dans chaque puits pour commencer la différenciation ostéogénique à 37 °C. Considérez ceci comme le jour 0.</li>
	<li>Tous les 2 jours, remplacer la moitié du milieu par du milieu ostéogénique frais maintenu à 37 °C. Continuez la culture pendant 35 jours.</li>
</ol>4. Identification de la viabilité cellulaire et des dendrites cellulaires à l’aide d’un microscope confocal
<ol><li>Coloration cellulaire REMARQUE : L’ester acétoxyméthylique de calcéine (calcéine AM) est un colorant perméable aux cellules qui peut être utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire. L’homodimère d’éthidium-I (EthD-1) ne traverse pas la membrane des cellules intactes/viables9. Ainsi, la calcéine AM/EthD-1 peut être utilisée pour identifier la viabilité cellulaire et les dendrites cellulaires.<ol><li>Le jour 1 et le jour 7 de la culture, retirez la solution mère de calcéine AM (4 mM dans le DMSO) et la solution mère d’EthD-1 (2 mM dans le DMSO/H2O 1 :4 [v/v]) du congélateur et laissez-les se réchauffer à température ambiante. REMARQUE : La matrice minéralisée a un fort signal d’autofluorescence, de sorte que le stade préostéocytaire sans expression de Dmp1 dans les 7 jours suivant la culture4 est plus approprié pour l’observation de la coloration cellulaire.</li>
		<li>Ajouter 4 μL de la solution mère d’EthD-1 à 2 mM et 5 μL de la solution mère de calcéine AM à 4 mM à 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco et bien mélanger. Cela donne environ 2 μM de calcéine AM et 4 μM d’EthD-1 comme solutions de travail.</li>
		<li>Pipeter 0,5 mL de la solution de travail dans les puits de la plaque à 24 puits. Incuber pendant 30 à 45 minutes à température ambiante pour colorer la matrice cellule-gel.</li>
		<li>Après l’incubation, ajouter environ 0,5 mL de D-PBS frais dans une nouvelle boîte de culture à fond en verre de 35 mm. Couvrez la boîte pour éviter la contamination ou le dessèchement des échantillons.</li>
		<li>À l’aide d’une pince à pointe coudée, transférez délicatement la matrice de gel cellulaire colorée de l’étape 4.1.3 dans la boîte de culture de 35 mm de l’étape 4.1.4. Évitez d’endommager ou de cisailler la matrice cellulaire-gel.</li>
		<li>Visualisez les cellules marquées sous un microscope à fluorescence confocale laser.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de balayage de microscope<ol><li>Placez le plat de 35 mm sur la scène. Sélectionnez les régions de la matrice cellule-gel à scanner à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 10x. Les objectifs à fort grossissement ne sont pas recommandés en raison de la taille des dendrites étendues.</li>
		<li>Sélectionnez les filtres optiques. La calcéine peut être considérée comme verte avec un filtre passe-bande de fluorescéine standard, et l’EthD-1 peut être considérée comme rouge avec des filtres pour l’iodure de propidium ou le colorant rouge du Texas. Sélectionnez le « mode ligne » pour le balayage et réglez le « trou d’épingle » sur 2 μm.</li>
		<li>Sélectionnez une profondeur de données de 8 bits et une résolution d’image de 1 024 pixels x 1 024 pixels.</li>
		<li>Image à l’aide d’un balayage linéaire séquentiel avec les paramètres optimaux du laser et du détecteur (garder une énergie laser minimale pour éviter un photoblanchiment potentiel). REMARQUE : Le réglage optimal du détecteur dépend des signaux de fluorescence finaux.</li>
	</ol></li>
