Name: Optimisation du rendement en tubuline à partir de tissu cérébral porcin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Apprenez à isoler la tubuline à haut rendement à partir de tissu cérébral porcin en préservant sa dynamique naturelle. Cette méthode optimise l'étude des interactions protéiques pour la conception de médicaments.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolement efficace de la tubuline à partir du tissu neural

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
<li>Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+microtubule+protein+from+beef+brain+and+comparison+of+the+assembly+requirements+for+neuronal+microtubules+isolated+from+beef+and+hog%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog.</a> Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).</li>
<li>Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+and+associated+high+molecular+weight+proteins+from+porcine+brain+and+characterization+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro.</a> Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).</li>
<li>Weisenberg, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+formation+in+vitro+in+solutions+containing+low+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations.</a> Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).</li>
<li>Roychowdhury, S., Gaskin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+assembly-competent+tubulin+from+brain+microtubule+protein+preparations+using+a+fast-performance+liquid+chromatography+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure.</a> J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).</li>
<li>Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+depolymerization+products+of+microtubules+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain.</a> Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li>
<li>Jacobs, M., Huitorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-associated+nucleoside+diphosphokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase.</a> Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).</li>
<li>Munguía, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+native+M.+vogae+and+H.+contortus+tubulin+by+TOG+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography.</a> Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+ExpPurif%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+%CE%B1-+and+%CE%B2-tubulin+from+Echinococcus+granulosus%3A+Expression%2C+purification+and+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization.</a> Parasite. 25, 62(2018).</li>
<li>Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+affinity+tag-free+recombinant+tubulin+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells.</a> STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22JVisExp%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> JVisExp. (165), e61826(2020).</li>
<li>Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+tubulin+from+nonneural+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolating tubulin from nonneural sources.</a> Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).</li>
<li>Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+stability+of+posttranslationally+modified+brain+microtubules+isolated+from+cold-temperate+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish.</a> Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).</li>
<li>Fourest-Lieuvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+limited+volumes+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Exp+Purif%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells.</a> Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).</li>
<li>MacRae, T. H., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+assembly+in+vitro+of+tubulin+from+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei.</a> Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).</li>
<li>Lazar, I. GelAnalyzer 19.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.gelanalyzer.com">www.gelanalyzer.com</a> (2024).</li>
<li>Jansen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+microtubule-associated+protein+2c+%28MAP2c%29+phosphorylation+and+regulatory+protein+14-3-3%CE%B6-binding+sites+reveals+key+differences+between+MAP2c+and+its+homolog+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22JBiol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau.</a> JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+microtubule+associated+proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences.</a> Biomolecules. 9 (3), E105(2019).</li>
<li>Herzog, W., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+brain+microtubule-associated+proteins%3A+Isolation+of+two+different+proteins+which+stimulate+tubulin+polymerization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro.</a> Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).</li>
<li>Castle, A. G., Crawford, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tubulin+from+pig+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of tubulin from pig platelets.</a> FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).</li>
<li>Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+post-translational+modifications+and+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics.</a> Int J Mol Sci. 18 (10), E2207(2017).</li>
<li>Lafanechère, L., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+tubulin+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">The third tubulin pool.</a> Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).</li>
<li>Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+from+bovine+brain+and+its+interaction+with+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides.</a> J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).</li>
<li>Mahaddalkar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigations+into+the+binding+mode+of+a+novel+noscapine+analogue%2C+9-%284-vinylphenyl%29+noscapine%2C+with+tubulin+by+biochemical+analyses+and+molecular+dynamic+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations.</a> J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+6-Aryl-2-benzoyl-pyridines+as+tubulin+polymerization+inhibitors+with+potent+antiproliferative+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties.</a> J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).</li>
<li>Yao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferulin+C+triggers+potent+PAK1+and+p21-mediated+anti-tumor+effects+in+breast+cancer+by+inhibiting+Tubulin+polymerization+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo.</a> Pharmacol Res. 152, 104605(2020).</li>
<li>Sweetnam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor+binding+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22JNat+Prod%22%5BJournal%5D)">The role of receptor binding in drug discovery.</a> JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).</li>
<li>Qi, Z. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+1-%28benzofuran-3-yl%29-4-%283%2C4%2C5-trimethoxyphenyl%29-1H-1%2C2%2C3-triazole+derivatives+as+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorg Chem. 94, 103392(2020).</li>
<li>Sáez-Calvo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triazolopyrimidines+are+microtubule-stabilizing+agents+that+bind+the+vinca+inhibitor+site+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin.</a> Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).</li>
<li>Bellocq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+assembly-competent+tubulin+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EurJ+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae.</a> EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubes de 1,5 mL</td><td>------</td><td></td><td>Matériau commun Tubes</td></tr> de <tr><td>10 mL</td><td>---</td><td>---</td><td>Matériau commun</td></tr><tr><td>Tubes de 50 mL</td><td>------</td><td></td><td>Matériau commun</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de verre Dounce</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>Homogénéisateur</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td></td><td>Éthanol PENTA</td><td>70390-11001</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Béchers gradués</td><td>---</td><td>---</td><td>Equipement commun</td></tr><tr><td>Cylindres gradués</td><td>---</td><td>---</td><td>Equipement commun</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td> Très <td>haute qualité</td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Boîte izolée pour le transport de tissus</td><td>---</td><td>---</td><td>Equipement commun</td></tr><tr><td>Mixeur de cuisine</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>Récipient en verre ou en plastique</td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>---</td><td>---</td><td>Matériau commun</td></tr><tr><td>MES&nbsp ;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERCK</td><td>814733&nbsp ;</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>Beckman Coulter&nbsp ;</td><td>A94469</td><td>Ultracentrifugeuse</td></tr><tr><td>Colonne phosphocellulose</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>Colonne vide</td></tr><tr><td>Résine phosphocellulosique</td><td>Creative - Biomart, inc</td><td>Phosphate-001C</td><td>Résine échangeuse d’ions</td></tr><tr><td>TUYAUX</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>Qualité analytique</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>PENTA</td><td>24970-31000</td><td>Balance analytique</td></tr><tr><td>---</td><td></td><td>--- </td><td>Equipement commun</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>---</td><td>---</td><td>Equipement commun</td></tr><tr><td>Cuillères&nbsp ;</td><td>---</td><td>---</td>Rotor Ti45 <td>en plastique ou en verre</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter&nbsp ;</td><td>339160</td><td>Rotor pour ultracentrifugeuse</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>---</td><td>---</td><td>Equipement courant</td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basic</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>Distributeur de laboratoire</td></tr><tr><td>Bain-marie 37 &deg ; C</td><td>---</td><td>---</td><td>Agité</td></tr></tbody></table>

