Génération de souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système combiné d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé
24 mars 2023
Dans ce protocole, nous décrivons les procédures techniques pour générer des souris knockout spécifiques au tissu adipeux brun (MTD) en utilisant un système combiné d’ARN monoguide (ARNg) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé (AAV). Les étapes décrites comprennent la conception des ARNg, la préparation des particules AAV-sgRNA et la microinjection d’AAV dans les lobes BAT.
Ce protocole génère des souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé. Il comprend une technique chirurgicale pour administrer en toute sécurité AAV dans la graisse brune. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut rapidement générer des knockouts spécifiques aux tissus sans avoir besoin d’élever des souris de manière sélective.
L’approche de fabrication de knock-out ou de knockdowns spécifiques aux tissus peut être adaptée à d’autres tissus si la procédure chirurgicale d’injection d’AAV est modifiée en fonction de l’organe cible. Pour commencer, administrer l’analgésique par voie sous-cutanée à la souris UCP1 Cre Cas9 anesthésiée afin de minimiser et de prévenir la douleur et la détresse postopératoires. Ensuite, rasez la fourrure sur sa zone interscapulaire à l’aide d’un rasoir et stérilisez la zone chirurgicale avec au moins trois tours alternés d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine, suivi d’éthanol à 70%.
À l’aide d’un scalpel, faites une incision de deux centimètres dans la peau au-dessus du tissu adipeux brun entre les omoplates pour exposer la graisse interscapulaire. Après avoir fait une seule incision, coupez les tissus adipeux à la frontière entre la région distale des tissus adipeux et des muscles. Ensuite, à l’aide des ciseaux chirurgicaux dans la main dominante, décollez les tissus adipeux brusquement et verticalement pour exposer le tissu adipeux brun tout en pinçant les tissus adipeux, y compris le tissu adipeux brun, avec la main non dominante.
Utilisez la veine de Sulzer comme point de repère pour indiquer l’emplacement précis du tissu adipeux brun. Ensuite, pour chaque souris, injectez lentement 20 microlitres de virus adéno-associé ou AAV dans chaque lobe des deux tissus adipeux bruns à l’aide d’une aiguille tranchante de calibre 32 reliée à une seringue Hamilton de 100 microlitres. Confirmer la réussite de l’injection indiquée par l’absence de fuites du site d’injection pendant l’administration d’AAV.
Après avoir assuré l’homéostasie, replacez les tissus adipeux exposés dans leur position normale pour suturer le bord des tissus adipeux et du muscle à l’aide d’un fil monofilament résorbable 5-0. Enfin, suturer la peau ouverte avec des fils tressés VICRYL non teints 5-0. L’emplacement précis du tissu adipeux brun ne peut être identifié sans l’exposer, mais une exposition excessive endommage le tissu.
Les défauts potentiels qui peuvent avoir conduit à des injections infructueuses comprenaient l’injection de la solution AAV dans la mauvaise région, la pénétration de l’aiguille à travers le tissu et le gonflement tissulaire dû à un volume excessif de la solution AAV. L’administration précise de l’ARN guide unique AAV au tissu adipeux brun a été cruciale pour le succès du protocole. La clé du succès lors de l’exposition du tissu adipeux brun est la technique de ciseaux chirurgicaux, y compris la direction et la profondeur des ciseaux, et l’emplacement de la seringue Hamilton.
Cette technique a un tissu générateur de charge spécifique aux animaux knockout pour comprendre les régulateurs moléculaires du métabolisme énergétique lié à la graisse brune.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour générer des souris présentant une invalidation spécifique du tissu adipeux brun (BAT) en combinant les techniques Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et l'ARN guide simple véhiculé par un virus adéno-associé (AAV). Grâce à ces méthodes, les chercheurs peuvent rapidement créer des invalidations spécifiques à un tissu sans avoir recours à un croisement sélectif.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Génétique
- Biologie cellulaire
- Biologie moléculaire
Contexte
- Le tissu adipeux brun joue un rôle essentiel dans le métabolisme énergétique.