	<li>Collecte d’une « pile z » d’images<ol><li>Selon le signal du canal vert, définissez les positions supérieure et inférieure de la matrice cellule-gel à scanner en faisant la mise au point sur l’échantillon tout en balayant en continu, .</li>
		<li>Une fois que le haut et le bas de l’échantillon ont été spécifiés, sélectionnez le cadre de numérisation souhaité. Lancez la numérisation. L’échantillon sera numérisé de haut en bas avec les paramètres sélectionnés à l’étape 4.2, générant une galerie d’images.</li>
	</ol></li>
	<li>Identification de la viabilité cellulaire.<ol><li>Sélectionnez une tranche à partir de l’étape 4.3. Les canaux vert et rouge indiquent respectivement les cellules vivantes et mortes.</li>
	</ol></li>
	<li>Identification des dendrites cellulaires.<ol><li>Sélectionnez le seul canal vert pour générer des reconstructions 3D avec le logiciel d’acquisition d’images. Les informations de profondeur sont affichées sous la forme d’une série d’images pseudo-colorées arc-en-ciel. Les dendrites situées en bas du gel sont affichées en rouge, tandis que celles en haut sont affichées en bleu.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Identification de l’apparence à l’aide d’un stéréomicroscope
<ol><li>Le jour 1, le jour 7, le jour 21 et le jour 35 de la culture, retirez le milieu de culture et lavez les gels dans la plaque deux fois avec du D-PBS. Ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % (v/v) dans le D-PBS dans le puits pour fixer la matrice cellule-gel dans la plaque pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le paraformaldéhyde dans le puits et lavez la matrice de gel cellulaire deux fois de plus avec du D-PBS dans la plaque. Laissez 0,5 mL de D-PBS dans chaque puits pour l’imagerie.</li>
	<li>Placez la plaque sur la platine et sélectionnez la position optimale à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 0,5x. Visualisez individuellement la vue plein champ de la matrice cellule-gel dans la plaque en utilisant « l’exposition automatique » sous le champ clair.</li>
</ol>6. Identification des dépôts minéraux à l’aide d’un test XRF
<ol><li>Au jour 35 de la culture, vérifiez si l’azote liquide est suffisant. Démarrez le système XRF. Ouvrez la salle d’échantillonnage et transférez les gels à l’aide d’une pince à pointe coudée de la plaque au milieu de la platine d’échantillonnage de l’instrument. Fermez la salle d’échantillonnage et attendez 30 minutes pour permettre à l’instrument de refroidir avant de l’utiliser.</li>
	<li>Réglez le « Temps d’exposition » sur 35 ms, la « Plage de spectre » sur 0-40 keV et le « Courant électrique » sur 770 μA pour la configuration de l’acquisition.</li>
	<li>Choisissez trois à cinq sites d’analyse pour l’analyse en déplaçant la platine d’échantillonnage.</li>
	<li>Sélectionnez les éléments (Ca et P) à détecter. Lancez la détection et exportez les résultats. NOTE : Ca et P sont les éléments les plus abondants dans l’hydroxyapatite.</li>
</ol>7. Identification de l’expression des gènes fonctionnels
<ol><li>Le jour 1, le jour 7, le jour 21, le jour 28 et le jour 35 de la culture, retirez le milieu de culture et lavez la matrice cellulaire-gel deux fois avec du D-PBS glacé dans la plaque.</li>
	<li>Transférez les gels à l’aide d’une pince à pointe coudée de la plaque dans un tube de 2,0 ml (selon le temps de culture, la matrice cellule-gel rétrécira progressivement jusqu’à environ 0,1 ml au jour 35). Assurez-vous qu’un gel est placé dans un tube. Ajouter 1 mL de phénol-chloroforme et deux billes stériles en acier inoxydable (4 mm, comme matrice de lyse) dans chaque tube. Placez les tubes symétriquement dans la fente d’échantillon pré-refroidie de l’homogénéisateur à battement mécanique.</li>