optimisation du rendement en tubuline à partir de tissu cérébral porcin

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

Au cours des étapes de séparation et de purification, des échantillons pour l’électrophorèse SDS-PAGE ont été prélevés, puis analysés à l’aide de la coloration au bleu de Coomessie (figure 2). 20 μL de chaque échantillon ont été mélangés avec 10 μL de tampon d’échantillon Laemmli (188 mM Tris-HCl pH 6,8, 3 % SDS (p/p), 30 % de glycérol (v/v), 0,01 bleu de bromophénol (p/p), 15 % β-mercaptoéthanol) et incubés à 95 °C pendant 15 min. 4 μL de chaque échantillon ont été chargés sur un gel SDS d’acrylamide à 12,5 % et séparés sous un courant constant de 30 mA par gel dans des conditions réductrices et dénaturantes.
Les résultats ont confirmé une augmentation progressive de la concentration relative de tubuline accompagnée d’une réduction des protéines contaminantes. De plus, il n’y a pas eu de perte significative de tubuline dans le lysat clarifié lors de la première centrifugation (étape 3.2.7) par rapport à l’omission de cette étape (Figure 2A, B).
La concentration en protéines a été déterminée à l’aide de trois méthodes indépendantes : l’analyse des BCA, l’analyse des protéines Bradford et l’analyse densitométrique sur gel SDS-PAGE19 (figure 3). Le rendement global de tubuline selon la procédure décrite était de 123 mg de tubuline purifiée à partir de 250 g de tissu neural. Lors des mesures, il est nécessaire de prendre en compte que la forte concentration de DTT dans le tampon de stockage a un impact significatif sur le dosage de la BCA. Le tampon PEM et le tampon PBS, avec l’ajout de DTT, augmentent l’absorbance de fond d’environ 0,900 A595, ce qui réduit considérablement la capacité du test BCA (Figure 3A). L’effet négatif du DTT est détectable même après une dilution dix fois supérieure avec de l’eau pure (données non présentées). Le test Bradford n’a pas semblé être affecté par le tampon de stockage (figure 3B), comme l’a confirmé l’analyse densitométrique.
La pureté de la préparation de la tubuline a été vérifiée par spectrométrie de masse dans deux installations indépendantes (VRI Brno, République tchèque ; CEITEC MU Brno, République tchèque) par ionisation par électronébulisation et MALDI-TOF. Les deux analyses ont confirmé la présence de tubulines porcines alpha et bêta dans plusieurs isoformes. La pureté globale était supérieure à 97,07 % (PSM 1065), les impuretés les plus répandues provenant de la kératine d’Homo sapiens de type II (PSM 246, 2,24 % d’impuretés) qui ont été introduites très probablement lors de l’isolement de la tubuline et de la préparation de l’échantillon pour l’analyse MS/MS. D’autres impuretés composées de 322 PSM et uniquement de l’albumine sérique, de l’actine gamma et du trypsinogène provenant de Sus scrofa ont été identifiées avec une résolution peptidique (0,0069 %).
Dans des expériences ultérieures, la préservation de la capacité de polymérisation après congélation instantanée et stockage dans de l’azote liquide a été vérifiée. L’aliquote de 10 mg/mL a été retirée de l’azote liquide et décongelée lentement sur de la glace. Des échantillons de différentes concentrations (10 mg/mL, 8 mg/mL, 6 mg/mL, 4 mg/mL et 2 mg/mL) ont été préparés en diluant les aliquotes dans un tampon PEM contenant du DTT, de l’ATP et du GTP pour l’expérience d’auto-assemblage. Une série de dilutions a été incubée à 37 °C pendant 60 min, et la seconde a été incubée sur glace pendant 60 min. Les deux séries ont été centrifugées pendant 60 min à 21 000 x g et à la température correspondante (4 °C ou 37 °C). 30 μL de surnageant ont été retirés et utilisés pour SDS-PAGE. Le surnageant restant a été soigneusement retiré à l’aide d’une pipette et jeté. Les granulés ont été brièvement lavés à l’aide de 100 μM de tampon PEM, puis immédiatement retirés à l’aide d’une pipette. Par la suite, les granulés ont été remis en suspension dans 50 μL de tampon de chargement SDS concentré afin de préserver la concentration relative de granulés et de surnageant. 10 μL de tampon de chargement SDS ont été ajoutés à chaque surnageant. Tous les échantillons ont été analysés à l’aide de la méthode SDS-PAGE et de Coomassie Staining (figure 4). Le volume de chaque échantillon chargé dans SDS-PAGE a été ajusté en fonction de la concentration de départ, de sorte que la différence de précipitation due à la concentration est plus évidente. L’essai d’auto-assemblage de la tubuline dans le tampon PEM a confirmé la capacité à former des fibres de tubuline en fonction de la température.
