Name: Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Découvrez le protocole de génération d'organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels en deux semaines. Cette méthode permet une expansion longue durée sans perte de différenciation pour la recherche en biologie du foie.

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<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubes à centrifuger coniques de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C bain-marie</td><td>N&uuml ; Ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C, incubateur 5 % CO2</td><td>Memmert</td><td>INCO 153</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 et micro ; m et 40 & micro ; m Crépine de cellule</td><td>Faucon</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>70 % d’éthanol</td><td>Sigma</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1AT</td><td>Abcam</td><td>AB166610</td><td>Dilution : 1/500 (IF), 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>A-83.01 (inhibiteur du TGF &bêta)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Isolab</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope adhésive</td><td>Histobond</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 avancé</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP</td><td>Abcam</td><td>AB3980</td><td>Dilution : 1/25 (IHC)</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>EMS</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>AUBE</td><td>Abcam</td><td>AB10241</td><td>Dilution : 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Farine Alexa 488 (souris)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Dilution : 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Farine Alexa 488 (Lapin)</td><td>Invitrogen</td><td>A110034</td><td>Dilution : 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Farine Alexa 594 (souris)</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>Dilution : 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Farine Alexa 594 (Lapin)&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>N° A11037</td><td>Dilution : 1/1000 (IF)</td></tr><tr><td>Kit de dosage de l’ammoniac</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK-310</td><td></td></tr><tr><td>Clourure d’ammonium</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-202936</td><td></td></tr><tr><td>Supplément B27 50x</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Moule de base</td><td>Sakura</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>100 à 18 milliards</td><td></td></tr><tr><td>Biosécurité, CLASSE II, ENCEINTE DE SÉCURITÉ</td><td>Thermo</td><td>COFFRE-FORT 2020</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes calibrées</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Cholylglycylamido-fluorescéine</td><td>Corning</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>Tampon citrate pH 6.0</td><td>Bio-optique</td><td>15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-51582</td><td>Dilution : 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>CK-19</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6278</td><td>Dilution : 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Gants de manutention cryogénique et protection oculaire</td><td>Cryokit</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Tubes cryoviaux</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>TAMPONNER</td><td>Roche</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5942</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp ;</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8426</td><td>Dilution : 1/100 (IF), 1/20 (IHC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique</td><td>Zeiss</td><td>Sigma500</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA</td><td>Fortis sciences de la vie béthyle</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’intégration Embed 812</td><td>EMS</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Éosine Y %1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>Dilution : 1/11 (FACS)</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>Forskoline (FSK)</td><td>Tocris Biosciene</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur de congélation (M. Frosty)</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de congélation</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre</td><td>Isolab</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>Glutéraldéhyde %25, grade EM</td><td>EMS</td><td>Référence 16210-1L</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Souris HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>62-6520</td><td>Dilution : 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Lapin HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>Dilution : 1/1000 (IHC)</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Gibco</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>Millipore</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4 et alpha ;</td><td>Abcam</td><td>AB55223</td><td>Dilution : 1/50 (IHC)</td></tr><tr><td>Glace et glace carbonique</td><td>fait maison</td><td>fait maison</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur (65 &deg ; C)</td><td>N&uuml ; Ve</td><td>EN 400</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>Leu15 Gastrin I humain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Référence G9145</td><td></td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>Berthold Tech</td><td>LB 960</td><td></td></tr><tr><td>Mixage principal&nbsp ;</td><td>Biosystèmes appliqués</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>Matrice matrigel, qualifiée hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Matrice matrigel, sans rouge de phénol</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Merck</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation</td><td>Axygen</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>AXIO VERT A1</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microtome</td><td>Plume</td><td>S35, C35</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>SC-05850</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture en suspension multi-puits</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>Supplément N2 100x</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Formol tamponné neutre %10</td><td>Tekkim</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>OPO</td><td>Tissu-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosages P450-Glo&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>Réf. V9001</td><td></td></tr><tr><td>Stylo à papa</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Tekkim</td><td>TK.200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration PAS</td><td>Abcam</td><td>AB150680</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Acide phosphotungustique</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>Aide à la pipette</td><td>Axygen</td><td>Motopet-1</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques varioskan flash&nbsp ;</td><td>Thermo</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>Prolonge Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>Réf. P36980</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de propylène, grade EM</td><td>EMS</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Système PCR en temps réel</td><td>Biosystèmes appliqués</td><td>7500 Rapide&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Activine A humaine recombinante</td><td>R& D</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>BMP7 humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FGF10 humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF19 humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>HGF humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la rhokinase, dichlorhydrate d’Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N° Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 1,5 mL sans RNase/DNase</td><td>Axygen</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>Embouts filtrants sans RNase/DNase</td><td>Sarstedt</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Microtome rotatif</td><td>Leica</td><td>RM 2245</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Moyen</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Milieu conditionné par Rspo1</td><td>Fait maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masque des diapositives</td><td>Bio-optique</td><td>15-MEQ001</td><td></td></tr><tr><td>Sorenson' s Tampon phosphate</td><td>EMS</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>Fileur</td><td>Thermo</td><td>MON SPIN 6</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles</td><td>Faucon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Tissu Casette</td><td>Leica</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse</td><td>Leica</td><td>GARNITURE EM2</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Lacétate d’uranylacéate</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Tourbillon</td><td>Thermo</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Protéine de fusion Surrogate-Fc</td><td>ImmunoPrécis</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td>Dilution : 1/400 (IF)</td></tr></tbody></table>

génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

Tout d’abord, des cellules de fibroblastes humains ou de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été cultivées et converties en iPSC par reprogrammation épisomale. Le sérum frais était essentiel pour obtenir des iPSC saines. Ensuite, les iPSC ont été ensemencés dans les plaques de culture recouvertes de BMM avec une confluence de 50 à 60 %. Le fait d’avoir des colonies d’iPSC de taille petite à moyenne a amélioré l’efficacité de la différenciation. Ensuite, les iPSC ont été différenciées en endoder...

Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Organoid technology has allowed us to generate a variety of human organ-like mini structures, such as for the liver, brain, and intestine, in vitro. The ...

Notre recherche vise à développer des modèles hépatiques in vitro pertinents pour l’homme pour les tests d’efficacité et d’innocuité des médicaments, imitant étroitement les tissus hépatiques sains et malades dans les études précliniques. La reproduction de la complexité complète du foie, l’obtention d’une fonctionnalité à long terme, la normalisation des protocoles et l’expansion de la production d’organoïdes pour des applications à haut débit restent un défi expérimental majeur dans la recherche sur les organoïdes. Nous avons récemment modélisé la fibrose hépatique à partir d’organoïdes hépatiques sains et établi des modèles de maladies rares du foie, y compris la citrullinémie et le déficit en pyruvate carboxylase, à partir de cellules dérivées de patients. Contrairement à d’autres méthodes, notre protocole eHEPO fournit des organoïdes hépatiques fonctionnels rapidement et à grande échelle, prenant en charge une fonctionnalité à long terme et des tests multiples à partir d’une population de départ cohérente.[Narrateur] Pour commencer, ajoutez 6 millilitres de DMEM/F-12 froid dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez immédiatement 80 microlitres de matrice à membrane basale FOD ou BMM dans le tube et mélangez bien. Enduire une plaque de puits traitée pour la culture tissulaire avec la solution BMM et distribuer la solution pour couvrir la surface de la plaque de puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37° Celsius pendant au moins une heure. Prenez une cellule souche pluripotente inductible ou une plaque IPSC et aspirez le milieu spécifique de l’IPSC. Rincez la plaque avec du DMEM/F-12 ou du DPBS et ajoutez 1 millilitre de l’enzyme spécifique dans un puits d’une plaque à 6 puits. Après une minute d’incubation, aspirez l’enzyme et incubez la plaque à 37 °C pendant cinq à sept minutes. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de milieu IPSC préchauffé à la plaque et tapotez doucement le côté pour détacher les agrégats de colonies indifférenciés de la surface de la plaque. Mélangez délicatement la suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 5 millilitres, puis ensemencez la suspension cellulaire à la densité souhaitée dans le puits enrobé de BMM. Incuber les cellules à 37° Celsius pendant trois à cinq jours pour atteindre une confluence de 70 %. Remplacez le milieu IPSC par le milieu endodermique avant de commencer la différenciation. Les cellules acquièrent une forme hérissée après la différenciation, indiquant l’interaction cellule-cellule. Rincez les cellules de l’endoderme avec du PBS. Ajouter 300 microlitres de trypsine. Et incubez les cellules pendant cinq minutes dans l’incubateur. Ajoutez 3 millilitres de DMEM/F-12 froid dans les cellules et pipetez avec des pointes filtrantes de 1 000 microlitres pour générer des cellules uniques. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger les cellules à 300 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, lavez la pastille avec 10 millilitres de tampon FACS. Pour fabriquer une suspension à cellule unique, filtrez les cellules à l’aide d’une crépine à mailles de 100 micromètres, puis d’une crépine à mailles de 40 micromètres avant de centrifuger la suspension cellulaire pendant cinq minutes. Remettez en suspension 15 millions de cellules avec 105 microlitres de tampon FACS et ajoutez 45 microlitres de FcR et 15 microlitres d’EpCAM à la suspension. Incuber les cellules pendant 10 minutes à 4° Celsius, en protégeant le tube de la lumière. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon FACS pour laver la suspension cellulaire. Après avoir centrifugé les cellules, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon FACS et ajouter 0,5 micromolaire par millilitre de DAPI à la suspension cellulaire pour quantifier les cellules mortes. Après le tri des cellules, centrifugez les cellules à 300 x g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant. Et remettre en suspension 3 000 à 5 000 cellules dans 20 microlitres de BMM. Ensemencez les cellules en ajoutant une gouttelette de BMM au centre de chaque plaque de 48 puits, et incubez les cellules pendant deux minutes à 37° Celsius jusqu’à ce que le BMM soit solidifié. Superposez la gouttelette avec le milieu d’expansion. Pour diviser la gouttelette d’organoïde, jetez le milieu organoïde et ajoutez 500 microlitres d’Ad-DMEM/F-12 froid dans le puits. Utilisez des pointes filtrantes de 1 000 microlitres pour pipeter vigoureusement les gouttelettes BMM. Recueillez un maximum de 10 gouttelettes de BMM dans des tubes coniques de 15 millilitres et ajoutez 5 millilitres d’Ad-DMEM/F-12 froid. Placez le tube sur de la glace pendant trois à cinq minutes. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant cinq minutes à 4° Celsius et jetez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 1 millilitre de surnageant. Pipeter vigoureusement la pastille cellulaire 30 à 40 fois à l’aide d’embouts filtrants de 200 microlitres. Après dissociation mécanique, ajoutez 5 millilitres d’Ad-DMEM/F-12 froid avant de centrifuger les cellules pendant cinq minutes. Jetez le surnageant. Et placez la suspension sur de la glace. Grainez une gouttelette de 50 microlitres de BMM. Et ajoutez 25 nanogrammes par millilitre de BMP7 au milieu d’expansion. Après une culture de trois jours, remplacer le milieu par le milieu de différenciation et cultiver les cellules pendant au moins 14 jours. Une analyse d’immunocoloration a été réalisée pour valider si les organoïdes provenant des cellules EpCAM+ sont engagés dans la lignée hépatique. La présence de cellules CK19+ et HNF4ɑ+ indique que des cellules progénitrices de l’hépatoblaste et des voies biliaires sont présentes dans les organoïdes. De plus, les organoïdes exprimant des marqueurs de tissu épithélial, tels que les cellules E-CAD+ et les cellules épithéliales cubiques ou polyédriques exprimant ZO-1, indiquent la présence de jonctions serrées entre les cellules. L’immunohistochimie a révélé que les cellules E-CAD+ présentaient une structure épithéloïde polygonale, reflétant un phénotype semblable à celui des hépatocytes. Les images de microscopie électronique en transmission des eHEPO sont présentées ici. Les cercles blancs indiquent les complexes jonctionnels intercellulaires. Les flèches noires montrent la différenciation de la surface apicale. Et la flèche rouge montre une section transversale de microvillosités. L’analyse qPCR a montré que les organoïdes ont acquis des marqueurs hépatocytaires matures tels que ALB, A1AT, CYP3A4 et CYP3A7. La zone colorée en rose dans la coloration PAS indique la capacité de stockage du glycogène des organoïdes. De plus, notre analyse a montré la capacité des organoïdes à sécréter l’ALB dans les milieux de culture, à éliminer l’ammoniac des milieux de culture, l’activité enzymatique du CYP3A4 et la capacité de transport des acides biliaires.

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