- La création de knockouts spécifiques aux tissus aide à comprendre les processus biologiques.
- Cette méthode pourrait potentiellement être adaptée à d'autres tissus.
Méthodes utilisées
- Application des approches Cre-LoxP et CRISPR-Cas9.
- Modèle murin utilisé : souris UCP1 Cre Cas9.
- Administration d'AAV-sgRNA par microinjection chirurgicale.
Résultats principaux
- Ciblage et invalidation réussis du tissu adipeux brun.
- Efficacité démontrée des AAV dans l'édition génique spécifique aux tissus.
- Techniques chirurgicales clés validées pour une administration précise.
Conclusions
- L'étude présente une technique rapide permettant de générer des modèles d'extinction pertinents pour le métabolisme des graisses brunes.
- Elle améliore la compréhension des régulateurs moléculaires du métabolisme énergétique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La génération rapide de souris knock-out spécifiques au tissu adipeux brun (BAT) à l'aide de technologies combinées Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et AAV-sgRNA permet d'accélérer la génomique fonctionnelle dans la recherche métabolique. Cette approche simplifie la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques pour les gènes impliqués dans la régulation de l'énergie, réduisant ainsi les délais par rapport à l'élevage traditionnel. La méthode soutient les décisions stratégiques en fournissant des informations spécifiques aux tissus, essentielles pour la découverte précoce et la continuité translationnelle.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une interrogation directe de la fonction des gènes dans le tissu adipeux brun pour une meilleure clarté mécanistique.
- Facilite la détection biologique des risques en isolant les effets des gènes dans un tissu pertinent pour la maladie.
- Renforce la confiance prédictive dans le choix des cibles pour les troubles métaboliques.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des modèles d'invalidation génétique validés pour le criblage phénotypique en aval.
- Standardise les fonds génétiques afin d'obtenir des mesures quantitatives reproductibles.
- Accélère le développement des tests en évitant les cycles d'élevage longs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles précliniques avec les mécanismes des maladies métaboliques humaines grâce à l'édition génique spécifique au tissu adipeux brun (BAT).
- Permet une progression ajustée au risque en précisant la contribution des gènes au métabolisme énergétique.
- Assure la continuité de la découverte à la validation préclinique dans la recherche métabolique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre aux stades précoces de la découverte et de la validation de cibles, offrant un pont vers le développement de modèles précliniques pour les portefeuilles de recherche en métabolisme et en endocrinologie.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans la régulation énergétique médiée par le tissu adipeux brun.
- Criblage : Fournit des modèles reproductibles d'invalidation génique pour des tests phénotypiques quantitatifs.
- Analytique : Permet de mesurer les effets spécifiques aux gènes sur les paramètres métaboliques in vivo.
- Recherche translationnelle : Facilite l'harmonisation des modèles précliniques avec la biologie du tissu adipeux brun humain.
- Réutilisation en entreprise : Protocole adaptable à d'autres tissus par modification de la livraison des vecteurs viraux adéno-associés, offrant une utilité élargie pour la recherche et le développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Simplifie la génération de modèles grâce à des procédures standardisées et reproductibles.
- Valeur stratégique : Permet des décisions plus rapides d'aller/arrêt et une allocation efficace des ressources en capital.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles métaboliques et endocriniennes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microinjection chirurgicale et en localisation anatomique du tissu adipeux brun (BAT).
- Requiert un accès à une infrastructure de production de virus adéno-associés (AAV) et d'ingénierie génétique CRISPR-Cas9.
- Exige une standardisation rigoureuse entre les équipes pour assurer la reproductibilité.
- Une adaptation du protocole est nécessaire pour cibler d'autres tissus ou organes.
- Le succès dépend d'une livraison précise des AAV et de la minimisation des lésions tissulaires.