	<li>Réglez le battement sur une fréquence de 55 Hz et une amplitude de 1 cm par 1 min de battement mécanique avec une pause de 10 s, avec six cycles au total. Commencez à battre les perles.</li>
	<li>Extraire l’ARN total de la matrice cellule-gel à l’aide de la méthode phénol-chloroforme-isoamylachohol. Transcrire inversement 2 μg d’ARN total en ADNc à l’aide d’amorces hexamères aléatoires.</li>
	<li>Concevoir des amorces ciblant la β-actine, le Pdpn, le Dmp1, le Sost et le Fgf23 pour la PCR en temps réel (tableau 2). β-actine est le gène d’entretien utilisé pour la normalisation. Les gènes Pdpn10 et Dmp1 11 sont principalement exprimés dans les pré-ostéocytes et les ostéocytes minéralisés, tandis que Sost12 et Fgf23 13 sont principalement exprimés dans les ostéocytes matures.</li>
	<li>Placez le tube sur un thermocycleur avec le couvercle chauffant réglé à 105 °C et effectuez l’amplification PCR en utilisant les paramètres de cycle PCR suivants : 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s pendant 35 cycles avec une première étape de dénaturation à 95 °C pendant 5 min et une dernière étape d’extension à 60 °C pendant 30 s. Analysez les changements de pli avec la méthode ΔΔCt.</li>
</ol>

<ol><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte%3A+An+endocrine+cell+...+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).</li>
<li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoid-mimicking+dense+collagen%2Fchitosan+hybrid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li>
<li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11%2FPodoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin%2C+a+novel+BMP+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li>
<li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un point critique de ce protocole est que les étapes 1 et 2 doivent être effectuées sur de la glace pour éviter la coagulation spontanée. Dans cette méthode, la concentration finale de collagène I était de 1,2 mg/mL. Ainsi, un volume optimal de ddH2O doit être calculé pour correspondre aux différents collagènes de différents fabricants.
In vivo, l’ostéocytogenèse implique un mouvement polaire des ostéoblastes de la surface vers l’intérieur de l’os trabéculaire<sup class="xr...

Les ostéocytes sont des cellules différenciées en phase terminale dérivées d’ostéoblastes 1,2. Une fois que l’ostéoblaste est enterré par l’ostéoïde, il subit une ostéocytogenèse et exprime le gène Pdpn pour former des préostéocytes, le gène Dmp1 pour minéraliser l’ostéoïde, et les gènes Sost et Fgf23 pour fonctionner comme un ostéocyte mature dans le tissu osseux3. Ici, un système de culture 3D est introduit pour identifier l’extension de la dendrite et l’expression des gènes marqueurs dans le processus d’ostéocytogenèse.
Les cellules IDG-SW3 sont une lignée cellulaire primaire immortalisée dérivée de souris transgéniques et peuvent étendre ou répliquer l’ostéoblaste à la différenciation tardive des ostéocytes lorsqu’elles sont cultivées dans différents milieux4. Par rapport à MLO-A5, MLO-Y4 et à d’autres lignées cellulaires, le profil d’expression des protéines fonctionnelles, la capacité à effectuer un dépôt de sels de calcium et les réponses à diverses hormones dans les cellules IDG-SW3 sont plus susceptibles d’être les mêmes que celles des ostéocytes primaires dans le tissu osseux4.
