Explorer les aberrations chromosomiques X dans les cellules ovariennes en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence

L’analyse FISH de cellules ovariennes de femmes présentant des aberrations chromosomiques X est une technique unique pour mieux comprendre le contenu chromosomique X des cellules ovariennes de ce groupe spécifique. Ces techniques pourraient être utiles pour en apprendre davantage sur le potentiel de reproduction chez les femelles présentant des aberrations chromosomiques X. Il est important de mentionner que les deux méthodes sont destinées à faciliter les recherches futures et ne sont pas conçues pour être utilisées comme outil de diagnostic dans la pratique clinique.

La procédure sera présentée par Ronald Peek, chercheur principal de notre laboratoire de fertilité, et Milad Intezar, analyste de notre département de pathologie. Pour commencer, coupez le tissu du cortex ovarien cryoconservé ou décongelé en petits morceaux d’un par un par un millimètre à l’aide d’un scalpel. Digérer enzymatiquement les fragments de tissu dans quatre litres de L15 préchauffé pendant 75 minutes à 37 degrés Celsius.

Pipeter le mélange de digestion de haut en bas toutes les 15 minutes. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant quatre millilitres de L15 froide complétée par 10% de sérum bovin fœtal, ou FBS. Laver le tissu dissocié une fois avec huit millilitres de milieu L15 froid par centrifugation à 500 g avant de remettre en suspension dans 500 microlitres de milieu L15.

Transférer la suspension cellulaire contenant en grande partie des cellules stromales individuelles et de petits follicules dans une boîte de Petri en plastique et examiner la suspension au stéréomicroscope. Prélevez manuellement les follicules de moins de 50 micromètres à l’aide d’une pipette en plastique de 75 micromètres et transférez-les dans la gouttelette de milieu L15 supplémentée avec 10% FBS à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez les follicules purifiés dans une solution de 0,06% de trypsine, un milligramme par millilitre d’EDTA et un milligramme par millilitre de glucose, et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, obtenir des cellules stromales ovariennes à partir de la suspension de cellules du cortex à l’aide d’une pipette en plastique de 75 micromètres. Pour l’hybridation in situ par fluorescence, ou l’analyse FISH de cellules ovariennes individuelles, transférer les follicules ovariens traités avec de la trypsine / EDTA / glucose, ou des cellules stromales à des gouttelettes de cinq microlitres de chlorure de potassium 0,15 millimolaire et 15 microlitres de DPBS sur une lame, et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Sécher et préfixer la lame dans 300 microlitres de chlorure de potassium 0,05 millimolaire, d’acide acétique à 7,5% et de méthanol à 22,5% pendant deux minutes.

Couvrir la lame avec de l’acide acétique au méthanol trois pour un pendant deux minutes pour finaliser la fixation. Après la fixation, laver l’échantillon deux fois dans un SSC fraîchement préparé à 73 degrés Celsius. Couvrez-le de 100 microlitres de 2% de protéinase K et scellez-le avec un couvercle.

Incuber la lame pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans la station d’hybridation. Après l’incubation, retirez le couvercle et lavez la lame pendant cinq minutes dans du DPBS à température ambiante sous agitation. Fixez l’échantillon pendant cinq minutes avec 1% de formaldéhyde.

Ensuite, lavez la lame dans DPBS et déshydratez-la en série en augmentant les concentrations d’éthanol pendant deux minutes chacune. Sécher l’échantillon à l’air avant de l’hybrider avec des sondes marquées par fluorescence. Ensuite, ajoutez un microlitre de CEPX, un microlitre de CEP18 et 18 microlitres de tampon d’hybridation à l’échantillon et scellez avec un couvercle collé à la lame.

Transférer la lame à la station d’hybridation pour une dénaturation à 73 degrés Celsius pendant trois minutes, suivie d’une hybridation pendant une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius. Après l’hybridation, retirez le couvercle et toute colle restante de la lame. Lavez la lame dans 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 à 72 degrés Celsius pendant deux minutes, suivie d’une incubation pendant une minute dans 2X SSC et 0,1% Tween-20.

