Évaluation de l’intégrité de la barrière intestinale chez la souris à l’aide de dextrane marqué à la fluorescéine-isothiocyanate

Cette méthode aide à répondre aux questions de savoir si une condition modifie l’intégrité de la barrière intestinale ou si un traitement potentiel peut maintenir l’intégrité de la barrière intestinale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une technique non invasive et peu lourde pour évaluer et quantifier la perméabilité intestinale in vivo. Pour commencer, jeûnez les souris pendant quatre heures, puis administrez 200 microlitres de suspension FITC-dextran par gavage oral à chaque souris à l’aide d’une aiguille de gavage incurvée stérilisée de calibre 22 de 38 millimètres de calibre.

Démarrez une minuterie après le premier gavage et attendez cinq à 10 minutes entre chaque gavage pour permettre des mesures in vivo, en maintenant une heure après le gavage. Conserver la suspension FITC-dextran restante pour la courbe standard. Démarrez la machine et le logiciel en cliquant et en maintenant le bouton de démarrage enfoncé et laissez le système se réchauffer.

Cliquez sur État de l’appareil et assurez-vous que tous les appareils configurés affichent OK avant de continuer. Cliquez ensuite sur Nouvelle étude et enregistrez le fichier avec le nom souhaité. Ensuite, cliquez sur Options d’étude.

Entrez l’ID de l’échantillon et choisissez le bon laser et expérimentez. Ensuite, retirez la fourrure de la région abdominale à l’aide d’un rasoir électrique et appliquez généreusement une pommade vétérinaire sur les yeux pour éviter le dessèchement. Ouvrez la chambre d’imagerie et placez l’animal dorsalement sur la plaque de balayage.

Ensuite, fixez les membres et la queue avec du ruban adhésif. Ensuite, sélectionnez la zone à numériser à l’aide de l’outil Dessiner. Assurez-vous d’inclure toute la largeur de l’abdomen juste au-dessus du foie jusqu’au rectum.

Cliquez ensuite sur l’outil Modifier pour ajuster la zone une fois dessinée. Réglez la résolution de numérisation sur 2,0 millimètres et cliquez sur Démarrer pour commencer l’analyse. Ensuite, ouvrez les fichiers image en les trouvant sous le nom de fichier choisi et ouvrez simultanément tous les fichiers avec des paramètres synchronisés.

À l’aide de la barre d’outils des paramètres d’image, utilisez les boutons Synchroniser l’image et Synchroniser l’échelle pour synchroniser les paramètres d’image afin d’obtenir une comparaison précise. Enregistrez ensuite les images avec les échelles ajustées. Comparez la fluorescence abdominale de chaque animal et de la souris témoin sur des images uniformément mises à l’échelle à l’aide d’un logiciel associé au système d’imagerie.

Prélever une pastille fécale de chaque souris dans un tube stérile quatre heures après le gavage. Ensuite, gardez les tubes sur de la glace et placez-les dans l’obscurité. Ensuite, centrifuger les échantillons de sang à 9, 390 x g pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, transférez le plasma dans un nouveau tube stérile et conservez-le sur la glace dans l’obscurité. Diluer 50 milligrammes d’échantillons fécaux dans 200 microlitres de PBS et diluer le plasma avec du PBS dans un rapport de un à deux. Plaque 100 microlitres échantillons et étalons dans une plaque noire opaque de 96 puits.

Lire la fluorescence sur un lecteur de plaque fluorescente avec excitation à 485 nanomètres et absorption à 530 nanomètres. Enfin, déterminer la concentration de FITC-dextran par échantillon en comparant la fluorescence aux concentrations connues de la courbe étalon. L’analyse de la fluorescence in vivo a montré que les souris qui n’ont reçu que le régime témoin avaient un apport hépatique plus élevé de FITC-dextran et des niveaux plus élevés de fluorescence résiduelle dans la cavité abdominale par rapport aux souris qui ont reçu le régime supplémenté en inuline.

Les souris qui ont reçu le régime supplémenté en inuline avaient des niveaux significativement plus faibles de FITC-dextran dans leur plasma par rapport aux souris qui n’ont reçu que le régime témoin. De manière concordante, les souris qui ont reçu le régime d’inuline avaient des niveaux significativement plus élevés de FITC-dextran dans leurs fèces que les souris qui n’ont reçu que le régime témoin. Les niveaux plus faibles de FITC-dextran dans les fèces des souris contrôlées indiquent qu’il a pénétré à travers la barrière intestinale dans la circulation plutôt que d’être excrété de manière appropriée.

Les niveaux élevés de FITC-dextran dans le plasma ont renforcé cette découverte. Le timing est essentiel lors de la tentative de cette procédure. La lecture de la fluorescence et le prélèvement d’échantillons doivent se faire aussi près que possible d’une heure et quatre heures après le gavage pour chaque souris.