Par rapport aux systèmes 2D, les systèmes de culture 3D sont plus capables d’imiter l’environnement de croissance cellulaire in vivo, y compris le gradient de nutriments, la faible rigidité mécanique et la plage mécanique environnante (tableau 1). La plupart des méthodes précédentes de culture de cellules ostéoblastiques dans un système 3D utilisaient le collagène I comme composant unique dans les formulations 4,5,6, car les fibres de collagène I servent de site de dépôt de calcium et de phosphore. Cependant, un constituant indispensable de l’ostéoïde, la matrice extracellulaire, contient un grand groupe de facteurs cellulaires qui favorisent la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires 7,8 et est transparent et pratique pour l’observation par imagerie. Ainsi, ce protocole utilise le Matrigel (ci-après dénommé matrice membranaire basale) comme composant secondaire pour l’étude de l’ostéocytogenèse.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine-éthylènediaminetétraacétique</td><td>Hyclone</td><td>SH30042,01</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 mL</td><td>Corning, NY, États-Unis</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>7,5 % (p/v) Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, MO, États-Unis</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich, MO, États-Unis</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Collagène I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>homogénéisateur</td><td>BiHeng&nbsp ; Biotechnologie, Shanghai, Chine</td><td>Microscopie</td> confocale à fluorescence laser SKSI <td></td></tr><tr><td></td><td> Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td>LSM 800</td><td></td></tr> Kit <tr><td>d’imagerie de cellules vivantes/mortes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>Corning, NY, États-Unis</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10X), sans glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21430079</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich, MO, États-Unis</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Hyclone</td><td>SH30256. </td><td></td>Stéréomicroscope FS</tr><tr><td></td><td>Carl&nbsp ; Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td>Zeiss Axio ZOOM. V16</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence X</td><td>EDAX, USA</td><td>EAGLE III</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-glycérophosphate</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

culture cellulaire idg-sw3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Les ostéocytes sont considérés comme des cellules non prolifératives qui se différencient de manière terminale des ostéoblastes. Les ostéoblastes intégrés dans la matrice extracellulaire osseuse (ostéoïde) expriment le gène Pdpn pour former des dendrites cellulaires et se transformer en préostéocytes. Plus tard, les préostéocytes expriment le gène Dmp1 pour favoriser la minéralisation de la matrice et ainsi se transformer en ostéocytes matures. Ce processus s’appelle l’ostéocytogenèse. IDG-SW3 est une lignée cellulaire bien connue pour les études in vitro de l’ostéocytogenèse. De nombreuses méthodes précédentes ont utilisé le collagène I comme composant principal ou unique de la matrice de culture. Cependant, en plus du collagène I, l’ostéoïde contient également une substance fondamentale, qui est un élément important pour favoriser la croissance, l’adhésion et la migration cellulaires. De plus, la substance matricielle est transparente, ce qui augmente la transparence du gel de collagène formé en I et, ainsi, facilite l’exploration de la formation de dendrites grâce à des techniques d’imagerie. Ainsi, cet article détaille un protocole pour établir un gel 3D utilisant une matrice extracellulaire avec du collagène I pour la survie d’IDG-SW3. Dans ce travail, la formation des dendrites et l’expression des gènes ont été analysées au cours de l’ostéocytogenèse. Après 7 jours de culture ostéogénique, un vaste réseau de dendrites a été clairement observé au microscope confocal à fluorescence. La PCR en temps réel a montré que les niveaux d’ARNm de Pdpn et Dmp1 ont continuellement augmenté pendant 3 semaines. À la semaine 4, le stéréomicroscope a révélé un gel opaque rempli de particules minérales, ce qui correspond au test de fluorescence X (XRF). Ces résultats indiquent que cette matrice de culture facilite avec succès la transition des ostéoblastes vers les ostéocytes matures.

Après coloration des cellules vivantes/mortes, les cellules ont été visualisées à l’aide d’un microscope laser confocal. Toutes les cellules étaient positives pour la calcéine AM (couleur verte), et il n’y avait presque pas de cellules EthD-1 positives (couleur rouge) dans le champ, ce qui indique que le système de gel fabriqué par cette méthode est très approprié pour l’ostéocytogenèse (Figure 1A, à gauche). Pour mieux déterminer la distribution spatiale des cellules, une image en pseudo-co...

Nous présentons ici un protocole de culture de cellules IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (3D).

