Microdissection et microscopie électronique à balayage à monture entière Visualisation du plexus choroïde de souris

Pour mieux comprendre la composition et la structure du plexus choroïde, une méthode efficace pour isoler le plexus choroïde des ventricules cérébraux est une première étape inestimable. Avec cette technique de microdissection, il est possible de disséquer le plexus choroïde hors des ventricules cérébraux tout en contenant sa fonction, sa viabilité et sa structure sans contaminer le plexus choroïde avec les tissus environnants. Un obstacle important dans l’isolement du plexus choroïde est l’identification de la structure car elle flotte encore dans les ventricules cérébraux.

La coloration du plexus choroïde avec du bleu de bromophénol facilite l’isolement. La procédure sera présentée par Elien Van Wonterghem, notre responsable de laboratoire. Commencez par préparer une solution d’anesthésie terminale, de perfusion transcardique et une solution requise pour la microscopie électronique à balayage, ou MEB, et d’autres solutions mentionnées dans le texte.

Pour isoler le cerveau de la souris, placez l’animal anesthésié en phase terminale dans la position du décubitus dorsal et fixez la souris en épinglant les membres sur une plaque. Désinfectez la poitrine en pulvérisant de l’éthanol à 70% avant de faire une incision d’environ quatre centimètres juste sous le diaphragme à l’aide d’une lame chirurgicale en acier au carbone. Ouvrez la peau et exposez la poitrine à l’aide de ciseaux chirurgicaux.

Coupez complètement le diaphragme et séparez le thorax pour exposer les poumons et le cœur qui bat. À l’aide d’une pompe à perfusion transcardiale, la souris perfuse avec 10 millilitres de solution de perfusion à un taux de 4,5 millilitres par minute. Insérez une aiguille de calibre 26 dans le ventricule gauche pour pomper la solution dans le circuit systémique.

À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez l’oreillette droite pour que le sang sorte de la circulation. Après la décapitation de la souris, coupez le cuir chevelu en faisant une incision commençant entre les oreilles jusqu’aux yeux supérieurs aux yeux. Tirez la peau latéralement pour exposer le crâne.

Ensuite, coupez le crâne en suivant les sutures squamosales vers la partie nasale. Une fois cela fait, placez le cerveau dans une boîte de Petri glacée et ajoutez un millilitre de PBS glacé au tissu cérébral. Pour isoler le plexus choroïde flottant dans le quatrième ventricule, coupez doucement le cervelet du cerveau à l’aide d’un scalpel.

Retirez les parties restantes du tissu du tronc cérébral du cervelet. Faites pivoter le cerveau de manière à ce que la ligne de coupe soit tournée vers le haut, en veillant à ce que la quatrième cavité ventriculaire soit visible au milieu de la section avec le plexus choroïde situé sur le site dorsal. Si nécessaire, ouvrez le ventricule en tirant le tissu conjonctif avec une pince tranchante.

Arrachez doucement le plexus choroïde de la paroi du ventricule à l’aide de minuscules pinces tranchantes. Pour isoler le plexus choroïde du ventricule latéral, coupez sagittiquement le cerveau en deux hémisphères à l’aide de minuscules pinces tranchantes. Faites pivoter un hémisphère cérébral de sorte que la ligne de coupe soit vers le haut.

Pour révéler le ventricule latéral, retirez doucement le cortex du thalamus. Rétractez l’hippocampe à la ligne de coupe mi-sagittale. Le ventricule latéral est maintenant visible avec le plexus choroïde situé au bas du ventricule.

Si nécessaire, ouvrez un peu le ventricule en ouvrant le tissu conjonctif avec une pince tranchante. Utilisez de minuscules pinces tranchantes pour arracher doucement le plexus choroïde de la paroi du ventricule. Pour effectuer la préparation de l’échantillon pour le SEM, transférer le plexus choroïde fraîchement isolé dans une solution de fixation fraîchement préparée et incuber pendant une nuit à quatre degrés Celsius.

Une fois cela fait, laver l’échantillon trois fois en utilisant trois à cinq millilitres de tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire pendant cinq minutes chacun. Postfixer les échantillons dans trois à cinq millilitres de tétroxyde d’osmium 2% dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 molaire pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun en utilisant trois à cinq millilitres d’eau ultrapure.

Ensuite, déshydrater les échantillons dans une série croissante de concentrations d’alcool éthylique glacé avec 15 minutes par solution d’alcool éthylique. Utilisez un sécheur à point critique pour sécher correctement l’échantillon. Placez soigneusement l’échantillon sur un support d’échantillon avec un autocollant en carbone et visualisez les échantillons de plexus choroïde en utilisant SEM.

Le présent protocole a facilité l’isolement efficace du plexus choroïde des ventricules latéraux et quatrièmes du cerveau de la souris. La perfusion avec le bleu de bromophénol a permis de visualiser le plexus choroïde. Lorsque le bleu de bromophénol n’était pas autorisé dans les étapes de traitement ultérieures, la perfusion avec de l’héparine PBS ou aucune perfusion n’a été effectuée pour le traitement.

L’analyse morphologique SEM de la surface des cellules épithéliales du plexus choroïde, ou CPE, montre clairement la structure à deux bras du quatrième ventricule et la forme typique en forme de C du plexus choroïde latéral isolée du ventricule latéral. Un grossissement SEM plus élevé a révélé des structures ressemblant à des vésicules sur la face apicale des cellules CPE et des microvillosités, indiquant que les altérations morphologiques des cellules CPE dans des conditions pathologiques peuvent être étudiées à l’aide de la MEB. Il est important de toucher et de retirer uniquement le tissu du plexus choroïde afin de ne pas contaminer l’échantillon avec les tissus environnants.

Soyez prudent pour préserver la structure du plexus choroïde. Une variété de techniques en aval peuvent être appliquées sur le plexus choroïde isolé pour étudier sa structure et sa fonction, allant de l’analyse au microscope à la cytométrie en flux, en passant par l’analyse du transcriptome. La microdissection du plexus choroïde hors du cerveau nous permet de mieux comprendre la structure et la fonction de ce minuscule tissu cérébral.

Ces connaissances sont essentielles pour mieux comprendre son rôle dans les maladies neurologiques.