Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

À l’heure actuelle, nous avons une compréhension limitée de la biologie de l’infection du foie par Plasmodium. Ce protocole nous a aidés à générer un grand nombre de lignées transgéniques qui ont permis de répondre à certaines questions critiques sur la biologie de l’organisme. Une compréhension fondamentale du parasite et de sa biologie est nécessaire pour développer de nouveaux outils et approches pour lutter contre l’infection par le paludisme.

La méthode de transgénèse que nous décrivons ici nous a aidés à déchiffrer certaines biologies clés et complexes de l’organisme ainsi que de l’hôte. Carson Bowers, mon directeur de laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Après avoir généré des souris infectées par P. Bergehei et les avoir euthanasiées, prélevez deux millilitres de sang de deux souris infectées dans cinq millilitres de solution Elsevier dans un environnement stérile.

Centrifuger le sang à 450 G pendant huit minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu RPMI complet. Centrifugez à nouveau la suspension cellulaire et remettez la pastille en suspension dans 25 millilitres de média RPMI complet.

Transférez la suspension cellulaire dans un flacon de culture T75 muni d’un bouchon filtrant et incubez en agitant doucement pour maintenir les cellules en suspension. À la fin de l’incubation, prélever 500 microlitres de l’échantillon. Centrifugez et remettez en suspension la pastille dans 10 microlitres de média RPMI complet.

Ensuite, préparez un frottis sanguin fin. Colorer le frottis sanguin avec la coloration de Giemsa et déterminer la fréquence des schizontes. Pour une efficacité optimale de la transfection, 60 à 70 % des parasites doivent être au stade schizonte.

Préparer un tampon de centrifugation à gradient en reconstituant 13 millilitres de milieu de stockage à gradient de densité dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Transférez 25 millilitres d’hémoculture dans un tube de centrifugation frais de 50 millilitres. Ensuite, superposez soigneusement 20 millilitres de tampon de centrifugation à gradient au fond du tube de centrifugation, à l’aide d’une pipette en verre étroite pour créer une colonne de gradient et assurer une division claire entre le tampon et le média.

Centrifuger le tampon et le média préparés pendant 20 minutes à 450 G sans interruption à température ambiante. À l’aide d’une pipette de pâturage, retirez délicatement la couche de schizonte à l’interface du milieu de culture et du tampon de centrifugation à gradient. Placez-le dans un nouveau tube de centrifugation de 50 millilitres.

Remettre en suspension les schizontes isolés dans un milieu RPMI complet et augmenter le volume total à 40 millilitres. Après avoir centrifugé et éliminé le surnageant, remettre le schizonte en suspension dans 10 millilitres de milieu RPMI complet. Ensuite, transférez un millilitre de cette solution dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre pour chaque transfection et granulez les cellules infectées par centrifugation à 16 000 G pendant cinq secondes.

Ensuite, combinez 100 microlitres du tampon d’électroporation à température ambiante avec cinq microgrammes d’ADN plasmidique cible dans un tube de micro-centrifugation de 1,5 millilitre. Après avoir centrifugé les cellules infectées, retirez le surnageant et remettez soigneusement les cellules en suspension dans la solution de nucléoefecteur préparée et l’ADN plasmidique. Transférez ensuite la suspension dans l’électroporation, les cuvettes et le transfect à l’aide d’un programme de nucléofecteur approprié.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de média RPMI complet dans la cuvette. Transférez toute la solution dans un micro-tube à centrifuger de 1,5 millilitre et placez-le sur de la glace. Vérifier les niveaux de parasitémie chez les souris inoculées avec le schizonte transfecté tous les jours à partir de deux jours après l’inoculation.

Une fois l’infection confirmée, commencez à choisir le médicament en l’administrant par voie orale et en buvant de l’eau ad libitum. Surveiller la parasitémie à l’aide de frottis sanguins à partir de six jours après le début du traitement à la pyrométhymine. Lorsque la parasitémie atteint au moins 1 %, transférez les parasites à des souris B6 naïves pour créer des stocks de parasites au stade sanguin.

Une fois que la parasitémie atteint 2 % à 5 %, générez des stocks et cryoconservez-les. Un jour avant l’infection par les moustiques, séparez les moustiques femelles en plaçant un gant rempli d’eau chauffée à 37 degrés Celsius sur le dessus de la cage contenant les moustiques mâles et femelles. Utilisez un aspirateur à insectes pour éliminer les moustiques femelles attirées par la source de chaleur et les transférer dans une cage plus petite pour l’infection.

Le jour de l’alimentation et de l’infection par les moustiques, déterminez la parasitémie chez les souris B6 infectées. La parasitémie entre 2% et 5% est optimale pour l’infection par les moustiques. Après avoir vérifié la parasitémie, transférez l’infection aux moustiques femelles en plaçant les souris anesthésiées sur les moustiques femelles en cage sous décubitus sternal.

Écartez manuellement les pattes avant et arrière pour fournir la plus grande surface pour l’alimentation des moustiques. Laissez les souris infectées dans chaque cage pendant 15 minutes, en vérifiant toutes les cinq minutes pour vous assurer que les souris ne sont pas réveillées. Une fois que l’alimentation est terminée et que les souris sont euthanasiées, éliminez-les en toute sécurité en suivant les directives de l’établissement.

Pour vérifier le succès de l’infection chez les moustiques, isolez les moustiques dans le milieu de l’intestin en enlevant le segment abdominal terminal avec une pince 10 jours après l’infection. Ensuite, observez l’intestin moyen sous une lumière polarisée pour détecter la présence d’oocystes. À 18 jours après l’infection, disséquez cinq à 10 moustiques pour évaluer le nombre de sporozoïtes présents.

Pour isoler et compter les sporozoïtes, retirez délicatement la tête du moustique tout en appliquant une pression sur le thorax avec une pince ou une fine aiguille à disséquer. Les glandes salivaires resteront attachées à la tête enlevée. Ensuite, retirez tous les débris de moustiques supplémentaires des glandes salivaires et placez-les dans un microtube à centrifuger contenant 400 microlitres de milieu de dissection de moustiques.

Ensuite, perturbez les glandes salivaires isolées en les faisant passer dans une seringue à aiguille de calibre 30 15 à 20 fois, Ensuite, placez 10 microlitres des glandes salivaires perturbées dans un milieu de dissection de moustique dans un hémocytomètre et comptez. Enfin, remettez les glandes salivaires en suspension à la concentration souhaitée de milieu de dissection de moustiques ou de PBS pour injection chez la souris ou cryoconservation à long terme. Comme au microscope, des images montrant des schizont de P. berghei matures et immatures dans des hémocultures de souris parasitées sont présentées.

Comme au microscope, des images d’une tête de moustique avec les glandes salivaires encore intactes pendant la dissection, et la glande salivaire disséquée sous des grossissements plus faibles et plus élevés sont montrées. La génération d’un signal de fluorescence verte dans le PB, la GFP 11 infectée par la GFP HEPA 11 a indiqué la lyse de la vacuole parasitophore. Il est important de supprimer soigneusement le calque de chaisson sans perturber l’interface de dégradé.

De plus, il faut un peu de pratique pour retirer de manière fiable les glandes salivaires ainsi que la tête pendant l’isolement de la lumière des spores. Après isolement, les sporozoïtes transgéniques peuvent être cryoconservés ou utilisés frais pour des études d’infection in vivo ou in vitro.