Imagerie intravitale de l’expression de protéines fluorescentes chez des souris présentant un traumatisme crânien à crâne fermé et une fenêtre crânienne à l’aide d’un microscope à deux photons

Notre protocole fournit un moyen de visualiser la réponse neuronale au stress mécanique chez une souris vivante, ce qui peut fournir une preuve directe de la façon dont les lésions cérébrales traumatiques affectent le cerveau. Cette technique permet de surveiller la protéine cible au même endroit du cerveau chez le même animal pour les phases aiguës et chroniques après une lésion cérébrale traumatique. Le gène d’intérêt et le promoteur du virus peuvent être modifiés en conséquence pour étudier d’autres protéines dans les types cellulaires spécifiques du cerveau.

Pour commencer, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris anesthésiée. Retirez les cheveux du haut de la tête en les coupant avec des ciseaux ordinaires. Après avoir établi une incision médiane de 12 à 15 millimètres de long, exciser la peau sur les hémisphères gauche et droit du crâne à l’aide de ciseaux à ressort à pointe incurvée.

Une fois le crâne exposé, retirez le périoste en le frottant doucement avec l’applicateur stérile à embout en coton et en le rinçant avec une solution saline stérile. Une fois que la zone du crâne est sèche, marquez le site d’impact du traumatisme crânien, ou TCC, aux coordonnées 2,5 millimètres postérieures au bregma et deux millimètres latérales de la suture sagittale à droite. Retirez rapidement la souris du cadre stéréotaxique et placez la tête sur le coussin tampon sous le dispositif TBI.

Alignez la pointe de l’impacteur avec le site d’impact marqué. Soulevez la colonne métallique en tirant sur la corde en nylon attachée à 15 centimètres au-dessus de la tête de la souris, puis relâchez-la, permettant au poids de tomber librement sur la tige du transducteur, qui est en contact avec le sommet du crâne au site du traumatisme crânien. Placez la tête de la souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique conservé sous le microscope chirurgical.

Percez doucement et lentement la surface du crâne à l’aide d’un foret en carbure FG4 à une faible vitesse de rotor pour enlever le périoste restant et créer une surface crânienne rugueuse de sorte que le ciment dentaire se lie solidement au crâne. Utilisez une solution saline pour rincer et éliminer la poussière osseuse de la surface du crâne. Pour séparer les muscles latéraux du crâne, à environ cinq millimètres en arrière de l’œil, là où se trouve la suture reliant le crâne pariétal et temporal, insérez doucement les fines pointes fermées et déplacez doucement les pointes fermées dans le sens postérieur jusqu’à la suture lambdoïde.

Séparez les muscles latéraux du côté où l’implantation de la fenêtre crânienne se produira. Lavez les débris du site chirurgical à l’aide d’une solution saline et séchez la zone avec de la gaze. Pour implanter le poteau de tête, marquez le point central à 2,5 millimètres en arrière du bregma et à 1,5 millimètre de la suture sagittale sur l’hémisphère droit à l’aide d’un marqueur et d’un pied à coulisse chirurgical.

Tracez ensuite la circonférence de la craniotomie sur le crâne propre et sec. Desserrez la barre d’oreille et faites pivoter la tête, de sorte que le plan de la craniotomie soit parfaitement horizontal, puis serrez à nouveau la barre d’oreille. Utilisez le bâton de bois d’un applicateur à embout en coton pour ajouter deux petites gouttes de superglue sur les bords avant et arrière du poteau de tête.

Positionnez le poteau de tête en titane sur le centre de la craniotomie et ajustez-le rapidement pour qu’il repose dans le même plan où la fenêtre crânienne sera implantée. Appliquez une légère pression jusqu’à ce que la superglue soit sèche, ce qui prend généralement environ 30 secondes. Préparez le ciment dentaire dans un plat en céramique pré-refroidi en mélangeant soigneusement 300 milligrammes de poudre de ciment, six gouttes de liquide QuickBase et une goutte de catalyseur.

Appliquez rapidement une quantité généreuse de mélange de ciment dentaire sur le périmètre extérieur de la circonférence tracée et couvrez toute surface osseuse exposée. Cependant, ne couvrez pas le site de la craniotomie. Relâchez la barre d’oreille et fixez la tige de tête au cadre métallique pour vous assurer que la tête est stable pour un perçage précis le long de la circonférence de craniotomie marquée.

