Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo

Ce protocole fournit une méthode pour étudier la fonction des cellules souches du côlon dans un environnement manipulable avec un coût de temps inférieur à celui des modèles animaux. La culture organoïde permet l’étude de la fonction des cellules souches dans un environnement sans immunité. Cela permet d’identifier les effets d’une cause spécifique, comme le KO de claudin-7.

La compréhension des mécanismes de la fonction des cellules souches peut faire la lumière sur de nouvelles cibles thérapeutiques pour des maladies débilitantes telles que les maladies inflammatoires de l’intestin et le cancer colorectal. Pour commencer l’isolement des cryptes du côlon de la souris euthanasiée, faites une incision d’environ deux pouces le long de la ligne médiane de la souris. Ensuite, épinglez la peau pour exposer l’abdomen.

Coupez le côlon juste en dessous du cœcum du côté proximal et au-dessus du rectum du côté distal pour isoler le côlon. Ensuite, retirez le tissu adipeux attaché au côlon à l’aide d’une pince. Après avoir expulsé les matières fécales du côlon isolé avec l’extrémité plate de la pince, coupez le tissu longitudinalement.

Lavez le mouchoir 10 à 15 fois avec du PBS froid en faisant tourbillonner le tissu dans le PBS entre les lavages avec une pince. Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux propres et tranchants, coupez le tissu en petits morceaux allant d’environ trois à cinq millimètres. Après avoir isolé le côlon d’une autre souris euthanasiée, combiner tous les morceaux de tissu dans un tube centrifuge de 50 millilitres contenant un milieu de dissociation épithélial froid et incuber les morceaux de tissu du côlon dans un milieu de dissociation épithéliale pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius avec un léger balancement.

Après l’incubation, laissez les fragments de tissu couler au fond du tube. Une fois réglé, jeter le milieu de dissociation épithéliale sans perturber les fragments de tissu. Répétez le processus lors du lavage du mouchoir 10 à 15 fois avec du PBS froid.

Jetez autant de PBS que possible pendant le lavage final. Ensuite, ajoutez un milieu de dissociation cryptique froid aux morceaux de tissu du côlon lavés dans un tube de 50 millilitres et agitez pendant cinq à 10 minutes à la main. Sous le capot de culture cellulaire, filtrer le média contenant le tissu avec une crépine à cellules en nylon de 70 microns dans un tube centrifuge frais de 50 millilitres.

Après filtration, centrifuger le tube à 200 G pendant 10 minutes à température ambiante, puis jeter le surnageant sans perturber les cryptes granulées. Remettez la pastille en suspension dans trois à quatre millilitres de PBS froid. Pipette 10 microlitres de la suspension cryptique dans une ligne sur une lame de microscope.

À l’aide du microscope, comptez le nombre de cryptes longues et complètes pour estimer la concentration de cryptes et calculez le volume approprié de cryptes nécessaires pour plaquer 10 cryptes par microlitre dans une plaque de 96 puits. Centrifuger un volume approprié de cryptes isolées dans un tube à microcentrifugation de 1,5 millilitre à 200 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres sans perturber les cryptes granulées.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de matrice de gel aux cryptes granulées sans introduire de bulles d’air. Attendez une à deux minutes jusqu’à ce que la matrice de gel soit partiellement solidifiée. Ensuite, plaquez 10 microlitres de la matrice de gel mélangée aux cryptes dans chaque puits d’une plaque de culture préchauffée de 96 puits pour former une forme de dôme.

Attendez 10 à 20 minutes pour que la matrice de gel soit complètement fixée en plaçant la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Enfin, ajoutez 100 microlitres de la solution de travail fraîchement préparée de milieu L-WRN complétée par des antibiotiques à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour récolter les organoïdes, retirez les vieux milieux des puits en appliquant une aspiration sous vide et fixez les organoïdes avec 4% de paraformaldéhyde pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, retirez 4% de paraformaldéhyde des puits par aspiration sous vide et traitez les organoïdes avec 100 microlitres de 30% de saccharose par puits à quatre degrés Celsius. Après 24 heures, retirer 30% de saccharose des puits par aspiration sous vide avant d’ajouter 10 microlitres de PBS à chaque puits. Utilisez un embout de pipette pour gratter doucement le fond du puits afin de dissocier les organoïdes contenant le dôme.

Ensuite, retirez le PBS contenant les organoïdes dissociés du puits avec une pipette et transférez-le dans un moule en plastique marqué rempli à 90% avec une température de coupe optimale, ou OCT, composé. Continuez le processus jusqu’à ce que tous les organoïdes aient été retirés de tous les puits. Ajouter le 2-méthylbutane à une fiole Dewar en acier inoxydable contenant des pastilles de glace carbonique, suffisamment pour couvrir les granulés.

Congeler l’organoïde contenant le bloc OCT en le maintenant régulièrement au-dessus du 2-méthylbutane. Enfin, conservez le bloc OCT contenant des organoïdes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être sectionné. L’image représentative met en évidence la croissance réussie des colonoïdes à partir de cryptes normales contenant de la claudine-7.

Les cryptes contenant claudin-7 ont commencé à former des sphéroïdes au deuxième jour, ont commencé à bourgeonner le cinquième jour et ont continué à croître et à bourgeonner jusqu’à ce qu’elles soient récoltées le neuvième jour. En revanche, les cryptes dépourvues de claudin-7 n’ont pas réussi à former des colonoïdes appropriés. Après un traitement au 4-hydroxytamoxifène pendant deux à trois jours, les cryptes knockout claudin-7 sont apparues sous forme d’amas circulaires de cellules.

Contrairement au contrôle, les cryptes ne sont pas devenues des sphéroïdes sains. La coloration par immunofluorescence de la claudine 7 dans le groupe témoin récolté et les organoïdes knock-out conditionnels a confirmé le succès de l’élimination de la claudine-7 en culture. Les colonoïdes témoins ont montré très peu de signal apoptotique le neuvième jour.

Cependant, les colonoïdes knockout claudin-7 ont montré une apoptose élevée en même temps. Assurer une solidification partielle avant le placage. Le placage avant la solidification partielle entraînera la propagation de la matrice de gel et la formation du dôme ne sera pas formée, ce qui affectera la survie et la croissance des cryptes.

Ce protocole peut être utilisé pour la découverte de médicaments, l’étude de la communication cellulaire, le métabolisme des médicaments, la viabilité, la prolifération et le développement d’un traitement personnalisé spécifique au patient. La mise en place de la culture organoïde a révolutionné l’étude des maladies et la médecine personnalisée.