Culture cellulaire IDG-SW3 dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

Nous avons détaillé un protocole pour établir un système 3D utilisant une métrique extracellulaire ainsi qu’une métrique de collagène pour analyser la formation et l’expression des gènes par ostéogenèse. Les mesures extracellulaires peuvent augmenter la transparence du gel de collagène sous forme unique et conviennent à l’exploration de la formation de dendrites pour les techniques d’imagerie. Pour commencer, pipetez lentement 0,9 millilitre de matrice de membrane basale dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres sur de la glace et gardez-le de côté.Ensuite, retirez un fil dentaire T25 de cellules cultivées IDG SW3 dans quatre millilitres de milieu complet complété par de l’interféron gamma de l’incubateur. Après avoir retiré le milieu de culture, laver les cellules avec du PBS pH 7,4 à l’aide d’une pipette. Ensuite, trypsaniser les cellules avec 0,5 millilitre d’EDTA de trypsine à 0,25% à 37 degrés Celsius pendant 30 secondes.Inactiver la trypsine en ajoutant 3,5 millilitres de milieu complet. Transférez quatre millilitres de la pension Celsius dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Faites tourner la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la palette cellulaire dans un millilitre du milieu complet sur glace. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité cellulaire finale avec le milieu complet à quatre fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Ajouter 0,1 millilitre de la suspension cellulaire préparée aux 0,9 millilitre de la matrice extracellulaire conservée sur la glace.Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas. Mélangez délicatement un millilitre du mélange de matrice cellulaire et un millilitre de collagène préalablement préparé en pipetant de haut en bas sur la glace. Pipeter 0,5 millilitre du mélange final dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour former un mélange de gel cellulaire.Après incubation, ajoutez 0,5 millilitre de milieu ostéogénique au mélange de gel cellulaire dans chaque puits. Pour commencer la différenciation ostéogénique à 37 degrés Celsius, considérez cela comme le jour zéro. Tous les deux jours, remplacez la moitié du milieu par du milieu ostéogénique frais et poursuivez la culture pendant 35 jours.Sortez les solutions mères de calcium AM et d’éthidium du congélateur et laissez-les se réchauffer à température ambiante. Ajouter quatre microlitres de la solution mère d’éthidium à deux millimolaires et cinq microlitres de la solution mère de quatre millimolaires de calcium AM à deux millilitres de DPBS et bien mélanger pour obtenir deux micromolaires de calcium AM et quatre micromolaires d’éthidium comme solution de travail. Pour effectuer la coloration cellulaire le premier et le septième jour de culture, pipetez 0,5 millilitre de la solution de travail dans les puits de la plaque à 24 puits et incubez pendant 30 à 45 minutes à température ambiante pour colorer la matrice de gel cellulaire.Ajouter environ 0,5 millilitre de DPBS frais dans une nouvelle boîte de culture à fond en verre de 35 millimètres et couvrir la boîte pour éviter la contamination ou le dessèchement des échantillons. À l’aide d’une pince à pointe coudée, transférez soigneusement la matrice de gel cellulaire colorée dans la boîte de culture contenant du DPBS sans endommager ni cisailler la matrice de gel cellulaire. Visualisez les cellules marquées sous un microscope à fluorescence confocale laser.Placez la boîte de culture contenant la matrice de gel cellulaire colorée sur la platine du microscope. Sélectionnez les régions de la matrice de gel cellulaire à scanner à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 10x. Pour régler le balayage du microscope, sélectionnez les filtres optiques.Considérez le calcium comme vert avec un filtre passe-bande fluorescent standard et l’éthidium comme rouge avec des filtres pour l’iodure de propidium ou le colorant rouge du Texas. Sélectionnez le mode ligne pour la numérisation, puis cliquez sur le mode d’acquisition pour régler les unités aérées sur une ua. Sélectionnez une profondeur de données de 8 bits et une résolution d’image de 1024 x 1024 pixels.Sélectionnez ensuite le pas de ligne et réglez la vitesse de numérisation sur cinq. Pour collecter la pile Z d’images, définissez les positions supérieure et inférieure de la matrice de gel cellulaire à numériser en faisant la mise au point sur l’échantillon tout en balayant en continu en fonction du signal du canal vert. Une fois que le haut et le bas de l’échantillon ont