Pour effectuer la craniotomie, utilisez un pied à coulisse chirurgical pour vérifier le diamètre du cercle marqué comme indiqué précédemment, et ajustez-le si nécessaire, de sorte que la fenêtre crânienne s’adapte parfaitement à l’intérieur de la craniotomie. À l’aide d’une perceuse dentaire électrique, gravez et amincissez d’abord le crâne le long de l’extérieur du cercle marqué à l’aide d’une mèche en carbure FG4, ce qui crée une piste à l’intérieur de laquelle amincir le crâne. Irriguez la zone avec une solution saline pour éliminer la poussière d’os.

Continuez à amincir le crâne à l’aide d’une mèche en carbure FG 1/4 jusqu’à ce que le crâne soit fin et transparent. Périodiquement, arrêtez de forer et irriguez à nouveau toute la zone avec une solution saline stérile pour réduire l’échauffement de la perceuse et éliminer la poussière d’os. Terminez l’éclaircissage du crâne à l’aide d’un foret en carbure EF4 et continuez à éclaircir et à percer le reste du crâne le long de la piste.

Insérez une pince à pointe fine de 0,5 millimètre à travers l’endroit fissuré et soulevez doucement le lambeau osseux vers le haut sans indenter le cerveau sous-jacent. Après avoir retiré le lambeau osseux, irriguer la zone de craniotomie avec une solution saline. À l’aide de la pince chirurgicale à pointe incurvée, retirez délicatement la matière arachnoïdienne visible.

Utilisez la pince chirurgicale à pointe droite pour saisir la fenêtre en verre stérile avec la lamelle de couvercle en verre de trois millimètres vers le bas. Placez et ajustez la fenêtre en verre au-dessus du site de la craniotomie pour vous assurer que la fenêtre peut s’adapter parfaitement au bord de la craniotomie. La lamelle de protection en verre de cinq millimètres se trouve sur le dessus.

Préparez le ciment dentaire comme indiqué précédemment et attendez environ six minutes jusqu’à ce que le ciment devienne pâteux et épais. En attendant que le ciment devienne pâteux et épais, appliquez une pression adéquate sur la fenêtre à l’aide d’un manipulateur stéréotaxique pour vérifier que le crâne peut entrer en contact avec la vitre de manière sûre et serrée. Utilisez un pinceau applicateur de précision réglable pour ajouter une petite quantité de ciment le long du bord de la fenêtre afin de sceller la fenêtre en verre avec le crâne.

Attendez environ 10 minutes pour laisser le ciment sécher complètement, puis relâchez doucement et retirez le manipulateur au-dessus de la fenêtre. Complétez en coupant le ciment dentaire à l’aide de la perceuse dentaire avec une mèche en carbure FG4 si l’excès de ciment recouvre la fenêtre. Environ quatre heures après la chirurgie, une imagerie à deux photons a été réalisée, où au niveau superficiel vasculaire apparaissait noir, et au niveau profond d’environ 400 micromètres, l’expression de la protéine EGFP était distribuée de manière diffuse dans tout le corps cellulaire.

Une semaine et quatre mois après le traumatisme crânien, le schéma vasculaire observé au point de temps du jour zéro a été utilisé comme référence pour localiser la même région d’imagerie. Le schéma vasculaire est similaire à celui du jour zéro. De même, l’expression de l’EGFP a été détectée dans tout le corps cellulaire.

L’intensité de fluorescence au jour zéro et au quatrième mois était similaire aux niveaux superficiel et plus profond. Cependant, l’intensité de fluorescence à une semaine était inférieure à celle du jour zéro et de quatre mois, peut-être en raison de la répression traductionnelle rapportée pour d’autres modèles de TCC. Il est crucial de prendre la plus grande précaution lors de l’opération de l’étape de craniotomie pour éviter d’endommager le tissu cérébral.

N’insérez pas la pointe de la perceuse dans le cerveau. À l’aide de cette technique, les chercheurs peuvent visualiser longitudinalement différentes protéines d’intérêt dans la même cellule à travers différentes phases post-TCC, fournissant des informations sur la localisation, l’expression et la solubilité de cette protéine dans le cerveau des mammifères après un traumatisme.