Microdissection et microscopie électronique à balayage à monture entière Visualisation du plexus choroïde de souris
December 16th, 2022
Le plexus choroïde (CP), un tissu peu étudié en neurosciences, joue un rôle clé dans la santé et la maladie du système nerveux central. Ce protocole décrit une technique de microdissection pour isoler le CP et l’utilisation de la microscopie électronique à balayage pour obtenir une vue d’ensemble de sa structure cellulaire.
Pour mieux comprendre la composition et la structure du plexus choroïde, une méthode efficace pour isoler le plexus choroïde des ventricules cérébraux est une première étape inestimable. Avec cette technique de microdissection, il est possible de disséquer le plexus choroïde hors des ventricules cérébraux tout en contenant sa fonction, sa viabilité et sa structure sans contaminer le plexus choroïde avec les tissus environnants. Un obstacle important dans l’isolement du plexus choroïde est l’identification de la structure car elle flotte encore dans les ventricules cérébraux.
La coloration du plexus choroïde avec du bleu de bromophénol facilite l’isolement. La procédure sera présentée par Elien Van Wonterghem, notre responsable de laboratoire. Commencez par préparer une solution d’anesthésie terminale, de perfusion transcardique et une solution requise pour la microscopie électronique à balayage, ou MEB, et d’autres solutions mentionnées dans le texte.
Pour isoler le cerveau de la souris, placez l’animal anesthésié en phase terminale dans la position du décubitus dorsal et fixez la souris en épinglant les membres sur une plaque. Désinfectez la poitrine en pulvérisant de l’éthanol à 70% avant de faire une incision d’environ quatre centimètres juste sous le diaphragme à l’aide d’une lame chirurgicale en acier au carbone. Ouvrez la peau et exposez la poitrine à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
Coupez complètement le diaphragme et séparez le thorax pour exposer les poumons et le cœur qui bat. À l’aide d’une pompe à perfusion transcardiale, la souris perfuse avec 10 millilitres de solution de perfusion à un taux de 4,5 millilitres par minute. Insérez une aiguille de calibre 26 dans le ventricule gauche pour pomper la solution dans le circuit systémique.
À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez l’oreillette droite pour que le sang sorte de la circulation. Après la décapitation de la souris, coupez le cuir chevelu en faisant une incision commençant entre les oreilles jusqu’aux yeux supérieurs aux yeux. Tirez la peau latéralement pour exposer le crâne.
Ensuite, coupez le crâne en suivant les sutures squamosales vers la partie nasale. Une fois cela fait, placez le cerveau dans une boîte de Petri glacée et ajoutez un millilitre de PBS glacé au tissu cérébral. Pour isoler le plexus choroïde flottant dans le quatrième ventricule, coupez doucement le cervelet du cerveau à l’aide d’un scalpel.
Retirez les parties restantes du tissu du tronc cérébral du cervelet. Faites pivoter le cerveau de manière à ce que la ligne de coupe soit tournée vers le haut, en veillant à ce que la quatrième cavité ventriculaire soit visible au milieu de la section avec le plexus choroïde situé sur le site dorsal. Si nécessaire, ouvrez le ventricule en tirant le tissu conjonctif avec une pince tranchante.
Arrachez doucement le plexus choroïde de la paroi du ventricule à l’aide de minuscules pinces tranchantes. Pour isoler le plexus choroïde du ventricule latéral, coupez sagittiquement le cerveau en deux hémisphères à l’aide de minuscules pinces tranchantes. Faites pivoter un hémisphère cérébral de sorte que la ligne de coupe soit vers le haut.
Pour révéler le ventricule latéral, retirez doucement le cortex du thalamus. Rétractez l’hippocampe à la ligne de coupe mi-sagittale. Le ventricule latéral est maintenant visible avec le plexus choroïde situé au bas du ventricule.
Si nécessaire, ouvrez un peu le ventricule en ouvrant le tissu conjonctif avec une pince tranchante. Utilisez de minuscules pinces tranchantes pour arracher doucement le plexus choroïde de la paroi du ventricule. Pour effectuer la préparation de l’échantillon pour le SEM, transférer le plexus choroïde fraîchement isolé dans une solution de fixation fraîchement préparée et incuber pendant une nuit à quatre degrés Celsius.
Une fois cela fait, laver l’échantillon trois fois en utilisant trois à cinq millilitres de tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire pendant cinq minutes chacun. Postfixer les échantillons dans trois à cinq millilitres de tétroxyde d’osmium 2% dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun en utilisant trois à cinq millilitres d’eau ultrapure.
Ensuite, déshydrater les échantillons dans une série croissante de concentrations d’alcool éthylique glacé avec 15 minutes par solution d’alcool éthylique. Utilisez un sécheur à point critique pour sécher correctement l’échantillon. Placez soigneusement l’échantillon sur un support d’échantillon avec un autocollant en carbone et visualisez les échantillons de plexus choroïde en utilisant SEM.