été spécifiés, sélectionnez le cadre de numérisation souhaité et lancez la numérisation.L’échantillon est numérisé de haut en bas avec les paramètres sélectionnés générant une galerie d’images. Pour identifier les cellules viables, sélectionnez une tranche d’image. Les canaux vert et rouge indiquent respectivement les cellules vivantes et mortes.Pour identifier la dendrite de la cellule, sélectionnez le canal vert unique pour générer des reconstructions 3D avec le logiciel d’acquisition d’images, une série d’images pseudo-couleurs arc-en-ciel indiquent les informations de profondeur. Les dendrites en bas sont affichées en rouge, tandis que celles en haut sont affichées en bleu. À différents jours de culture, retirez le milieu de culture et lavez les gels dans la plaque deux fois avec du DPBS.Ajouter 0,5 millilitre ou 4 % de paraformaldéhyde dans le DPBS dans le puits pour fixer la matrice de gel cellulaire dans la plaque pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez le paraformaldéhyde dans le puits et lavez la matrice de gel cellulaire deux fois de plus avec du DPBS dans la plaque comme démontré précédemment, et laissez 0,5 millilitre de DPBS dans chaque puits pour l’imagerie. Placez la plaque sur la platine du stéréomicroscope et sélectionnez la position optimale à travers l’oculaire à l’aide d’un objectif 0,5x.Image, la vue du champ complet de la matrice de gel cellulaire dans la plaque individuellement à l’aide d’une exposition automatique sous le champ clair. Au 35e jour de culture, vérifiez les niveaux d’azote liquide et démarrez le système XRF. Ouvrez la salle d’échantillonnage et transférez les gels à l’aide d’une pince à pointe coudée de la plaque au milieu de la platine d’échantillonnage de l’instrument.Fermez la salle d’échantillonnage et attendez 30 minutes pour permettre à l’instrument de refroidir avant de l’utiliser. Réglez le temps d’exposition sur 35 millisecondes. La gamme de spectre va de zéro à 40 kilo-électronvolts et le courant électrique à 770 microampères pour la configuration de l’acquisition.En déplaçant la platine de l’échantillon, choisissez trois à cinq sites de numérisation pour l’analyse. Sélectionnez les éléments calcium et phosphore. Lancez la détection et exportez les résultats.À différents jours de culture. Lavez la matrice de gel cellulaire retirée du milieu de culture deux fois avec du DPBS glacé comme démontré précédemment. Extraire l’ARN total de la matrice du gel cellulaire à l’aide de la méthode de l’alcool isoamylique au chloroforme phénolique.Ensuite, transcrivez inversement deux microgrammes d’ARN total en CDNA avec des amorces hexamères aléatoires. Placez le tube sur un thermocycleur et effectuez une amplification PCR. Après PCR, analysez les changements de pli avec la méthode de TDM à deux deltas.La coloration des cellules mortes vivantes visualisée au microscope laser confocal a montré que toutes les cellules étaient positives pour le calcium AM et presque pas pour l’éthidium 1, ce qui indique que le système de gel est très approprié pour l’ostéocytogenèse. Les dendrites cellulaires se sont progressivement étendues en un réseau dans le milieu ostéogénique au septième jour. Une image pseudo couleur de la culture du septième jour montre les androïdes cellulaires à différentes profondeurs en bas et en haut du gel.Des images plein champ du gel avec des cellules et du gel sans cellules dans une plaque à 24 puits aux moments indiqués sont imagées. La transparence de la matrice de gel a continué à diminuer jusqu’à ce qu’elle devienne opaque au jour 35, contrairement à la matrice de gel acellulaire. Le spectre XRF du gel opaque au jour 35 indiquait que le gel était complètement rempli de dépôts de calcium et de phosphore.L’expression de plusieurs gènes marqueurs analysés par PCR en temps réel a montré que les niveaux d’ARNm de la podoplanine et de la protéine de la matrice dentine ont continuellement augmenté du premier jour au jour 21 et que le niveau d’ARNm a diminué après le jour 21. Les niveaux d’ARNm du facteur de croissance des fibroblastes 23 et de la sclérostine ont continuellement augmenté au cours de toutes les étapes. Collagen one et la membrane basale se gélifient rapidement et à température ambiante.Par conséquent, tous les embouts et tubes utilisés doivent être pré-refroidis, sauf indication contraire. On peut observer tous les événements intéressants au cours de l’ostéogenèse par des techniques d’imagerie. Il est plus facile de localiser l’action de la molécule lors de la formation et de l’élongation des dendrites.

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