Le test d’assemblage de la tubuline20,21 piloté par MAP2c, vérifiant la capacité de la tubuline à interagir avec d’autres protéines, a été réalisé22. Les dilutions en série de MAP2c ont été préparées en mélangeant 100 μL d’aliquotes de tubuline de 1 mg/mL avec de la MAP2c jusqu’à la concentration finale allant de 0 μM à 8 μM. Tous les échantillons ont été préparés sur glace en les diluant dans un tampon PEM fraîchement préparé avec 1 mM DTT et 1 mM GTP. La tubuline a été incubée pendant 15 min à 37 °C avec différentes concentrations de MAP2c, et centrifugée pendant 60 min à 21 000 x g et 37 °C. Le lavage final de la pastille a été effectué deux fois avec 100 μL de tampon PEM. L’expérience a confirmé la capacité de la tubuline préparée à subir une polymérisation induite par MAP2c, car seul l’échantillon sans MAP2c ne formait pas de pastille (Figure 5).
La microscopie électronique à transmission a ensuite été utilisée pour confirmer la présence de filaments de tubuline à partir d’expériences de copolymérisation. Des suspensions de tubuline purifiée précipitée avec MAP2c ont été préparées pour la microscopie électronique à transmission à l’aide d’une coloration négative. Les échantillons ont été adsorbés sur des grilles de cuivre recouvertes de Formvar et stabilisées au carbone. Les grilles ont ensuite été colorées négativement avec 2% de NH4MoO4 et examinées au microscope électronique à un grossissement de 18 000x et à une tension d’accélération de 80 kV. La présence de microtubules homogènes avec une structure filamenteuse claire et une taille appropriée a montré la capacité de former des microtubules en conformation native (Figure 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de principe de la séparation et de la purification des tubulines. Le nombre entre parenthèses fait référence à l’étape du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> Figure 2 : Séparation et purification des tubulines (A) L’analyse SDS-PAGE des échantillons prélevés lors de la séparation de la tubuline à l’aide de la polymérisation en fonction de la température (3 μL par ligne). La diminution des impuretés avec une augmentation stable de l’abondance relative de la tubuline (environ 50 kDa) est visible. Les chiffres au-dessus de chaque ligne correspondent au numéro d’étape dans le protocole. (B) L’analyse SDS-PAGE des fractions obtenues après chromatographie protéique sur résine phospho-cellulosique (4 μL par ligne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> Figure 3 : Concentration en protéines. La série de dilution de l’albumine sérique bovine allant jusqu’à 1 mg/mL dans le tampon PEM ou le PBS a été comparée à la série de dilution BSA contenant 0,1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT séparément ou en combinaison (0,1 mM ATP, 1 mM GTP et 1 mM DTT) dans le tampon PEM ou PBS. (A) Lorsque le test BCA a été utilisé, il y a eu un changement significatif dans le bruit de fond des échantillons contenant des DTT (symboles solides). (B) Cet effet n’a pas été détecté lorsque les concentrations ont été mesurées dans l’essai de Bradford. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> Figure 4 : Essai d’auto-assemblage de la tubuline. L’analyse SDS-PAGE de l’essai d’auto-assemblage a confirmé la capacité de la tubuline stockée incubée à (A) 4 °C ou (B) à 37 °C à polymériser de manière dépendante de la température dans un large spectre de concentrations. (P - pastille, S - surnageant ; la concentration respective de tubuline est indiquée au-dessus de chaque paire de lignes ; la quantité de chaque échantillon chargée était de 10 μg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> Figure 5 : Essai de cosédimentation de la tubuline. L’analyse SDS-PAGE de l’assemblage de la tubuline assistée par MAP2c a confirmé la capacité de la tubuline stockée à subir une polymérisation entraînée par l’interaction avec la protéine associée aux microtubules d’une manière dépendante de la concentration. La concentration molaire de MAP2c est indiquée au-dessus de chaque ligne. (P - pastille, S - surnageant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> Figure 6 : Microscopie électronique à transmission. Les microphotographies TEM ont montré que la tubuline s’assemble (A) en microtubules de diamètre approprié (B) constitués de filaments de tubuline homogènes décorés de protéines MAP2c. La barre correspond à 1000 nm (A) et 200 nm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Optimisation du rendement en tubuline à partir de tissu cérébral porcin

