Visualisation des métabolites identifiés dans le métabolome spatial de la médecine traditionnelle chinoise à l’aide de DESI-MSI

Cet article décrit principalement une méthode rentable de préparation d’échantillons de plantes et d’imagerie à l’aide de DESI-MSI, et peut surmonter les inconvénients associés aux tissus secs, qui se fracturent facilement lorsque l’azote pénètre. La racine a été cryosectionnée sur le microtome cryostat, tandis que la feuille a été préparée par impression, ce qui nécessite une machine coûteuse ou perd l’intensité du signal. Notre méthode peut surmonter ces limitations.

Cette méthode peut être utilisée dans la métabolomique spatiale des plantes telles que la distribution et le mouvement des toxiques dans les plantes soumises à un stress abiotique et biotique. Pour commencer, prenez les racines et les feuilles nettoyées d’un plant de salvia miltiorrhiza de deux ans et coupez-les directement à une épaisseur transversale d’environ trois à cinq millimètres. Ensuite, collez l’échantillon sur une lame de verre de microscope à adhérence à l’aide de ruban adhésif double face.

Placez une autre lame de verre de microscope au-dessus de l’échantillon et enveloppez-les avec un film d’étanchéité comme un sandwich. Ensuite, congelez l’échantillon sandwich à moins 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures, puis soumettez-le à un vide à air pendant deux heures avec la température piégée à moins 75 à moins 82 degrés Celsius et la jauge à vide à 2,5 à 3,7 pascal. Pour l’analyse, après avoir retiré les échantillons de l’entrepôt frigorifique, les amener à température ambiante dans un dessiccateur pour éviter la condensation sur la surface de l’échantillon avant de soumettre l’échantillon à une application matricielle.

Mettre en œuvre la configuration du détecteur d’instruments et l’étalonnage de masse en mode d’ionisation par électropulvérisation ou ESI. Effectuer la configuration du détecteur en utilisant de la leucine et de la céphaline dans de l’acétonitrile d’eau dans un rapport de un à un, et effectuer un étalonnage de masse avec du formiate de sodium et de l’isopropanol de l’eau dans un rapport de un à un. Retirez la source ESI et montez l’unité DESI sur le spectromètre de masse.

Connectez l’alimentation en azote gazeux à l’unité DESI et réglez la pression du gaz à environ 0,5 mégapascal. Remplissez une seringue de cinq millilitres avec de la leucine, de la céphaline et de l’acide formique dans du méthanol aqueux dans un rapport de un à neuf, et fixez la seringue à la pompe à seringue haute performance pour fournir un solvant pour l’ionisation des produits chimiques dans l’échantillon. Ensuite, fixez un capillaire fournissant du solvant à la seringue et au pulvérisateur DESI.

Le solvant fournissant le capillaire est un capillaire standard de dimensions avec un diamètre interne de 75 micromètres et un diamètre extérieur de 375 micromètres. Démarrez la pompe à seringue et réglez le débit de perfusion à deux microlitres par minute pour obtenir un débit et une pulvérisation constants du solvant. Fermez la valve d’azote gazeux, puis allumez-la après environ 15 secondes.

Une petite goutte de solvant souffle sur la scène et la pulvérisation peut être vue si le flux de solvant est dans un état constant. Ensuite, ajustez la position du pulvérisateur en termes d’angle de pulvérisation, d’axe XYZ, de saillie et de hauteur. Utilisez des marqueurs rouges et noirs comme références pour optimiser le signal de spectrométrie de masse afin d’obtenir une intensité de signal d’environ une fois 10 à la cinquième en mode sensibilité.

Comme la saillie du pulvérisateur est le facteur le plus important qui affecte l’intensité du signal, ajustez la saillie en changeant la protection de l’azote gazeux à l’aide d’une clé de cinq millimètres. La direction de pulvérisation influence la qualité de l’image de masse. Par conséquent, tournez le pulvérisateur jusqu’à ce que la pulvérisation soit droite.

