Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Notre recherche vise à développer des modèles hépatiques in vitro pertinents pour l’homme pour les tests d’efficacité et d’innocuité des médicaments, imitant étroitement les tissus hépatiques sains et malades dans les études précliniques. La reproduction de la complexité complète du foie, l’obtention d’une fonctionnalité à long terme, la normalisation des protocoles et l’expansion de la production d’organoïdes pour des applications à haut débit restent un défi expérimental majeur dans la recherche sur les organoïdes. Nous avons récemment modélisé la fibrose hépatique à partir d’organoïdes hépatiques sains et établi des modèles de maladies rares du foie, y compris la citrullinémie et le déficit en pyruvate carboxylase, à partir de cellules dérivées de patients. Contrairement à d’autres méthodes, notre protocole eHEPO fournit des organoïdes hépatiques fonctionnels rapidement et à grande échelle, prenant en charge une fonctionnalité à long terme et des tests multiples à partir d’une population de départ cohérente.

[Narrateur] Pour commencer, ajoutez 6 millilitres de DMEM/F-12 froid dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez immédiatement 80 microlitres de matrice à membrane basale FOD ou BMM dans le tube et mélangez bien. Enduire une plaque de puits traitée pour la culture tissulaire avec la solution BMM et distribuer la solution pour couvrir la surface de la plaque de puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37° Celsius pendant au moins une heure. Prenez une cellule souche pluripotente inductible ou une plaque IPSC et aspirez le milieu spécifique de l’IPSC. Rincez la plaque avec du DMEM/F-12 ou du DPBS et ajoutez 1 millilitre de l’enzyme spécifique dans un puits d’une plaque à 6 puits. Après une minute d’incubation, aspirez l’enzyme et incubez la plaque à 37 °C pendant cinq à sept minutes. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de milieu IPSC préchauffé à la plaque et tapotez doucement le côté pour détacher les agrégats de colonies indifférenciés de la surface de la plaque. Mélangez délicatement la suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 5 millilitres, puis ensemencez la suspension cellulaire à la densité souhaitée dans le puits enrobé de BMM. Incuber les cellules à 37° Celsius pendant trois à cinq jours pour atteindre une confluence de 70 %. Remplacez le milieu IPSC par le milieu endodermique avant de commencer la différenciation. Les cellules acquièrent une forme hérissée après la différenciation, indiquant l’interaction cellule-cellule. Rincez les cellules de l’endoderme avec du PBS. Ajouter 300 microlitres de trypsine. Et incubez les cellules pendant cinq minutes dans l’incubateur. Ajoutez 3 millilitres de DMEM/F-12 froid dans les cellules et pipetez avec des pointes filtrantes de 1 000 microlitres pour générer des cellules uniques. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger les cellules à 300 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, lavez la pastille avec 10 millilitres de tampon FACS. Pour fabriquer une suspension à cellule unique, filtrez les cellules à l’aide d’une crépine à mailles de 100 micromètres, puis d’une crépine à mailles de 40 micromètres avant de centrifuger la suspension cellulaire pendant cinq minutes. Remettez en suspension 15 millions de cellules avec 105 microlitres de tampon FACS et ajoutez 45 microlitres de FcR et 15 microlitres d’EpCAM à la suspension. Incuber les cellules pendant 10 minutes à 4° Celsius, en protégeant le tube de la lumière. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon FACS pour laver la suspension cellulaire. Après avoir centrifugé les cellules, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon FACS et ajouter 0,5 micromolaire par millilitre de DAPI à la suspension cellulaire pour quantifier les cellules mortes. Après le tri des cellules, centrifugez les cellules à 300 x g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant. Et remettre en suspension 3 000 à 5 000 cellules dans 20 microlitres de BMM. Ensemencez les cellules en ajoutant une gouttelette de BMM au centre de chaque plaque de 48 puits, et incubez les cellules pendant deux minutes à 37° Celsius jusqu’à ce que le BMM soit solidifié. Superposez la gouttelette avec le milieu d’expansion. Pour diviser la gouttelette d’organoïde, jetez le milieu organoïde et ajoutez 500 microlitres d’Ad-DMEM/F-12 froid dans le puits. Utilisez des pointes filtrantes de 1 000 microlitres pour pipeter vigoureusement les gouttelettes BMM. Recueillez un maximum de 10 gouttelettes de BMM dans des tubes coniques de 15 millilitres et ajoutez 5 millilitres d’Ad-DMEM/F-12 froid. Placez le tube sur de la glace pendant trois à cinq minutes. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant cinq minutes à 4° Celsius et jetez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 1 millilitre de surnageant. Pipeter vigoureusement la pastille cellulaire 30 à 40 fois à l’aide d’embouts filtrants de 200 microlitres. Après dissociation mécanique, ajoutez 5 millilitres d’Ad-DMEM/F-12 froid avant de centrifuger les cellules pendant cinq minutes. Jetez le surnageant. Et placez la suspension sur de la glace. Grainez une gouttelette de 50 microlitres de BMM. Et ajoutez 25 nanogrammes par millilitre de BMP7 au milieu d’expansion. Après une culture de trois jours, remplacer le milieu par le milieu de différenciation et cultiver les cellules pendant au moins 14 jours. Une analyse d’immunocoloration a été réalisée pour valider si les organoïdes provenant des cellules EpCAM+ sont engagés dans la lignée hépatique. La présence de cellules CK19+ et HNF4ɑ+ indique que des cellules progénitrices de l’hépatoblaste et des voies biliaires sont présentes dans les organoïdes. De plus, les organoïdes exprimant des marqueurs de tissu épithélial, tels que les cellules E-CAD+ et les cellules épithéliales cubiques ou polyédriques exprimant ZO-1, indiquent la présence de jonctions serrées entre les cellules. L’immunohistochimie a révélé que les cellules E-CAD+ présentaient une structure épithéloïde polygonale, reflétant un phénotype semblable à celui des hépatocytes. Les images de microscopie électronique en transmission des eHEPO sont présentées ici. Les cercles blancs indiquent les complexes jonctionnels intercellulaires. Les flèches noires montrent la différenciation de la surface apicale. Et la flèche rouge montre une section transversale de microvillosités. L’analyse qPCR a montré que les organoïdes ont acquis des marqueurs hépatocytaires matures tels que ALB, A1AT, CYP3A4 et CYP3A7. La zone colorée en rose dans la coloration PAS indique la capacité de stockage du glycogène des organoïdes. De plus, notre analyse a montré la capacité des organoïdes à sécréter l’ALB dans les milieux de culture, à éliminer l’ammoniac des milieux de culture, l’activité enzymatique du CYP3A4 et la capacité de transport des acides biliaires.