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

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La vidéo démontre l’isolement de cellules mononucléées du sang périphérique infiltrant la tumeur à partir d’un cerveau de souris en utilisant la dissociation mécanique et la digestion enzymatique. Ceci est suivi d’une centrifugation à gradient de densité pour collecter les cellules immunitaires pour une analyse plus approfondie.

Isolement de cellules immunitaires infiltrant la tumeur d’un cerveau murin

Cette vidéo montre l’isolement des capillaires à partir de cerveaux porcins frais. Le processus consiste à éliminer les méninges, à isoler la matière grise du tissu cérébral, à homogénéiser et à filtrer la matière grise pour isoler les capillaires, et enfin à utiliser la digestion enzymatique pour purifier davantage les capillaires.

Purifier les capillaires d’un cerveau porcin

Cette vidéo montre le processus d’isolement des microvaisseaux cérébraux des rats euthanasiés. Il comprend la dissection du cerveau, le nettoyage des tissus et la digestion mécanique, suivie d’une centrifugation répétée pour isoler la fraction pure des microvaisseaux.

Procédé d’isolement d’unités neurovasculaires à partir du cerveau de rat

Bien que la structure des ribosomes ait été largement caractérisée, l’organisation des polysomes est encore sous-étudiée. Pour pallier ce manque de connaissances, nous présentons ici un protocole de préparation détaillé pour l’imagerie précise des polysomes de mammifères par microscopie à force atomique (AFM) dans l’air et dans les liquides.

Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy

L’objectif du protocole est de présenter une procédure optimisée pour la création d’un modèle barrière hémato - encéphalique (BHE) in vitro basé sur les cellules endothéliales cérébrales porcines primaires (pBECs). Le modèle montre reproductibilité élevée, grande étanchéité et est adapté pour des études de transport et trafic intracellulaire en découverte de médicaments.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Nous présentons un protocole pour l'extraction des péritéytes cérébraux murines. Basé sur une extraction de périyte orientée vers l'enrichissement sans antibiotiques, ce protocole est un outil précieux pour les études in vitro offrant une pureté élevée et un rendement élevé, diminuant ainsi le nombre d'animaux expérimentaux utilisés.

Une méthode de sortie élevée pour isoler les péricartétes cérébraux de la souris

Ce protocole décrit la purification de la tubuline à partir de sources à petite ou moyenne échelle telles que les cellules de culture ou les cerveaux d’une seule souris, à l’aide de cycles de polymérisation et de dpolymérisation. La tubuline purifiée est enrichie en isotypes spécifiques ou a des modifications posttranslationnelles spécifiques et peut être utilisée dans des tests de reconstitution in vitro pour étudier la dynamique et les interactions des microtubules.

Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.

Technique quantitative de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris

Nous rapportons une technique permettant l’imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome (GBM) envahissant un tissu cérébral de vertébrés. Le couplage de l’injection orthotopique de cellules GBM marquées par fluorescence dans un cerveau de poisson-zèbre transparent avec une imagerie intravitale à haute résolution permet de mesurer la dynamique du cytosquelette lors de l’invasion in situ du cancer.

Imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome envahissant le cerveau du poisson zèbre

Apprenez à isoler la tubuline à haut rendement à partir de tissu cérébral porcin en préservant sa dynamique naturelle. Cette méthode optimise l'étude des interactions protéiques pour la conception de médicaments.

Optimisation du rendement en tubuline à partir de tissu cérébral porcin

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