Le présent protocole a facilité l’isolement efficace du plexus choroïde des ventricules latéraux et quatrièmes du cerveau de la souris. La perfusion avec le bleu de bromophénol a permis de visualiser le plexus choroïde. Lorsque le bleu de bromophénol n’était pas autorisé dans les étapes de traitement ultérieures, la perfusion avec de l’héparine PBS ou aucune perfusion n’a été effectuée pour le traitement.
L’analyse morphologique SEM de la surface des cellules épithéliales du plexus choroïde, ou CPE, montre clairement la structure à deux bras du quatrième ventricule et la forme typique en forme de C du plexus choroïde latéral isolée du ventricule latéral. Un grossissement SEM plus élevé a révélé des structures ressemblant à des vésicules sur la face apicale des cellules CPE et des microvillosités, indiquant que les altérations morphologiques des cellules CPE dans des conditions pathologiques peuvent être étudiées à l’aide de la MEB. Il est important de toucher et de retirer uniquement le tissu du plexus choroïde afin de ne pas contaminer l’échantillon avec les tissus environnants.
Soyez prudent pour préserver la structure du plexus choroïde. Une variété de techniques en aval peuvent être appliquées sur le plexus choroïde isolé pour étudier sa structure et sa fonction, allant de l’analyse au microscope à la cytométrie en flux, en passant par l’analyse du transcriptome. La microdissection du plexus choroïde hors du cerveau nous permet de mieux comprendre la structure et la fonction de ce minuscule tissu cérébral.
Ces connaissances sont essentielles pour mieux comprendre son rôle dans les maladies neurologiques.
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Aperçu
Cet article détaille une technique de microdissection pour isoler le plexus choroïde (PC) des ventricules du cerveau de souris, ainsi que l'utilisation de la microscopie électronique à balayage (MEB) pour examiner sa structure cellulaire. Comprendre l'architecture et la fonction du PC est essentiel en neurosciences, en particulier en ce qui concerne son implication dans la santé et les maladies du système nerveux central.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Neuroanatomie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Le plexus choroïde est un tissu important mais sous-étudié.
- Il joue un rôle crucial dans la santé et la pathologie du système nerveux central.
- L'isolement et la caractérisation efficaces du PC ont des implications pour la compréhension des maladies neurologiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour isoler le plexus choroïde des ventricules du cerveau de souris.
- Examiner la structure cellulaire du plexus choroïde par microscopie électronique à balayage.
- Préserver la viabilité et l'intégrité du plexus choroïde pendant l'isolement.
Méthodes utilisées
- L'étude emploie des techniques de microdissection pour isoler le plexus choroïde.
- Des modèles murins sont utilisés pendant le processus d'isolement, avec un accent particulier sur les quatrième et latéraux ventricules.
- La méthodologie comprend une anesthésie terminale, des procédures chirurgicales et une fixation pour l'analyse par MEB.
- Les étapes critiques incluent l'utilisation de coloration au bleu de bromophénol pour une visualisation améliorée, et une manipulation méticuleuse pour éviter la contamination.
Résultats principaux
- Le protocole a effectivement isolé le plexus choroïde, permettant une analyse morphologique par MEB.
- Les observations ont révélé des caractéristiques structurelles définitives des cellules épithéliales du plexus choroïde, y compris des microvillosités et des structures semblables à des vésicules.
- Ces résultats permettent des investigations ultérieures sur les altérations liées aux maladies au niveau cellulaire.
Conclusions
- Cette étude démontre une approche rationalisée pour isoler le plexus choroïde pour une analyse structurelle détaillée.
- Les informations obtenues peuvent améliorer la compréhension du rôle du PC dans la santé et les maladies neurologiques.
- Dans l'ensemble, la méthode permet une avancée significative dans l'étude de ce composant cérébral crucial mais souvent négligé.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Efficient microdissection and SEM visualization of the mouse choroid plexus (CP) enable high-fidelity structural and functional analysis of this critical CNS interface. This workflow supports early discovery efforts by providing uncontaminated, viable CP tissue for downstream molecular and morphological studies, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in neurobiological research. Reliable CP isolation underpins translational continuity for CNS disease models and biomarker exploration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of CP structure and function for target validation in CNS research.
- Supports mechanistic de-risking by preserving tissue viability and minimizing contamination.
- Facilitates predictive confidence in early-stage neurobiological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated CP tissue for quantitative downstream assays, including transcriptomics and proteomics.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining structural integrity during isolation.
- Prepares samples suitable for high-resolution imaging and scalable analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables investigation of disease-relevant morphological changes in CP epithelial cells using SEM.
- Supports alignment of preclinical models with human CNS disease mechanisms.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural findings to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This microdissection and SEM protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing foundational tissue samples for molecular, cellular, and imaging analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating uncontaminated CP tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples for reproducible quantitative measurements.
- Analytics: Enables high-resolution morphological readouts and comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability in tissue preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and SEM sample preparation.
- Needs access to perfusion equipment, fixation reagents, and electron microscopy infrastructure.
- Demands strict cross-team standardization to avoid tissue contamination.
- Adaptable to other species with protocol modifications as needed.
- Careful handling is essential to preserve CP structure and downstream analytical quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