Après toutes ces étapes, la configuration est prête pour les expériences et est normalement stable pendant environ trois semaines d’utilisation après la configuration initiale. Pour l’imagerie DESI-MS, aucun prétraitement de l’échantillon n’est requis. Cependant, retirez l’excès de média sur les diapositives si possible.

Prenez une image de l’échantillon sur la lame. Sans toucher la surface de l’échantillon pour éviter toute impureté, placez la lame sur la position de la plaque sur la platine DESI, qui a deux positions de plaque, A et B.Utilisez des lames standard ou une lame complète pour s’adapter à la position. Une diapositive complète peut accueillir jusqu’à quatre diapositives et dispose donc d’une zone beaucoup plus grande pour les expériences.

Ouvrez le logiciel de traitement d’images de masse haute définition. Définissez une nouvelle plaque dans l’onglet Acquérir et sélectionnez la position de plaque appropriée, A ou B, et le type de plaque. Dans la page Sélection d’image, sélectionnez les quatre coins de la diapositive, puis l’image est ajustée automatiquement à l’orientation correcte.

Pour définir les paramètres MS, sélectionnez le type d’expérience en mode DESI-MS couramment utilisé dans lequel seul l’ion parent sera détecté. Ensuite, sélectionnez la polarité comme positive ou négative car l’instrument ne peut utiliser qu’une seule polarité dans une expérience. Appliquez ensuite le mode sensibilité pour obtenir plus d’informations sur les produits chimiques en petites quantités.

Ensuite, dessinez un rectangle pour définir la zone de numérisation dans l’onglet Motif et définissez la taille des pixels en conservant les tailles X et Y du pixel égales. Définissez la fréquence de numérisation sur cinq fois la taille en pixels. Enregistrez le projet et exportez une feuille de calcul pour le logiciel d’acquisition MS.

Ensuite, importez la feuille de calcul dans le logiciel d’acquisition MS et enregistrez-la en tant que nouvelle liste d’exemples. Appuyez sur Démarrer l’exécution pour commencer la numérisation des images MS et plusieurs images peuvent être ajoutées à la file d’attente des expériences en important davantage de feuilles de calcul. Chargez le fichier de données de l’échantillon dans le logiciel de traitement d’image de masse et définissez les paramètres pour le traitement d’image DESI.

Comme la leucine et la céphaline ont été utilisées pour la masse de verrouillage interne, et que la masse de verrouillage est le seul point pour identifier la polarité de l’expérience, il est crucial de définir la masse de verrouillage correcte. Définissez 556.2772 pour le mode positif et 554.2620 pour le mode négatif. Pour créer une liste de produits chimiques cibles, chargez le fichier de données traitées pour visualiser l’image DESI de l’échantillon.

Cliquez sur le bouton Normalisation pour normaliser les données par chromatographie ionique totale afin d’obtenir l’intensité relative d’un produit chimique spécifique par rapport à la référence, puis différents échantillons peuvent être comparés les uns aux autres. Dessinez une région d’intérêt, ou ROI, et copiez plusieurs copies sur l’exemple d’image. Sélectionnez ensuite tous les ROI et exportez l’analyse multivariée pour extraire les informations MS de tous les ROI.

L’imagerie par spectrométrie de masse des sections de racines et de feuilles entières montre la distribution spatiale des composés sélectionnés. La couleur de chaque pixel représente l’intensité relative du rapport masse / charge, et peut donc être associée à la distribution naturelle et à l’abondance de l’ion métabolite dans tout l’échantillon. La distribution des composés cibles, la tanshinone IIA et l’acide rosmarinique, est visible dans différentes zones de la racine.

Le composé tanshinol A a été détecté dans les sections foliaires En tant que protocole visant la reproductibilité, le plus important est d’optimiser l’intensité du signal en ajustant la position du pulvérisateur en plusieurs dimensions.