Déshydratez la lame comme démontré et séchez-la à l’air libre dans l’obscurité avant de la recouvrir d’un support de montage contenant du DAPI. Placez la lame à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes avant l’analyse par microscopie à fluorescence. Pour hybrider des sections de paraffine, sélectionnez de nouvelles sections avant ou après la section contenant les follicules du ruban de paraffine.

Montez une section sur une lame de verre et séchez-la pendant 45 minutes sur un poêle à 56 degrés Celsius. Déparaffiner la section dans du xylène pendant 10 minutes, puis immerger la lame dans de l’éthanol à 99,5 % et la rincer pendant cinq minutes à l’eau du robinet. Prétraiter la lame avec la solution de récupération cible pendant 10 minutes à 96 degrés Celsius.

Après refroidissement, rincer la lame à l’eau distillée. Traiter la lame pendant cinq minutes avec 0,01 molaire d’acide chlorhydrique, suivie d’une digestion de la pepsine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Rincer à nouveau la lame dans de l’acide chlorhydrique, puis dans du PBS.

Fixez la lame dans du PBS de formaldéhyde à 1% pendant cinq minutes. Ensuite, rincez brièvement la lame dans du PBS, puis à nouveau dans de l’eau déminéralisée avant de la déshydrater dans de l’éthanol à 99,5%. Appliquez cinq microlitres de sonde CEP18 et CEPX sur la lame prétraitée.

Appliquez ensuite un bordereau de couverture et scellez la zone avec de la colle photo. Placez la lame dans un hybrideur pour la dénaturation à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes et l’hybridation pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, rincer la lame deux fois pendant cinq minutes chacune en SSC à 42 degrés Celsius, suivie d’un rinçage de deux minutes et d’une minute dans du Nonidet P-40 à 0,3% à 73 degrés Celsius.

Encore une fois, rincer la lame dans 2X SSC suivie d’un rinçage à l’eau distillée avant de la déshydrater avec de l’éthanol à 99,5%. Séchez la glissière à l’air et montez-la dans un support de montage contenant du DAPI. Le tissu du cortex ovarien cryoconservé chez la patiente A a montré 50% des lymphocytes, avait un caryotype X 45, et 50% avait 46, XX.In patient B, 38% des lymphocytes étaient 45, X, 28% étaient 46, XX et 34% étaient 47, XXX.

Les cellules stromales environnantes ont également été analysées pour le contenu chromosomique X. La digestion enzymatique du tissu du cortex ovarien a entraîné une suspension de cellules largement dissociées, mais laissant les follicules primordiaux, constitués d’un ovocyte intact entouré d’une seule couche de cellules de granulose. Les petits follicules ont fourni des difficultés dans l’interprétation des signaux après FISH, en raison de l’agglutination des cellules de la granulose.

Une digestion supplémentaire des follicules avec de la trypsine avant FISH a entraîné la contraction des cellules de granulose individuelles dans une morphologie sphérique à la surface des follicules. La coloration à l’éosine d’hématoxyline a montré des follicules secondaires et antraux morphologiquement normaux dans le tissu du cortex ovarien après cinq mois de xénogrographie. Le contenu chromosomique X des cellules de granulose de ces follicules a été déterminé par analyse FISH.

La fixation du tissu du cortex ovarien greffé dans la solution de Bouin a entraîné des signaux fluorescents flous et largement obscurcis dans les cellules folliculaires en raison d’une brume verte. En revanche, le tissu du cortex ovarien fixé dans le formaldéhyde a fourni d’excellents signaux fluorescents. Le principal défi de ce protocole réside dans l’isolement des cellules ovariennes et la digestion enzymatique du tissu.

S’écarter de ce protocole peut entraîner une perte substantielle de cellules ovariennes au cours du processus, ce qui devrait être particulièrement évité chez les femmes qui ont déjà une faible réserve ovarienne. Un profilage supplémentaire de l’expression génique pourrait être utile pour en savoir plus sur l’impact des cellules ovariennes aneuploïdes sur la folliculogenèse, et donc le processus d’insuffisance ovarienne prématurée chez les femmes présentant des aberrations chromosomiques X.