In vivo Livraison de gènes dans des cellules épithéliales mammaires de souris par injection intracanalaire mammaire

Cette méthode délivre le matériel génétique dans les cellules épithéliales de la glande mammaire d’une manière spéciale, temporaire et quantitativement contrôlable. Étant donné que l’apport de matériel génétique dans les cellules épithéliales mammaires est spécial, temporairement et quantitativement contrôlé, les modèles mammaires générés par cette méthode imitent mieux la genèse tumorale naturelle. Commencez la préparation de la seringue en coupant les aiguilles de moyeu métallique de calibre 33 à environ un centimètre de longueur et en les stockant dans de l’alcool.

Retirez les seringues et les aiguilles de l’alcool et propulsez l’alcool restant hors de la seringue et des aiguilles. Démontez ensuite la seringue pour la sécher à l’air. Après séchage, assemblez la seringue.

Sortez les tubes de stock viraux du congélateur à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les sur de la glace. Pour ajouter du bleu de bromophénol, trempez l’embout de la pipette à une profondeur d’un centimètre dans la poudre de bleu de bromophénol. Ensuite, apportez l’infime de bleu de bromophénol attaché dans la suspension virale.

Mélanger le bleu de bromophénol avec la solution virale en pipetant de haut en bas 10 fois, avant de placer le virus sur la glace. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’orteil d’une souris femelle anesthésiée. Appliquez une pommade sur les yeux pour éviter la sécheresse pendant que l’animal est sous anesthésie.

Placez la souris en décubitus dorsal sur un coussin chaud et fixez les quatre membres au banc à l’aide de ruban adhésif. Identifiez le mamelon à injecter et exposez-le en coupant les cheveux environnants à l’aide de ciseaux. Appliquez 70% d’alcool et iota quatre écouvillons en trois tours alternés sur la zone du mamelon pour nettoyer et exposer le mamelon.

Transectez l’extrémité distale d’un mamelon à l’aide d’une paire de ciseaux à ressort à microdissection stérilisés, jusqu’à ce qu’une petite ouverture canalaire centrale puisse être vue sous une lampe à loupe. Ensuite, chargez 10 microlitres du mélange de bleu de bromophénol du virus dans la seringue et insérez soigneusement l’aiguille dans l’ouverture du mamelon à l’aide de la lampe loupe. Injectez les 10 microlitres entiers du virus dans le conduit et placez la souris sur un chauffe-lames réglé à 45 degrés Celsius jusqu’à ce que la souris se réveille complètement.

Ouvrez la cavité thoracique trois à cinq jours après l’injection du virus. Couper la peau le long de la ligne médiane ventrale et des membres supérieurs et inférieurs à l’aide de ciseaux. Soulevez la peau et exposez les glandes mammaires.

Retirez la glande mammaire injectée de la peau et une glande non injectée comme témoin à l’aide de forceps et de ciseaux. Une fois cela fait, placez la glande mammaire sur une lame de verre et étalez la glande à sa forme originale avant de l’observer et de l’imager sous un stéréomicroscope fluorescent. Le succès de l’injection intracanalaire a été confirmé par l’exposition de la glande mammaire et l’observation d’un arbre canalaire bleu.

Après deux à cinq jours d’injection du virus lenti-EGFPFUCGW, l’infection des cellules épithéliales mammaires a été évaluée en observant la préparation de la monture entière au microscope stéréoscopique fluorescent. Pour l’analyse par cytométrie en flux des protéines fluorescentes ou des marqueurs de surface cellulaire produits par le virus, les glandes non infectées et les glandes infectées ont été collectées et transformées en une suspension cellulaire unique pour estimer le taux d’infection virale. ERBBB2 activé a conduit à des lésions précancéreuses en quelques semaines et des tumeurs en quelques mois.

La taille des mamelons peut varier considérablement en raison des différences de masse, d’âge, de poids corporel et de force entre les souris individuelles. Couper correctement l’extrémité du mamelon pour exposer l’ouverture du canal mammaire et l’ajustement de l’aiguille est une étape importante pour injecter le virus avec succès.